API 4500 Qtrap四极杆串联线性离子阱质谱仪(美国AB公司); Shimadzu LC-30AD系列高效液相色谱仪(日本岛津公司); XBridge BEH C18色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.5 μm,美国Waters公司); Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司); G560E快速混匀器(美国Scientific Industries有限公司); S120H超声波发生器(德国Elma公司); 3-30K冷冻离心机(德国Sigma公司)。

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯(美国Fisher公司);冰乙酸、氯化钠(NaCl)、无水硫酸钠(Na₂SO₄)、无水硫酸镁(Mg₂SO₄)、柠檬酸(C₆H₈O₇\5H₂O)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₃\512H₂O)、乙二胺四乙酸钠(Na₂EDTA\52H₂O)均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;氨基(NH₂)吸附剂、PSA (primary secondary amine)、十八烷基硅烷(C18)、氟罗里硅土(florisil,FCP)购自上海安谱科学仪器有限公司;硅藻土Celite 545(粒径:0.02～0.1 mm)购自德国Merck公司;中性氧化铝、酸性氧化铝(200～300目,上海亚四化学试剂有限公司);水为超纯水。

18种磺胺类标准品包括磺胺甲噻二唑(sulfamethizole,SMT)、磺胺二甲异噁唑(sulfisoxazole,SIZ)、磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine,SCP)、磺胺嘧啶(sulfadiazine,SDZ)、磺胺甲基异噁唑(sulfamethoxazole,SMZ)、磺胺噻唑(sulfathiazole,ST)、磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine,SMM)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine,SMR)、磺胺邻二甲氧嘧啶(sulfadoxin,SDX)、磺胺吡啶(sulfapyridine,SPD)、磺胺对甲氧嘧啶(sulfameter,SFM)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine,SDM)、磺胺苯吡唑(sulfadimethoxine,SPP)、磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxypyrimidine,SDT)、磺胺二甲异嘧啶(sulfisomidine,SM2)、琥珀酰磺胺噻唑(succinylsulfathiazole,SST)、磺胺喹噁啉(sulfaquinoxaline,SQ)、磺胺噁唑(sulfamoxol,SAX); 5种β-受体激动剂标准品包括盐酸克伦特罗(clenbuterol,CLT)、莱克多巴胺盐酸盐(ractopamine,RTP)、硫酸沙丁胺醇(salbutamol,SBA)、克伦潘特(clenpenterol,CLPT)、马布特罗(mabuterol,MBT)。以上化合物纯度均大于92.0%,购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。1种磺胺类增效剂标准品:甲氧苄啶(trimethoprim,TMP); 4种四环素类标准品包括四环素(tetracycline,TC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、金霉素(chlortetracycline,CHTC)、美满霉素(minocycline,MC); 3种喹诺酮类标准品包括诺氟沙星(norfloxacin,NOR)、氧氟沙星(ofloxacin,OFL)、恩诺沙星(enrofloxacin,ENR); 3种性激素类标准品包括黄体酮(progesterone,PGT)、睾酮(testosterone,TS)、甲睾酮(methyltestosterone,MTS)以及金刚烷胺。以上化合物纯度均大于99.0%,购自中国药品生物制品检定研究院。

1.2 标准溶液的配制

分别称取各标准品适量,磺胺类兽药及其增效剂、β-受体激动剂、四环素类兽药、性激素类兽药用甲醇溶解并定容,金刚烷胺用1%(体积分数,下同)甲酸乙腈溶液溶解并定容,喹诺酮类兽药用0.03 mol/L NaOH溶液溶解后用甲醇定容,均配制成质量浓度为1000 mg/L的单标准储备液,置于棕色瓶中,于-18 ℃冰箱中保存。将上述储备液用甲醇稀释为1.0 mg/L的混合标准中间液,用于优化质谱参数。用时根据需要,用0.1%甲酸水-乙腈(90:10,v/v)逐级稀释为混合标准工作液,临用新配。

0.1 mol/L Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH 4.0)的配制:准确称取12.9 g C₆H₈O₇\5H₂O、10.9 g Na₂HPO₃\512H₂O、37.2 g Na₂EDTA\52H₂O,加超纯水900 mL溶解,用1 mol/L NaOH调pH值至4.0,加超纯水稀释至1000 mL。

1.3 样品处理

准确称取匀质后试样2.0 g(精确至0.1 g)于50 mL离心管中,加入5.00 mL 0.1 mol/L Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液,于快速混匀器上涡旋2 min,超声提取5 min。以4000 r/min的速度离心5 min,将上清液置于另一50 mL离心管中,残余物再用20.00 mL 2.5%乙酸乙腈溶液提取一次,取上清液,合并两次上清液。依次加入2.0 g NaCl和2.0 g无水Na₂SO₄,涡旋5 min,以10000 r/min的速度离心5 min。精密移取上清液(乙腈相)10.00 mL于50 mL离心管中,加入200 mg NH₂吸附剂,涡旋2 min,以10000 r/min的速度离心5 min,取上清液氮吹至干。加入1.00 mL 0.1%甲酸水-乙腈(75:25,v/v)溶解残渣,经超声溶解和涡旋混匀后,过0.22 μm有机滤膜,滤液供LC-MS/MS测定。

1.4 空白基质匹配混合标准溶液的配制

取空白基质样品,按1.3节方法处理样品,浓缩至干后,加入混合标准工作溶液1.00 mL复溶,涡旋混匀,过0.22 μm滤膜,即得空白基质匹配混合标准溶液。

1.5 色谱条件

色谱柱:XBridge BEH C₁₈柱;柱温:40 ℃;进样量:5 μL。流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液,流动相B为0.1%甲酸水溶液;流速:0.5 mL/min。梯度洗脱程序:0～2 min,5%A～20%A; 2～4 min,20%A～25%A; 4～7 min,25%A～55%A; 7～9 min,55%A; 9～13 min,55%A～90%A; 13～17 min,90%A; 17～18 min,90%A～5%A; 18～21 min,5%A。

1.6 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源;正离子扫描;多反应监测(MRM);喷雾电压(IS): 5500 V;离子源温度(TEM): 650 ℃;气帘气(CUR)流速:35 L/min;雾化气(GS1)流速:55 L/min;辅助加热气(GS2)流速:55 L/min;射入电压(EP): 10 V;碰撞室射出电压(CXP): 13 V;质谱采集参数见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 35种兽药的质谱参数 Table 1 Parameters for mass spectrometric analysis of the 35 veterinary drugs Drug tR/min Parent ion (m/z) Product ions (m/z) Declustering potential/V Collision energies/eV Sulfamethizole (SMT) 6.22 271.2 108.1,156.2* 55 30,18 Sulfisoxazole (SIZ) 7.92 268.2 108.1,156.2* 55 28,20 Sulfachloropyridazine (SCP) 7.35 285.2 108.1,156.2* 55 33,20 Sulfadiazine (SDZ) 4.88 251.2 108.1,156.2* 55 32,20 Sulfamethoxazole (SMZ) 7.70 254.2 108.1,156.2* 55 30,20 Sulfathiazole (ST) 5.01 256.3 108.1,156.2* 55 28,20 Sulfamonomethoxine (SMM) 7.03 281.2 108.1,156.2* 90 35,23 Sulfamerazine (SMR) 5.57 265.1 108.1,156.2* 90 37,23 Sulfadoxin (SDX) 7.58 311.2 108.1,156.2* 90 34,25 Sulfapyridine (SPD) 5.22 250.3 108.1,156.2* 90 30,21 Sulfameter (SFM) 6.42 281.2 108.1,156.2* 90 30,22 Sulfamethazine (SDM) 6.18 279.2 186.2,124.2* 94 23,28 Sulfadimethoxine (SPP) 8.46 315.1 156.2,160.3* 90 26,27 Sulfadimethoxypyrimidine (SDT) 7.57 311.2 108.1,156.2* 90 34,25 Sulfisomidine (SM2) 4.40 279.2 186.2,124.2* 92 21,26 Succinylsulfathiazole (SST) 5.41 356.1 192.3,256.2* 80 33,24 Sulfaquinoxaline (SQ) 8.33 301.2 108.1,156.2* 70 35,20 Sulfamoxol (SAX) 5.76 268.2 108.1,156.2* 82 28,21 Trimethoprim (TMP) 5.21 291.0 230.2,123.1* 120 28,28 Clenbuterol (CLT) 6.91 277.1 132.1,203.1* 50 36,22 Ractopamine (RTP) 5.61 302.2 121.0,164.2* 50 28,21 Salbutamol (SBA) 3.76 240.1 166.1,148.0* 50 18,25 Clenpenterol (CLPT) 7.60 291.0 273.0,203.0* 50 14,20 Mabuterol (MBT) 7.72 311.2 293.0,237.0* 50 16,24 Amantadine (AMT) 5.55 152.0 93.0,135.1* 40 28,7 Tetracycline (TC) 5.97 445.1 154.1,410.0* 80 36,27 Oxytetracycline (OTC) 5.39 161.1 443.1,426.1* 80 18,27 Chlortetracycline (CHTC) 7.41 479.2 462.0,444.1* 80 30,24 Minocycline (MC) 4.85 458.1 352.1,441.2* 80 40,25 Norfloxacin (NOR) 5.06 320.0 233.1,276.2* 80 32,24 Ofloxacin (OFL) 5.12 362.2 261.0,318.1* 80 37,25 Enrofloxacin (ENR) 5.75 360.1 245.1,316.1* 80 36,26 Progesterone (PGT) 11.97 315.1 97.0,109.1* 130 23,30 Testosterone (TS) 10.05 289.1 97.0,109.1* 130 23,26 Methyltestosterone (MTS) 10.45 303.1 97.0,109.1* 130 30,30  tR： retention time. * Quantitative ion.

表 1 35种兽药的质谱参数 Table 1 Parameters for mass spectrometric analysis of the 35 veterinary drugs

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 色谱条件

本研究采用乙腈作为有机相,考察了在水相中添加0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.01 mol/L乙酸铵对色谱分离和质谱灵敏度的影响。结果表明,添加乙酸铵时四环素类兽药峰形较差,且灵敏度下降明显;添加甲酸和乙酸后,各化合物离子化效率更高,峰形得到明显改善,灵敏度普遍较好。由于甲酸酸性更强,其效果优于乙酸。

当乙腈中加入0.1%甲酸后,各化合物的响应信号更强,分离度及重复性更好,且基线噪音明显降低。因此,本试验最终采用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

采用选定的流动相和色谱柱,优化梯度洗脱程序,所有待测物都得到良好的峰形和较高的灵敏度。6组同分异构体SIZ/SAX、SMM/SFM、SDX/SDT、SDM/SM2、TMP/CLPT和SPP/PGT具有相同的准分子离子,分别为m/z 268.2、281.2、311.2、279.2、291.0和315.1,可通过保留时间或碎片离子的差异得到区分。图 1为20 μg/kg添加水平下,猪肉中目标化合物的总离子流色谱图。由于色谱柱残留的硅烷醇基团促进CHTC产生互变异构及差向异构,因此会形成一个较长较宽的前沿色谱峰^[10](见图 2)。

图 1

Fig. 1

图 1 猪肉中35种兽药的总离子流图 Fig. 1 Total ion chromatograms of the 35 veterinary drugs in porcine muscle

图 2

Fig. 2

图 2 金霉素的提取离子色谱图 Fig. 2 Extracted ion chromatograms of CHTC

2.1.2 质谱条件

采用直接进样方式将1.0 mg/L的混合标准溶液进样,分别进行正离子和负离子全扫描分析,所有待测物响应最佳的准分子离子峰均在正离子模式下获得,母离子均为[M+H]⁺。以准分子离子为母离子进行二级质谱扫描,得到各个化合物相应的碎片离子,根据欧盟决议^[11]中有关质谱分析方法必须不少于4分的规定,选择信号强度较大且信噪比较高的两个碎片离子作为特征子离子,其中丰度相对最强的为定量离子,其次为定性离子,然后再对得到的二级质谱参数如去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)等进行优化,使定性离子与定量离子产生的离子对强度达到最大。优化得到的质谱参数见表 1。

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 提取方式的选择

在动物肌肉组织中,β-受体激动剂一般以结合态和游离态两种形态存在,因此国家标准方法^[12]采用酶解法检测其残留总量。但该方法耗时长,不利于快速筛查。鉴于35种兽药中只有5种β-受体激动剂,如采用酶解法检测将增加前处理时间,同时也影响其他兽药的回收率,因此本试验直接用0.1 mol/L Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲液以及2.5%乙酸乙腈溶液复合提取游离态的CLT、RTP、SBA、CLPT和MBT。

2.2.2 提取溶剂的选择

提取溶剂的选择是本研究的难点和重点。本试验考察了乙腈^[13]、甲醇、0.1 mol/L柠檬酸-0.2 mol/L Na₂HPO₄溶液(8:5,v/v,pH 4.0)^[14]、0.1 mol/L Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲液(pH 4.0)^[15]、乙酸-乙腈(5:95,v/v)^[16]、氨水-乙腈(1:99,v/v)^[17]6种提取溶剂。结果表明,有机溶剂如乙腈、甲醇具有良好的沉淀蛋白质及提取目标化合物的能力,然而用甲醇提取时会带入更多的极性基质干扰物,增加后续净化难度。用单一有机溶剂提取时,除大部分磺胺类及β-受体激动剂兽药外,待测物平均回收率均比较低;当提取溶剂中加入适量的乙酸时,金刚烷胺、性激素、磺胺增效剂等化合物的提取效果均比较理想,但四环素类兽药平均回收率仅为48%;当提取溶剂为碱性乙腈时,磺胺类、四环素类及喹诺酮类兽药平均回收率均不足35%; 0.1 mol/L柠檬酸-0.2 mol/L Na₂HPO₄溶液(8:5,v/v,pH 4.0)以及0.1 mol/L Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲液(pH 4.0)均可以很好地提取大部分化合物,但前者对四环素类兽药提取效果相对较差(平均回收率不足60%),这可能与四环素类兽药与二价金属离子的螯合作用有关^[18],而Na₂EDTA缓冲溶液的加入可以竞争配合基质中存在的大多数金属离子,使四环素类兽药游离出来。

鉴于7类兽药理化性质差异较大,本研究考虑采用复合提取方式,即用0.1 mol/L Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲液(pH 4.0)进行第一遍提取,用5%乙酸乙腈溶液进行第二遍提取。图 3为20 μg/kg添加水平下,7类药物在不同提取溶剂和吸附剂下的平均回收率(吸附剂均为200 mg NH₂)。

图 3

Fig. 3

图 3 7类兽药在不同(a)提取溶剂和(b)吸附剂下的平均回收率 Fig. 3 Average recoveries of the seven classes of the veterinary drugs using different (a) solvents and (b) sorbents Solvents (Sol.): 1. 0.1 mol/L citric acid & 0.2 mol/L Na2HPO4 solution (8:5,v/v,pH 4.0); 2. 0.1 mol/L Na2EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid)-Mcllvaine buffer solution (pH 4.0); 3. 5% (v/v) acetic acid in acetonitrile; 4. 1% (v/v) ammonia water in acetonitrile; 5. 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine buffer solution (pH 4.0) and acetonitrile containing 5% (v/v) acetic acid. Sorbents (Sor.): 1. 200 mg C18; 2. 200 mg NH2; 3. 200 mg alumina; 4. 200 mg aluminum oxide; 5. 200 mg celite; 6. 200 mg florisil (FCP); 7. 200 mg primary secondary amine (PSA)/600 mg MgSO4.

鉴于35种待测物大部分带有伯胺或仲胺基团,具有一定弱碱性,提取溶剂中加入适量乙酸会促进上述目标物的离子化效率,从而获得更好的提取效果。本试验分别比较了1%、2.5%、5%、7%乙酸乙腈溶液的提取效果,发现磺胺类化合物受溶液酸度影响较大。当酸度过低时,磺胺类兽药在溶液中的解离程度低,使其提取回收率偏低;当酸度大于5%时,大部分磺胺类待测物会发生一定程度的降解,故本试验采用2.5%的乙酸乙腈作为复提取溶剂。

2.2.3 净化条件的优化

QuEChERS方法一般以NaCl与NaOAc、无水MgSO₄与无水Na₂SO₄作为盐析剂与脱水剂。本试验向提取溶液中加入NaOAc与无水MgSO₄,结果发现磺胺类、四环素类以及喹诺酮类兽药回收率均有不同程度的降低,特别是四环素兽药的回收率降低显著,这是由于四环素类兽药易与Mg²⁺形成螯合物。通过反复试验,发现2 g NaCl与2 g无水Na₂SO₄协同效果最好,35种待测物的回收率为67.1%～114.8%。

本文分别考察了C18、NH₂、中性氧化铝、酸性氧化铝、硅藻土、氟罗里硅土以及PSA/MgSO₄共7种吸附剂的净化效果。使用不同吸附剂时各类兽药的平均回收率见图 3b。结果表明,中性氧化铝、酸性氧化铝、硅藻土、氟罗里硅土以及PSA/MgSO₄对四环素类、喹诺酮类、性激素类以及部分磺胺类兽药均有不同程度的吸附,且基线噪音大,干扰峰多,净化效果不理想。C18和NH₂吸附剂净化效果类似,但NH₂净化后的溶液更澄清、更干净,杂质干扰峰更少。试验比较了不同用量(100、200、400 mg)NH₂以及100 mg NH₂和100 mg C18吸附剂的净化效果。结果表明,使用200 mg NH₂可以获得良好的净化效果,且不会对待测物产生明显的吸附。

2.2.4 基质效应的评价

基质效应是由基质中的共提干扰物(非目标化合物)与目标化合物竞争电离所致^[19]。在配置电喷雾源的LC-MS定性定量分析中,基质效应影响仪器的灵敏度和重复性,从而影响检测结果的准确度。为评价基质效应,分别制备空白基质标准曲线(添加含量为1、2、5、10、20、50 μg/kg)以及相应含量的溶剂标准曲线。根据基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率比值来评价基质效应^[20]。若比值在0.8～1.2范围内,则表明基质效应不明显。本文对35种兽药的基质效应进行了评价(见表 2),可以看出,猪肉样品中77%以上的兽药基质效应不明显,仅有少部分兽药如SMM、SFM、SM2、CLT以及四环素类兽药呈现出较强的基质效应。综上所述,本研究的前处理方法可有效去除脂肪等引起的基质效应,但为了获得更加准确的定量结果,本试验仍采用空白基质匹配标准曲线以抵消或补偿基质效应。

表 2 (Table 2)

表 2 猪肉空白样品中35种兽药的基质效应、加标回收率以及精密度(n=6) Table 2 Matrix effects,average spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 35 veterinary drugs in blank porcine muscle (n=6) Drug Matrix effect 2 μg/kg 10 μg/kg 50 μg/kg Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% SMT 0.69 105.1 4.6 105.7 4.6 80.5 7.2 SIZ 0.78 103.7 3.4 107.1 3.7 81.5 6.4 SCP 0.77 112.8 1.5 103.5 3.4 77.2 7.6 SDZ 0.75 109.5 2.9 107.2 2.7 79.0 3.7 SMZ 0.83 93.4 3.1 110.7 2.0 78.9 6.7 ST 0.68 110.0 3.4 109.4 6.5 78.8 6.3 SMM 0.41 87.3 2.4 109.7 1.7 89.0 3.7 SMR 0.76 86.4 4.7 108.5 2.8 80.1 5.1 SDX 0.84 100.7 3.0 111.7 2.2 84.0 5.4 SPD 0.73 95.9 2.6 112.2 1.3 82.4 2.3 SFM 0.54 102.9 2.1 112.7 0.6 82.4 3.6 SDM 0.76 102.7 2.3 101.3 3.3 79.2 4.2 SPP 0.84 102.6 2.4 103.3 2.0 75.9 6.8 SDT 0.88 105.5 2.6 111.5 1.5 77.8 6.4 SM2 0.35 105.5 2.2 100.6 1.7 78.1 3.9 SST 0.79 81.5 4.1 96.2 3.0 80.7 4.0 SQ 0.84 99.7 1.9 102.6 4.1 78.0 7.5 SAX 0.70 106.9 5.1 113.5 7.5 75.8 9.8 TMP 0.78 83.8 4.3 105.7 3.5 79.4 1.5 CLT 0.52 94.9 5.8 106.7 2.9 86.7 2.8 RTP 0.93 97.0 3.3 108.4 2.4 77.9 6.3 SBA 0.97 97.8 3.7 105.6 1.0 82.7 4.3 CLPT 0.85 92.4 3.5 102.3 3.7 82.9 4.0 MBT 0.88 87.9 2.9 100.5 0.9 78.9 2.4 AMT 0.77 99.2 2.0 88.5 2.9 71.8 1.0 TC 0.40 82.8 4.1 91.9 2.6 97.6 5.1 OTC 0.45 98.2 4.0 102.3 3.0 90.1 3.3 CHTC 0.26 102.4 3.1 93.6 3.1 82.4 2.4 MC 0.58 102.8 5.0 100.2 5.3 92.8 3.6 NOR 1.07 103.6 3.4 103.4 2.7 89.2 3.8 OFL 0.83 96.0 4.2 97.5 2.2 80.1 2.4 ENR 0.90 101.9 2.4 100.0 2.5 79.7 2.8 PGT 0.76 84.1 2.8 99.6 3.2 82.8 2.1 TS 0.82 100.0 1.8 95.8 2.3 76.2 3.5 MTS 0.81 97.5 2.9 102.7 2.1 78.0 2.8

表 2 猪肉空白样品中35种兽药的基质效应、加标回收率以及精密度(n=6) Table 2 Matrix effects,average spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 35 veterinary drugs in blank porcine muscle (n=6)

2.2.5 线性方程、检出限与定量限

按1.4节方法配制6个水平的基质匹配混合标准溶液,在选定的色谱条件和质谱参数下进行检测。以目标化合物定量离子的峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X,μg/L)为横坐标绘制工作曲线,35种兽药的线性范围为1.0～50.0 μg/L,相关系数r为0.9967～1.0000,线性关系良好。以定量离子信噪比S/N=3为样品的检出限(LODs),S/N=10为定量限(LOQs),结果见表 3。35种兽药的LODs为0.01～1.01 μg/kg,LOQs为0.04～3.37 μg/kg。

表 3 (Table 3)

表 3 35种兽药的基质匹配线性方程、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 3 Matrix-matched linear equations,correlation coefficients (r),LODs and LOQs of the 35 veterinary drugs Drug Linear equation r LOD/(μg/kg) LOQ/(μg/kg) SMT Y=4.15×104X+1.35×104 0.9982 0.02 0.06 SIZ Y=3.79×104X+8.81×103 0.9980 0.04 0.12 SCP Y=4.37×104X-2.16×103 0.9976 0.06 0.21 SDZ Y=6.68×104X+4.45×103 0.9983 0.02 0.06 SMZ Y=4.45×104X+2.76×104 0.9977 0.08 0.27 ST Y=5.34×104X+7.92×103 0.9980 0.04 0.14 SMM Y=1.56×104X+7.12×103 0.9967 0.14 0.46 SMR Y=1.01×105X+9.15×104 0.9971 0.01 0.04 SDX Y=1.78×105X+1.42×105 0.9993 0.02 0.07 SPD Y=5.39×104X+4.26×104 0.9993 0.03 0.08 SFM Y=4.06×104X+1.25×104 0.9998 0.02 0.07 SDM Y=5.87×104X+1.84×104 0.9975 0.03 0.09 SPP Y=2.89×104X+2.88×103 0.9987 0.03 0.12 SDT Y=2.06×105X+1.07×105 0.9995 0.01 0.04 SM2 Y=5.06×104X+7.22×101 0.9981 0.04 0.12 SST Y=7.46×103X+2.41×103 1.0000 0.17 0.56 SQ Y=3.95×104X+2.03×104 0.9995 0.05 0.16 SAX Y=7.20×104X+5.90×104 0.9997 0.04 0.12 TMP Y=4.53×104X+2.40×104 0.9998 0.06 0.19 CLT Y=7.91×104X+3.52×104 0.9992 0.06 0.21 RTP Y=9.02×104X+6.31×104 0.9999 0.01 0.05 SBA Y=1.00×105X+2.47×104 1.0000 0.02 0.07 CLPT Y=1.70×105X+7.13×104 0.9999 0.02 0.08 MBT Y=2.40×105X+8.89×104 0.9997 0.01 0.04 AMT Y=4.77×103X+2.84×102 1.0000 1.01 3.37 TC Y=4.23×103X+2.26×103 0.9983 0.21 0.71 OTC Y=4.89×103X+1.03×103 1.0000 0.52 1.74 CHTC Y=1.70×103X+1.59×103 0.9987 0.28 0.92 MC Y=3.29×103X-3.17×102 0.9996 0.27 0.89 NOR Y=1.25×104X-3.24×103 0.9998 0.08 0.27 OFL Y=3.28×104X-9.24×102 1.0000 0.05 0.17 ENR Y=2.83×104X+1.36×104 0.9999 0.03 0.08 PGT Y=2.07×104X+1.63×104 0.9995 0.13 0.45 TS Y=2.33×104X+5.24×103 0.9997 0.10 0.34 MTS Y=1.93×104X-1.23×103 1.0000 0.07 0.24  Y: peak area； X: mass concentration,μg/L.

表 3 35种兽药的基质匹配线性方程、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 3 Matrix-matched linear equations,correlation coefficients (r),LODs and LOQs of the 35 veterinary drugs

2.2.6 回收率和精密度

在空白猪肉样品中添加35种兽药混合标准溶液,制备含量分别为2、10和50 μg/kg的加标样品,按上述前处理方法及测定条件进行回收率试验,每个添加水平做6次平行测定,结果见表 2。各化合物的平均回收率为71.8%～113.5%,相对标准偏差(RSDs)为0.6%～9.8%,符合多残留分析的要求。

2.3 实际样品检测

采用本文所建立的方法,对购自市场及超市的20份猪肉进行全面的筛查分析。检测结果显示1份猪肉样品检出SMZ,残留量为23.2 μg/kg; 2份猪肉样品检出SQ,残留量分别为3.0 μg/kg和6.1 μg/kg;其余样品均无兽药检出。为验证本方法的可靠性,对阳性猪肉样品采用GB/T 21316-2007方法进行验证,其SMZ和SQ的残留量分别为25.0、3.2和6.4 μg/kg,可见两种方法的测定结果非常接近,表明本法适用于猪肉中兽药残留的定性筛查及定量测定。

3 结论

本文采用改进的QuEChERS方法建立了LC-MS/MS同时测定猪肉中磺胺类、磺胺类增效剂、β-受体激动剂、四环素类、喹诺酮类、金刚烷胺以及性激素共7类35种兽药的多残留分析方法。与现行国家标准及行业标准相比,该方法能实现同时分析多类药物残留,大大缩短了检测周期,节约了检测成本。本研究方法操作简便、快速、准确,其灵敏度、准确度和精密度均符合多残留检测技术的要求,为各食品检测机构提供了简单快速的筛选方法来应对大批量的猪肉中禁限用兽药的日常监控,为保证人民饮食安全提供了技术支持。

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