色谱  2016, Vol. 34 Issue (8): 745-751   PDF    
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高小迪
张维冰
聚烯丙基氯点击反应接合葡萄糖纳米磁球的制备与糖肽富集
高小迪, 张维冰     
上海市功能性材料化学重点实验室, 华东理工大学化学与分子工程学院, 上海 200237
收稿日期：2016-05-28
基金项目：国家自然科学基金项目（21235005）；国家重大科学仪器设备开发专项（2012YQ120044）
通讯联系人： Tel:(021)64252145,E-mail:weibingzhang@ecust.edu.cn.
摘要：糖蛋白及与蛋白质结合的糖链在生物体内的丰度一般极低，为实现其准确定性及定量，去除高丰度非糖蛋白、非糖肽的干扰，通常需要进行富集前处理操作。该文设计并制备了一种基于点击化学反应和烯丙基氯多功能化位点聚合物的葡萄糖改性核-壳-壳型磁性纳米颗粒，并建立了相应的用于糖肽亲水富集的固相微萃取方法。以人免疫球蛋白G酶解液为样品，共测得32个糖肽信号。该方法检出限可达10 fmol，每克磁性分离介质的富集容量达100 mg。
关键词： 点击反应     磁性纳米富集材料     糖肽     人血清免疫球蛋白G    
Preparation and glycopeptide enrichment application of magnetic nanoparticles functionized by poly- (allyl chloride)-glucose based on click reaction
GAO Xiaodi, ZHANG Weibing     
Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, School of Chemistry & Molecular Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
Received: 2016-05-28
Foundation Item: Natural Science Foundation of China (No. 21235005); National Major Scientific Instruments and Equipment Development Projects of China (No. 2012YQ120044)
* Corresponding author. Tel:(021)64252145,E-mail:weibingzhang@ecust.edu.cn.
Abstract: The abundance of glycoproteins and the glycans attached are usually low in body. In order to analyze them accurately and eliminate the interference of non-glycoproteins and non-glycopeptides, methods of enrichment are needed. A kind of novel magnetic nanoparticles based on click reaction and multiple-functional-site poly-(allyl chloride) structure is designed and prepared. The related hydrophilic enrichment method for glycopeptide is developed. Totally 32 glycopeptide signals were detected from human immunoglobulin G trypsin enzymolysis under the optimized conditions. The method can reach a limit of detection of 10 fmol on human immunoglobulin G trypsin enzymolysis, with an adsorption capacity of 100 mg of 1 g particles.
Key words: click reaction     magnetic enrichment nanomaterials     glycopeptide     human immunoglobulin G    

蛋白质的糖基化修饰作为一种最重要的翻译后修饰方式,与众多生理过程相关。作为修饰蛋白质组学研究的一个重要方向,对于糖基化修饰蛋白质的分析新技术与新方法研究具有非常重要的意义。

基于色谱/质谱技术的蛋白质糖基化分析面临着生物样品中糖肽含量低、糖基化位点不均一性强、大量非糖肽抑制和干扰糖肽质谱信号的干扰,以及质谱检测灵敏度等问题。通常的解决办法为对样品进行预分离和/或预富集。目前已发展了包括凝集素亲和色谱法[1]、苯硼酸亲和色谱法[2-4]、酰肼化学法[5]、固定钛离子亲和色谱法[6]、亲水相互作用色谱法[7]等多种方法用于选择性分离富集糖蛋白和糖肽。由于磁性纳米材料具有易于制备、能实现快速磁分离、表面可进行多种功能化修饰、生物兼容性较好等优点,其在蛋白质组学领域的应用很受重视[8-10]。本课题组已发展了多种基于磁分离技术的纳米尺度高选择性分离介质的制备以及对糖肽的分离分析方法,Xiong等[11]制备了层层自组装亲水纳米磁球及多种核壳结构纳米磁球、Chen等[12]制备了[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(MSA)-N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)-甲基丙烯酸(MAA)复合两性聚合物壳层纳米磁球,均取得了对糖肽的良好富集效果。

本文以磁性纳米颗粒为基质,在其表面原位聚合烯丙基氯,形成含有活性氯的长链结构,进一步采用点击反应将葡萄糖接合到长链上,形成刷装结构的修饰层。由于其容量大,亲水性良好,非常有利于糖肽的富集研究。

1 实验部分
1.1 实验试剂

六水合三氯化铁(FeCl3\56H2O)、无水三氯化铁(FeCl3)、乙酸钠(NaAc)、乙二醇(EG)、乙醚、烯丙基氯(AC)均为分析纯,购自天津化学试剂厂。叠氮化钠(NaN3)、人免疫球蛋白G(human Ig G,纯度95%)、抗坏血酸钠、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)和浓氨水(NH3\5H2O,质量分数25%)购自美国Sigma-Aldrich公司。二硫苏糖醇(DTT,纯度99%)、碘代乙酰胺(IAA,纯度99%)、乙腈(ACN,色谱纯)和三氟乙酸(TFA,纯度99%)购自德国Merk公司。异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃(THF)、乙醇、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等均为分析纯,购自上海凌峰化学试剂有限公司。五水硫酸铜、硅烷偶联剂(γ-MPS)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)和偶氮二异丁腈(AIBN)购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

JSM-6360LV真空扫描式电子显微镜,日本电子株式会社;Falion 60S能谱仪,EDAX公司;Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪,Thermo Nicolet公司;4800 MALDI-TOF/TOF质谱仪,AB Sciex公司。

1.3 纳米分离介质的制备

聚烯丙基氯(poly(allyl chloride),PAC)点击接合葡萄糖纳米磁球(Fe3O4@PAC-Glucose)的制备流程如图 1所示。

图 1 Fe3O4@PAC-Glucose纳米磁球的制备流程 Fig. 1 Process of preparation of Fe3O4@poly(allyl chloride)(PAC)-Glucose magnetic nanoparticles

Fe3O4纳米磁球的合成采用溶剂热法。采用蒸馏沉淀法在Fe3O4颗粒表面包覆聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物(Fe3O4@MPS):称取0.2 g Fe3O4纳米磁球,依次加入40 mL乙醇、10 mL水和1.5 mL氨水,超声震荡使体系完全混匀。之后加入0.3 g γ-MPS,在60 ℃下机械搅拌24 h。反应完毕后用水洗磁球3次,乙醇洗1次,在60 ℃下干燥过夜。

Fe3O4@PAC的制备(沉淀聚合法):称取50 mg Fe3O4@MPS,加入40 mL乙腈,超声10 min使磁球完全分散。向体系中依次加入200 μL烯丙基氯、300 μL EDMA和15 mg AIBN,油浴加热使体系在10 min内开始回流。反应1 h以后,将磁球收集转移,以乙醇清洗3次,之后在60 ℃下干燥过夜,制得Fe3O4@PAC纳米颗粒。

Fe3O4@PAC-N3的制备:向50 mL DMF中逐步加入NaN3并搅拌,直至配成饱和溶液。称取0.2 g Fe3O4@PAC加入上述饱和溶液,在80 ℃下机械搅拌24 h。反应完成后,将磁球以乙醇清洗3次,在60 ℃下干燥过夜,制得Fe3O4@PAC-N3纳米颗粒。

炔丙基葡萄糖的制备:称取2.43 g无水FeCl3(15 mmol),加入100 mL THF,超声10 min使固体溶解。之后分别加入0.9 g D-葡萄糖(5 mmol)和1.6 mL质量分数为80%的溴丙炔(15 mmol)甲苯溶液。将反应体系在10～15 ℃的水浴中机械搅拌10 min。之后在8 min内逐渐加入0.975 g锌粉(15 mmol),过程中控制温度为10～15 ℃。锌粉加入完毕后,将反应体系在室温下机械搅拌12 h。分别向反应体系中加入100 mL乙醚和50 mL水,机械搅拌10 min后抽滤去除不溶物。所得滤液用碳酸氢铵沉淀金属离子,再次抽滤。取水相保存备用。

Fe3O4@PAC-Glucose纳米颗粒的制备(点击反应):称取0.2 g Fe3O4@PAC-N3纳米颗粒,将其分散于50 mL水中。将上一步所得炔丙基葡萄糖溶液用水稀释到50 mL。二者混合后加入372 mg五水硫酸铜(1.5 mmol)和抗坏血酸钠892 mg(4.5 mmol)。将反应体系暴露在空气中,在室温下机械搅拌12 h。反应完成后取出磁球,分别用水和乙醇清洗3次,在60 ℃下干燥过夜,制得Fe3O4@PAC-Glucose纳米颗粒。

1.4 标准糖蛋白的酶解和样品的制备

称取1 mg人免疫球蛋白,溶解于1 mL 50 mmol/L碳酸氢铵溶液(pH 8.3)中,沸水中加热15 min变性;加入20 μL 1 mol/L二硫苏糖醇,60 ℃下孵育1 h;加入7.2 mg碘代乙酰胺,室温暗室中烷基化反应45 min,按酶与蛋白质的质量比为1∶25加入胰蛋白酶,37 ℃下酶解16 h。酶解结束后分装冻干,-20 ℃冰箱中保存备用。

1.5 Fe3O4@PAC-Glucose纳米颗粒对糖肽的富集

将标准糖蛋白酶解液用上样液(含88%(v/v)ACN和1%(v/v)TFA的水溶液)稀释至所需浓度,加入6 μg Fe3O4@PAC-Glucose颗粒,室温下振荡孵育20 min。磁分离,弃去上清液,用200 μL上样液清洗3次,洗去非特异吸附肽段,加入2×10 μL洗脱液(含20%(v/v)ACN和0.1%(v/v)TFA的水溶液)进行洗脱,所得洗脱液用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析。

1.6 分离介质对糖肽吸附容量的测定

称取不同质量(15～500 μg)的Fe3O4@PAC-Glucose颗粒,分别加入200 μL上样液和6 μg人免疫球蛋白酶解液,振荡孵育,磁分离,用上样液清洗3次,加入洗脱液进行洗脱,从体积为20 μL的洗脱液中取0.5 μL进行MALDI-TOF MS分析。

吸附容量计算方法:当质谱信号最高的糖肽信号强度达到最大值时,即认为溶液中全部糖肽均被吸附在颗粒表面,磁性纳米颗粒达到饱和吸附,此时计算所得值即为吸附容量。

1.7 质谱分析

MALDI-TOF MS实验中,脉冲激光波长设定为355 nm。DHB(25 mg/mL)基质溶解在含70%(v/v)ACN和1%(v/v)H3PO4的水溶液中。

质谱分析操作步骤如下:取0.5 μL洗脱液点在靶板上,于室温下挥发至干,接着滴入0.5 μL DHB基质,干燥后用MALDI-TOF MS进行分析。所得质谱结果通过ExPASy: SIB Bioinformatics Resource Portal-Proteomics Tools(http://www.expasy.org/tools/)进行搜库和数据分析。

2 结果与讨论
2.1 纳米颗粒的表征
2.1.1 透射电镜表征

磁球的透射电镜(TEM)结果见图 2和图 3。对比聚合反应前后的磁球透射电镜图可知,在聚合反应之后,磁球外有一层明显的聚合物壳层,且磁球周围较干净,没有聚合物碎片存在,磁球也没有发生团聚。表明聚合反应成功,聚合物在磁球表面的包覆情况良好。

图 2 纳米磁球聚合反应(a)前、(b)后的透射电镜照片 Fig. 2 Transmission electron microscope (TEM) pictures of nanoparticles (a) before and (b) after polymerization
图 3 纳米磁球聚合反应后的高倍数透射电镜照片 Fig. 3 High magnification TEM pictures of nanoparticles after polymerization
2.1.2 能谱表征

为了验证烯丙基氯是否成功在磁球表面发生聚合反应,分别对聚合前后的磁球进行能谱表征,结果见图 4。在图 4a中没有检测到Cl元素的信号;而在图 4b中可以看到明显的Cl元素信号。这说明烯丙基氯已被成功聚合在磁球的表面。

图 4 纳米磁球聚合反应(a)前、(b)后的能谱表征 Fig. 4 Energy spectra of magnetic nanoparticles (a) before and (b) after polymerization
2.1.3 红外光谱表征

对各步骤所得的磁球分别进行红外光谱表征,以验证各步反应是否成功。所得红外光谱图如图 5所示。与图 5a相比,图 5b中2 853.3 cm-1和1 456.0 cm-1波长处出现了明显的吸收峰,分别为CH2的C-H的伸缩振动峰和弯曲振动峰,表明聚合物已成功接合在磁球表面。1 728.0 cm-1处的吸收峰为交联剂中C=O的特征吸收峰,这也间接说明了聚合反应的实现。通过对比图 5b与图 5c可以看到,在叠氮化反应之后,2 095.1 cm-1处产生了明显的吸收峰。这个峰是N=N=N的反对称伸缩振动吸收峰,说明在纳米颗粒表面成功键合了叠氮基团。而在图 5d中,2 095.1 cm-1处吸收峰消失,说明叠氮基团全部参与了反应,炔丙基葡萄糖被成功接合到磁球表面。

图 5 纳米磁球的红外光谱表征 Fig. 5 Infrared spectroscopic characterization of magnetic nanoparticles a. before polymerization; b. after polymerization; c. after azidation; d. after click reaction.

此外,用热重分析测定了复合材料聚合物的比重,结果如图 6所示。聚合物的比重为37.70%。纳米磁球的磁力曲线图如图 7所示。

图 6 纳米颗粒热重图 Fig. 6 Thermogravimetric curves of nanoparticles a. Fe3O4-MPS; b. Fe3O4@PAC-Glucose.
图 7 (a)Fe3O4-MPS和(b)Fe3O4@PAC-Glucose的磁力曲线图 Fig. 7 Magnetic hysteresis curves of (a) Fe3O4-MPS and (b) Fe3O4@PAC-Glucose
2.2 磁球对糖肽富集方法的优化
2.2.1 富集液极性的优化

糖肽的亲水性强于一般的肽段,利用亲水相互作用能够有效地分离糖肽和非糖肽。分别考察了乙腈体积分数为94%、92%、90%、88%、86%、84%的富集液对糖肽富集分离的效果。结果表明,在乙腈体积分数为94%的极性条件下,所获得的质谱图在较低质荷比区域含有大量的信号峰。这些信号峰属于非糖肽。随着乙腈体积分数的降低,非糖肽信号逐渐减少,在乙腈体积分数为88%的条件下,所获得的质谱图中低质荷比区域已无明显的信号峰,而糖肽的信号明显。当乙腈的体积分数进一步降低时,富集后样品的糖肽信号强度逐渐减弱。由于糖肽亲水性强于非糖肽,在溶液中乙腈含量较高时,糖肽相比于一般肽段更容易被吸附到材料上;而当溶液中乙腈含量较低时,糖肽相比于一般肽段更容易分散到溶液中。仅从这个角度,相对地说,乙腈含量越高,越有利于糖肽在亲水材料表面的保留,而越不利于非糖肽在材料表面的保留。但事实上,无论糖肽还是非糖肽都更加倾向溶于非极性溶剂。在乙腈体积分数较高的情况下,糖肽与非糖肽的保留都会减少。本文选用乙腈体积分数为88%作为优化结果。

2.2.2 富集液中TFA含量的优化

富集液中TFA的含量影响磁球的保留能力和富集的选择性。分别配制了TFA体积分数为0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%的富集液,对胰蛋白酶酶解Ig G中的糖肽进行富集。TFA浓度不同的条件下,所获得的质谱出峰情况类似,仅各糖肽信号峰的强度有所区别。在TFA体积分数为1%的条件下,峰高最高,且质谱图低质荷比处的杂质信号峰也较小。因此选用1%体积分数的TFA作为优化结果。

2.2.3 洗脱液极性的优化

为了保证富集的样品能够完全洗脱,采用不同极性的洗脱溶液对保留糖肽后的磁球进行洗脱效果考察。分别配制了乙腈体积分数为16%、18%、20%、22%、24%的洗脱液。随着洗脱液极性的增大,糖肽的信号仅略微增强。在乙腈体积分数为18%和16%的质谱图中,质荷比为1 500～1 900的区域出现了较多的信号峰,可能是一些保留较强的杂质。因此选择体积分数20%的乙腈作为洗脱条件。

2.2.4 终优化的结果

在最终的优化条件下进行富集实验,酶解液富集前后的质谱图见图 8。可以明显地看出,非糖肽的信号已经消除,原本非常微弱的糖肽信号峰强度有明显提升,且发现多个富集前未能检测到的糖肽信号峰。在该条件下,一共检测到32个糖肽信号,具体信息见表 1。

图 8 优化条件下的胰蛋白酶酶解Ig G富集结果 Fig. 8 Enrichment of glycopeptides from Ig G tryptic hydrolysate under optimized conditions Peaks Nos. 1-32: I1-I32 in Table 1.
表 1 优化条件下的糖肽富集结果 Table 1 Signals of glycopeptides enriched under optimized conditions
2.3 富集容量与检出限

分别用15、30、60、125、250、500 μg磁球对6 μg的胰蛋白酶酶解Ig G进行糖肽富集。对峰高最高的糖肽信号强度与磁球用量作图(见图 9)。

图 9 峰高最高的糖肽信号强度与磁球用量的关系(n=3) Fig. 9 Relationship between intensity of the strongest glycopeptide signal and quantity of magnetic nanoparticles (n=3)

如图 9所示,磁球用量由15 μg提高到60 μg,糖肽信号增强。随着磁球用量继续增加,对溶液中糖肽的保留逐渐趋向完全。而进一步增加磁球的用量,糖肽的质谱信号强度不再明显增加,表明样品溶液中的糖肽基本完全被磁球所富集。通过计算糖肽含量与富集达到完全时磁球用量的质量比,得出该磁球对胰蛋白酶酶解Ig G的富集容量可达到100 mg/g。

分别对200 μL含有10 fmol、100 fmol、1 pmol的胰蛋白酶酶解Ig G进行富集,结果见图 10。

图 10 对不同浓度胰蛋白酶酶解Ig G进行糖肽富集 Fig. 10 Enrichment of glycopeptides from different amounts of Ig G tryptic hydrolysate

100 fmol的样品质谱图中仍然能够看到较为明显的糖肽信号;而10 fmol的样品质谱图中仍可辨别到5个糖肽的信号峰,各峰的信噪比如表 2所示。这说明方法的检出限可达到10 fmol。

表 2 10 fmol样品中糖肽信号的信噪比 Table 2 S/N of glycopeptide signals in 10 fmol sample
3 结论

制备了一种基于多功能化位点聚合物和点击反应的亲水纳米磁球,将磁分离技术与选择性吸附分离技术结合,通过在材料表面原位合成长链聚合物的方式增加分离介质表面活性位点,进一步提高其分离容量,为磁分离纳米材料的设计和制备提供了一种全新的策略。利用这种磁球,发展了胰蛋白酶酶解Ig G中糖肽的富集方法。所发展的方法操作简便,选择性好,富集容量大,检出限低,可用于规模化糖蛋白质组学分析。

参考文献
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