色谱  2016, Vol. 34 Issue (8): 757-761   PDF    
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张宁
张园
张维冰
超高效液相色谱-串联质谱法鉴定与分析乙醛诱导脱氧核糖核苷酸加合物
张宁, 张园, 张维冰     
华东理工大学化学与分子工程学院, 上海市功能性材料化学重点实验室, 上海 200237
收稿日期：2016-05-26
基金项目：国家自然科学基金项目（21125523）；国家环保部环保公益专项（201309045）
通讯联系人： Tel:(021)64252145,E-mail:weibingzhang@ecust.edu.cn
摘要：采用超高效液相色谱-串联质谱法对两种非对映异构体（6S，8S）1，N2-丙基-2'-脱氧鸟苷（ProdG）和（6R，8R）ProdG加合物进行鉴定与分析。通过色谱保留时间及质谱碎裂方式分析，证明乙醛与2'-脱氧鸟苷（dG）反应可形成ProdG加合物。体外实验表明，乙醛能够诱导脱氧核糖核苷酸（DNA）形成ProdG加合物，并且（6R，8R）ProdG的生成量大于（6S，8S）ProdG的生成量。细胞实验结果显示，乙醛暴露能显著提高人肺胚成纤维细胞（MRC5）基因组DNA中ProdG加合物的水平，且ProdG加合物的水平与乙醛的暴露浓度呈正相关。此外，100 μ mol/L的乙醛暴露使（6R，8R）ProdG的含量从（6.4±0.3） 个/108个碱基增加到（127.2±2.7） 个/108个碱基，上调程度大于（6S，8S）ProdG（从（6.5±0.3） 个/108个碱基增加到（115.3±2.5） 个/108个碱基）。该工作为乙醛暴露所引起的DNA加合物水平上升提供了实验依据。
关键词： 超高效液相色谱-串联质谱     1,N2-丙基-2'-脱氧鸟苷加合物     乙醛     诱导    
Identification and analysis of acetaldehyde induced deoxyribonucleic acid adducts by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
ZHANG Ning, ZHANG Yuan, ZHANG Weibing     
Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, School of Chemistry & Molecular Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
Received: 2016-05-26
Foundation Item: Natural Science Foundation of China (No. 21125523); Environmental Public Welfare Project, Ministry of Environmental Protection of China (No. 201309045)
* Corresponding author. Tel:(021)64252145,E-mail:weibingzhang@ecust.edu.cn
Abstract: Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was used for the identification and analysis of the two diastereomers of adducts ((6S, 8S)1, N2-propano-2'-deoxyguanosine (ProdG) and (6R, 8R)ProdG). By contrasting the chromatographic retention time and mass spectrographic fragmentation patterns with ProdG standard, it was proved that ProdG addcuts can be formed from the reaction of 2'-deoxyguanosine (dG) with acetaldehyde. Vitro experiments showed that ProdG adducts can be formed in double stranded deoxyribonucleic acid (DNA) by the induction of acetaldehyde, and the formation of (6R, 8R)ProdG was higher than that of (6S, 8S)ProdG. In cell experiments, acetaldehyde exposure can significantly increase the levels of ProdG adducts in genomic DNA of human embryonic lung fibroblast MRC5 cells, and the enhancement of ProdG was positively correlated with the concentration of acetaldehyde. In addition, the up-regulation of (6R, 8R)ProdG was from 6.4±0.3 to 127.2±2.7 adducts per 108 nucleotides, higher than that of (6S, 8S)ProdG from 6.5±0.3 to 115.3±2.5 adducts per 108 nucleotides by acetaldehyde exposure at 100 μ mol/L. This work provides an experimental basis for the up-regulation of DNA adducts induced by acetaldehyde exposure.
Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     1,N2-propano-2'-deoxyguanosine (ProdG) adducts     acetaldehyde     induction    

乙醛是具有遗传毒性的醛类化合物,普遍存在于香烟烟气、汽车尾气和工业废气等环境污染物中[1-3],同时,乙醛可以通过乙醇代谢和脂质过氧化等内源性途径生成[4-5]。一分子乙醛能够与脱氧核糖核苷酸(DNA)中的一分子2′-脱氧鸟苷(dG)反应形成N2-亚乙基-2′-脱氧鸟苷(EtidG),随后一分子EtidG与另一分子乙醛可以继续反应,形成具有(6S,8S)和(6R,8R)两种非对映体的1,N2-丙基-2′-脱氧鸟苷(ProdG),该加合物同时也是dG与巴豆醛(丁烯醛)反应的主要产物[6],反应过程见图 1。ProdG通过引起G→T转变而导致DNA的编码错误,从而抑制DNA的合成[7]。因此,对ProdG加合物的检测在研究乙醛的诱变性和致癌性中具有重要作用。

图 1 ProdG加合物的形成 Fig. 1 Formation of ProdG adducts

目前,用于DNA加合物检测的方法较多,有电化学传感器法[8-9]、32P后标记法[10]、免疫法[11]及色谱-质谱联用(GC-MS、LC-MS)技术[10]等。LC-MS法具有高选择性、高灵敏度、高准确性以及高重复性等优势。随着色谱-质谱联用技术的不断发展以及大型自动化分析仪器的研发,毛细管液相色谱-质谱联用、纳流液相色谱-质谱联用以及超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)在DNA加合物检测上发挥着重要作用[12]。超高效液相色谱-电喷雾离子化串联三重四极杆质谱(UPLC-ESI-MS/MS)能够从108个碱基中检测到0.01～10个DNA加合物[13]。

在本研究中,采用UPLC-ESI-MS/MS鉴定乙醛与dG、小牛胸腺DNA(ctDNA)反应过程中形成的ProdG加合物,并精确测定乙醛暴露的人肺胚成纤维细胞(MRC5)中ProdG加合物含量的变化。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

1290型超高效液相色谱仪,6410B三重四极杆质谱仪(QQQ-MS)和 6530 四极杆-飞行时间质谱仪(Q-TOF-MS)(美国安捷伦公司)。Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μ m,美国安捷伦公司)。Nanodrop2000(美国Thermo Fisher公司)用于测量DNA浓度。

(6S,8S)和(6R,8R)两种非对映体的ProdG加合物标准品及稳定同位素内标均由本课题组合成,并通过紫外分光光度计、Q-TOF-MS等验证[14-15]。UPLC所使用的甲醇为色谱纯(美国Thermo Fisher公司),超纯水由英国ELGA超纯水系统制备,其余试剂均为国产分析纯。DNA酶(核糖核酸酶Ⅰ、碱性磷酸酶和蛇毒磷酸二酯酶)与ctDNA均购自美国Sigma-Aldrich公司。MRC5细胞购自北京协和医学院细胞中心,细胞培养皿购自中国Corning公司,DMEM(dulbeccos modified eagle medium)细胞培养基和双抗(青霉素和链霉素)购自美国Hyclone公司,胎牛血清购自美国Gibco公司。乙醛购自上海阿拉丁(中国)有限公司,溶于DMEM细胞培养基中用于细胞暴露实验。Promega Wizard®基因组DNA纯化试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 色谱条件

色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱;流动相为2 mmol/L NH4HCO3水溶液(A相)和甲醇(B相);流速为0.25 mL/min;柱温为25 ℃;进样量为2 μ L。洗脱分为等度洗脱(20%B,15.0 min)和梯度洗脱,梯度洗脱程序为:0～5.0 min,5%B; 5.0～12.5 min,10%B; 12.5～18.0 min,15%B; 18.0～22.0 min,90%B; 22.0～25.0 min,5%B。

1.3 质谱条件

电喷雾离子源采用正离子模式,三重四极杆检测方式为多反应监测(MRM)模式。干燥气和雾化气均为氮气(纯度99.9% );碰撞气为高纯(99.999% )氮气。干燥气流速为9 L/min;雾化气压力为6.895 kPa (40 psi);离子源温度为300 ℃;毛细管电压为 3 500 V。各化合物的特征离子对设定如下:dG为m/z 268.1/110.0(collision-induced dissociation (CID) 5 eV); ProdG为m/z 338.1/222.1(CID 10 eV); [15N5]ProdG为m/z 343.1/227.1(CID 10 eV)。

1.4 dG及ctDNA的乙醛暴露

乙醛暴露dG:将5 mg dG与10 μ L乙醛(0.045 mmol)混合,置于37 ℃反应48 h。乙醛暴露ctDNA:准确量取1.0 mg ctDNA,溶于1.0 mL超纯水中,充分溶解,取8份并编号,每份均为100 μ L,将1号设为空白对照组,2～8号乙醛的加入量依次提高,分别为3.9、6.9、17.6、37.0、56.8、85.8和105.0 mg,使用超纯水将反应体系总体积补充为500 μ L,置于37 ℃反应48 h。

1.5 MRC5细胞的培养及乙醛暴露

将MRC5细胞接种于6 cm培养皿中,加5.0 mL含10%(体积分数)胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM细胞培养基,置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。

MRC5细胞的乙醛暴露过程:在培养基中加入终浓度为25、50和100 μ mol/L 的乙醛,对照组细胞加入同体积不含乙醛的DMEM细胞培养基,暴露时间为24 h。

1.6 MRC5细胞基因组DNA提取与酶解

采用Promega Wizard®基因组DNA纯化试剂盒提取MRC5细胞的基因组DNA。将提取的基因组DNA溶解于50 μ L超纯水中,并使用Nanodrop2000测定DNA的浓度。

酶解过程:取5.0 μ g DNA,分别加入终浓度为1.0 nmol/L 的[15N5](6S,8S)ProdG和[15N5](6R,8R)ProdG,然后加入2.5 U核糖核酸酶Ⅰ、1.5 U碱性磷酸酶和0.1 mg蛇毒磷酸二酯酶,混合均匀后,于37 ℃酶解12 h。酶解缓冲液为10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6),酶解样品终体积均为50 μ L。

乙醛暴露的ctDNA酶解过程中不加入稳定同位素内标,其他条件同上。

酶解反应结束后,将DNA酶解液转移到超滤离心管(截留相对分子质量为3 000),在 12 000 r/min 的转速下离心30 min以除去溶液中的DNA酶。最后将超滤离心后的滤液转移至进样瓶,进行UPLC-MS/MS分析。

2 结果与讨论
2.1 UPLC-MS/MS条件的优化与方法验证

采用之前工作中建立的UPLC-MS/MS方法[14],该方法的线性范围、检出限与回收率等均被验证。本研究中同时使用两种洗脱条件(见1.2节)。等度洗脱用于乙醛暴露dG及ctDNA样品的分析;梯度洗脱用于乙醛暴露MRC5细胞基因组DNA的分析。

2.2 乙醛与dG反应产物中ProdG加合物的鉴定

两分子乙醛能与一分子dG连续反应,形成ProdG加合物。为了验证乙醛诱导dG反应过程中ProdG加合物的生成,先使用乙醛对dG进行暴露,后采用Q-TOF高分辨质谱对反应产物进行鉴定。

图 2和图 3分别为ProdG加合物正离子模式下的提取离子色谱图(EIC)及质谱图。乙醛与dG反应过程中产生2个丰度较高、理论相对分子质量为 338.145 9 的反应产物,保留时间分别为3.1和3.7 min,分别与(6S,8S)和(6R,8R)ProdG标准品的保留时间重合。此外,两种产物的质谱碎裂方式也与ProdG标准品一致,[M+H]+(m/z 338.145 9 )为ProdG的分子离子,[B+H]+ (m/z 222.097 4 )为ProdG脱去一分子脱氧核糖基团形成的碎片离子。以上证明ProdG加合物是乙醛诱导dG形成的加合产物。

图 2 (a)乙醛与dG的反应产物和(b)(6S,8S)和(6R,8R)ProdG标准品的提取离子色谱图 Fig. 2 Extracted ion chromatograms (EICs) of (a) the products from acetaldehyde and dG and (b) the standards of (6S,8S) and (6R,8R)ProdG
图 3 乙醛与dG的反应产物质谱图 Fig. 3 Mass spectrum of the products from acetaldehyde and dG [B+H]+corresponds to the molecular ion by losing a molecule of ribose group.
2.3 乙醛暴露的ctDNA中ProdG加合物的鉴定与分析

单独核苷酸分子形式的dG碱基上的氨基基团能很容易与乙醛发生反应形成dG加合物。然而在双链DNA中,dG以碱基互补配对的形式存在,为了进一步验证乙醛诱导双链DNA形成加合物,本试验使用乙醛对ctDNA进行暴露,并考察了一定梯度浓度的乙醛诱导ctDNA产生ProdG加合物的含量变化。

ProdG加合物的鉴定方式同2.2节。如图 4所示,对照组(图 4a)没有检测到ProdG加合物,随着乙醛暴露浓度的提高,两种非对映异构ProdG的加合物EIC的峰高、峰面积均逐渐增大,并且(6R,8R)ProdG加合物峰面积的增加程度随着乙醛浓度的提高逐渐大于(6S,8S)ProdG加合物。表明乙醛在诱导双链DNA形成ProdG加合物的过程中,两种非对映异构体的产生量不完全相同,(6R,8R)ProdG的生成量高于(6S,8S)ProdG的生成量。

图 4 乙醛暴露ctDNA中ProdG加合物的提取离子色谱图 Fig. 4 EICs of the ProdG adducts from acetaldehyde and ctDNA Concentrations of acetaldehyde: a. 0 mol/L; b. 0.175 mol/L; c. 0.310 mol/L; d. 0.791 mol/L; e. 1.663 mol/L; f. 2.553 mol/L; g. 3.857 mol/L; h. 4.720 mol/L.

乙醛浓度与ctDNA中ProdG加合物含量的关系如图 5所示。两种非对映异构体的生成量(峰面积)与乙醛的浓度均显示出良好的线性关系,R2分别为 0.984 9(6S,8S)和 0.983 4(6R,8R)。(6R,8R)含量与乙醛浓度线性关系的斜率为1.96,大于(6S,8S)与乙醛浓度线性关系的斜率(1.44),进一步说明了在乙醛暴露ctDNA过程中(6R,8R)ProdG加合物的产生量大于(6S,8S)ProdG加合物的产生量。

图 5 ctDNA中ProdG加合物含量与乙醛浓度的关系 Fig. 5 Correlation between the contents of ProdG adducts and the concentrations of acetaldehyde in ctDNA
2.4 乙醛暴露的MRC5细胞中ProdG加合物的检测与分析

以上试验证明,乙醛能够与双链DNA中的dG发生反应,形成ProdG加合物,并且诱导产生(6R,8R)ProdG加合物的量大于(6S,8S)ProdG加合物。为进一步验证以上结论,考察了乙醛暴露对活细胞内ProdG加合物含量的影响,分别使用25、50和100 μ mol/L 乙醛对MRC5细胞进行暴露,检测MRC5基因组DNA中ProdG加合物含量变化与乙醛浓度的关系,每个浓度设3个平行样。

与ctDNA相比,细胞是更加复杂的生物体系,细胞内的蛋白质以及小分子都将影响ProdG加合物的形成。在乙醛暴露细胞的过程中,能够与基因组DNA发生反应的乙醛远低于乙醛的加入量；同时,细胞内存在修复DNA加合物的修复系统[16-18],因此,ProdG加合物的含量同时受到内、外源因素的共同影响。

使用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QQQ-MS)准确测定乙醛暴露的MRC5细胞中ProdG加合物的含量。在未经任何暴露的MRC5细胞中,(6S,8S)ProdG和(6R,8R)ProdG加合物的含量接近,分别(为6.4±0.3)和(6.5±0.3) 个/108个碱基,其来源为细胞代谢过程中的内源性产物。

如图 6所示,经过24 h乙醛暴露之后,ProdG加合物的水平显著上升,并且乙醛浓度越高,诱导产生ProdG加合物的量越多。此外,100 μ mol/L 乙醛暴露使(6R,8R)ProdG含量增加到(127.2±2.7) 个/108个碱基,高于(6S,8S)ProdG的(115.3±2.5) 个/108个碱基,这一现象与乙醛暴露ctDNA的结果相一致。结果见表 1。

图 6 乙醛暴露的MRC5细胞中ProdG加合物水平(n=3) Fig. 6 Levels of ProdG adducts in acetaldehyde exposed MRC5 cells (n=3)
表 1 乙醛暴露的MRC5细胞中ProdG加合物含量(个/108个碱基)(n=3) Table 1 Contents of ProdG adducts in acetaldehyde exposed MRC5 cells (per 108 nucleotides) (n=3)
3 结论

本研究采用UPLC-MS/MS法对乙醛诱导dG形成的ProdG加合物进行鉴定与分析。鉴定了两种非对映异构体(6S,8S)ProdG和(6R,8R)ProdG加合物为乙醛诱导dG形成的加合产物;同时发现乙醛能够诱导双链DNA形成ProdG加合物以及上调活细胞基因组DNA中ProdG加合物的含量,并且诱导产生(6R,8R)ProdG的量大于(6S,8S)ProdG的量。

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