色谱  2016, Vol. 34 Issue (9): 895-900   PDF    
扩展功能
加入收藏夹
复制引文信息
加入引用管理器
Email Alert
RSS
本文作者相关文章
付博
张吉苹
姜晖
周璐
基于脂肪酸的漂浮液滴固化分散液液微萃取-高效液相色谱法联用测定酒类样品中的4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚
付博1, 张吉苹2, 姜晖2, 周璐2     
1. 南京林业大学化工学院, 江苏 南京 210000;
2. 江苏瑞达环保科技有限公司, 江苏 盐城 224400
收稿日期：2016-06-15
基金项目：江苏省自然科学青-基金项目（BK20160922）；江苏省产学研前瞻性联合研究项目（BY2016006-02）
通讯联系人： E-mail:jpzhang11@mails.jlu.edu.cn
摘要：建立了基于脂肪酸的漂浮液滴固化分散液液微萃取（FA-DLLME-SFO）方法，与高效液相色谱联用检测了酒类样品中的4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚。该方法萃取时间仅需4 min，仅需脂肪酸、氨水和硫酸3种对环境友好的试剂。对影响方法萃取效率的因素（包括样品的体积、萃取剂的种类和用量、氨水和硫酸的体积以及盐的加入量）进行了详细的考察。在最佳萃取条件下（10 mL样品，100 μL辛酸萃取剂，110 μL 25%～28%（质量分数）的氨水，0.8 mL 98%（质量分数）的浓硫酸，3.0 g NaCl），4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚在0.02～1.0 mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数分别为0.9997和0.9999，相对标准偏差（n=3）分别为6.2%和3.5%，检出限分别为6.33和5.81 μg/L，富集倍数分别为79和86。在啤酒和白葡萄酒样品中，加标回收率为81.4%～108.7%，相对标准偏差（n=3）小于8.9%。该方法简单、对环境友好，可用于酒类样品中4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚的检测。
关键词： 分散液液微萃取     高效液相色谱     脂肪酸     4-乙基苯酚     4-乙基愈创木酚    
Fatty acid and solidification floating organic drop-based dispersive liquid-liquid microextraction method coupled with high performance liquid chromatography for the determination of 4-ethylphenol and 4-ethylguaiacol in wines
FU Bo1, ZHANG Jiping2, JIANG Hui2, ZHOU Lu2     
1. College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210000, China ;
2. Jiangsu Ruida Technology Co., Ltd, Yancheng 224400, China
Received: 2016-06-15
Foundation Item: Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China (No. BK20160922); Industrial-Academic-Research Prospective Joint Research Project of Jiangsu Province of China (No. BY2016006-02).
* Corresponding author. E-mail:jpzhang11@mails.jlu.edu.cn
Abstract: A method of fatty acid and solidification floating organic drop-based dispersive liquid-liquid microextraction (FA-DLLME-SFO) coupled with high performance liquid chromatography to determine 4-ethylphenol (4-EP) and 4-ethylguaiacol (4-EG) in wine samples was developed. The method required less than 4 min to extract the two target analytes from wine samples, and only three kinds of eco-friendly solvents including fatty acid, ammonium hydroxide and sulfuric acid were used. The analytical parameters affecting the extraction efficiency including the volumes of the sample, the nature and volumes of the extraction solvent, the volumes of ammonium hydroxide and sulfuric acid, and the amount of salt addition were optimized. Under the optimum conditions (10 mL sample, 100 μL octanoic acid, 110 μL 25%-28% (mass percentage) NH4OH, 0.8 mL 98% (mass percentage) H2SO4, 3.0 g NaCl), the linear ranges were 0.02-1.0 mg/L with correlation coefficients of 0.9997 and 0.9999 for 4-ethylphenol and 4-ethylguaiacol, and the relative standard deviations (RSDs) were 6.2% and 3.5%, respectively. The LODs were 6.33 μg/L and 5.81 μg/L, and the enrichment factors (EFs) were 79 and 86 for 4-ethylphenol and 4-ethylguaiacol, respectively. The present method was applied to the determination of the two analytes in white wine and beer samples, and the recoveries of them were in the range of 81.4%-108.7% with the RSDs less than 8.9%. The method is simple and eco-friendly for rapid analysis of 4-ethylphenol and 4-ethylguaiacol in wine samples.
Key words: dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME)     high performance liquid chromatography (HPLC)     fatty acid     4-ethylphenol (4-EP)     4-ethylguaiacol (4-EG)    

挥发酚类是酒的重要香味成分,对酒的品质有较大影响。4-乙基苯酚(4-EP)和4-乙基愈创木酚(4-EG)在葡萄酒中的总浓度小于400μg/L时,可为酒的风味贡献辛香;过多则会产生腥异味[1]。目前,饮料酒中挥发酚的前处理方法主要有固相萃取(SPE)[2]、液液萃取(LLE)[3]、分散液液微萃取(DLLME)[4]和超声辅助乳化微萃取(USAEME)[5]等。对于基质较为复杂的酒类样品,SPE的选择性高于LLE,但SPE和LLE方法均需要大量的有机溶剂,并且耗时较长,方法成本较高。为了克服这些缺点,近年来,分析工作者开发了众多简单快速的液相微萃取前处理方法。2006年,Assadi等[6]首先报道了添加了分散剂的三元乳化微萃取体系分散液液微萃取方法,该方法的突出特点是简单、快速、富集倍数高。Pizarro等[4]成功运用DLLME与气相色谱-质谱结合测定了酒样中的挥发酚,方法的检出限可达0.005～0.075 μg/L。2008年,Huang等[7]结合DLLME方法与Yamini等[8]创立的漂浮液滴固化液液微萃取(LLE-SFO)方法建立了漂浮液滴固化分散液液微萃取(DLLME-SFO),该方法使用熔点接近室温、密度小于水且低毒的溶剂作为萃取剂,样品经离心和冷冻后,固化的有机相漂浮在水面上,可被轻易取出,从而简化了DLLME方法。Asadi等[9, 10]将漂浮液滴固化微萃取方法与HPLC联用,实现了人体血液和尿液中苯巴比妥类药物和立痛定的萃取与检测。但目前为止,可应用于DLLME-SFO方法的萃取剂种类有限,常用的有十一醇和十二醇[11, 12]。

最近,Shih等[13]建立了一种基于中链饱和脂肪酸的分散液液微萃取(FA-IT-DLLME)方法,并与HPLC联用成功检测了水样中的烷基苯酚。该方法所需的试剂仅有脂肪酸、氨水和硫酸,向溶液中加氨水使之变为碱性后,萃取剂脂肪酸转化为溶于水的阴离子形式,可在水相和有机相之间形成乳化层,完成对水相中有机物的萃取。再用硫酸将溶液调为酸性,脂肪酸可恢复为疏水形式,经离心后漂浮于水面上,该方法最后使用了特殊的自制装置实现了对有机相的收集。2016年,Vakh等[14]同样利用中链饱和脂肪酸作为萃取剂,以碳酸钠作为亲水转换剂和发泡剂,以硫酸作为pH调节剂,实现了人体尿样中氧氟沙星的检测。

本文使用辛酸和壬酸这两种熔点接近室温的萃取剂,冷冻收集离心后漂浮于样品表面的萃取剂,代替了FA-IT-DLLME方法中使用的特殊自制装置,进一步简化了前处理方法,新方法被命名为基于脂肪酸的漂浮液滴固化分散液液微萃取(FA-DLLME-SFO),与HPLC联用检测了白葡萄酒和啤酒样品中的4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1220系列高效液相色谱仪配20 μL定量阀的手动进样器、ODS-M80色谱柱(250 mm×4.6mm,4 μm)购于美国Agilent公司。

辛酸、壬酸、1-十一醇、1-十二醇、4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚均为分析纯,购于美国Sigma-Aldrich公司。辛酸作萃取剂时,在使用之前需纯化。氯化钠(分析纯)、磷酸(分析纯)、25%～28%(质量分数,下同)氨水和98%(质量分数,下同)浓硫酸购于上海国药集团化学试剂有限公司;甲醇(色谱纯)购于德国默克公司;去离子水(电导率≥18MΩ·cm)。

称取4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚标准品各0.0100g,用甲醇溶解,配制成100 mg/L的标准储备液,于4 ℃密封保存,使用时经去离子水稀释至所需浓度。

1.2 萃取过程

取10 mL水样(含1.0mL乙醇,为模拟实际酒样),置于15 mL离心管中,加入3.0 g NaCl,振荡使其溶解,加入100 μL辛酸,摇匀,形成乳浊液。再向水样中加入110 μL 25%～28%的氨水,此时溶液立即变澄清。振摇30 s后,将0.8 mL 98%浓硫酸加入溶液中,此时溶液又恢复乳浊液状态。振摇30 s后依次进行离心和冷冻,最后取出固化的萃取剂,放置于室温下,待其融化后取20 μL注入HPLC进行分析。

1.3 色谱条件

色谱柱:ODS-M80柱;进样体积:20 μL;流动相为40%(体积分数)甲醇水溶液(用磷酸调节pH值至3.0);等度洗脱,流速:0.8 mL/min;检测波长:230 nm。

2 结果与讨论

采用回收率(ER)和富集倍数(EF)来评价萃取效果,对影响萃取效率的因素,如萃取剂的种类和体积、氨水和硫酸的用量、盐的加入量及水样的体积做了考察。样品加标水平设置为1.0mg/L,所有测定结果均采用3次测定的平均值。

2.1 萃取剂的选择

熔点(melting point,mp)在室温附近的脂肪酸有辛酸(mp: 16.51 ℃)、壬酸(mp: 12.4℃)和癸酸(mp: 31.5 ℃),其中癸酸在室温下为固体,不易定量加入,所以本试验选择辛酸和壬酸两种脂肪酸作为萃取剂。在10 mL水样中依次加入3.0 g NaCl、100 μL萃取剂、120 μL 25%～28%的氨水和1.0 mL 98%的浓硫酸,考察了这两种脂肪酸型萃取剂在FA-DLLME-SFO方法下对两种目标化合物的回收率。同时,试验也以常作为DLLME-SFO方法萃取剂的1-十一醇和1-十二醇为萃取剂,对比了两种脂肪醇与两种脂肪酸对目标化合物的回收率。在10 mL水样中,依次加入3.0 g NaCl、100 μL萃取剂和500 μL甲醇。萃取结果如图 1所示,两种脂肪酸与常用的两种脂肪醇萃取效果相当,其中,使用辛酸获得的回收率稍大于壬酸,所以后续实验选择使用辛酸作为萃取剂。

图 1 不同萃取剂对萃取回收率的影响(n＝3) Fig. 1 Effect of the different extraction solvents on the extraction recoveries (ERs) (n＝3) Conditions: sample volume,10 mL; salt addition,3.0 g NaCl; extractant volume,100 μL; 25%-28% (m/m) NH4OH,120 μL; 98% (m/m) H2SO4,1.0 mL; methanol,500 μL. 4-EP: 4-ethylphenol; 4-EG: 4-ethylguaiacol.

4-乙基苯酚的辛醇-水分配系数(Kow)为380,属于亲脂性中等的化合物,需要相对较大的萃取剂体积以保证较高的萃取率。本试验选择萃取剂的体积为60、80、100和120μL,萃取剂辛酸的体积与两种目标化合物的回收率、富集倍数的关系如图 2所示。当辛酸的体积为60 μL和80 μL时,两种目标化合物的回收率小于80%,辛酸的体积大于100 μL之后,回收率基本保持不变,但富集倍数随辛酸体积的增大而下降,为了保证具有较高的回收率和较大的富集倍数,选择辛酸的体积为100 μL。

图 2 萃取剂体积对萃取回收率和富集倍数的影响(n＝3) Fig. 2 Effect of the volumes of the extraction solvent on the extraction recoveries and enrichment factors (EFs) (n＝3) Conditions: sample volume,10 mL; salt addition,3.0 g NaCl; extractant volume,60-120 μL; 25%-28% NH4OH,120 μL; 98% H2SO4,1.0 mL.
2.2 氨水和硫酸的体积

当溶液pH值比脂肪酸在水中的平衡解离常数的负对数(pKa)大3以上时,大部分脂肪酸可被转换为其阴离子形式,从而溶于水形成表面活性剂胶束[13]。本试验所选萃取剂辛酸的pKa值为4.896,为使其转变为溶于水的形式,需加碱液使溶液的pH值大于7.896,因此考察了25%～28%氨水体积为60～160μL时的回收率。当氨水体积为60 μL时,回收率低于70%;氨水体积为110 μL时,回收率最大;氨水体积大于110 μL时,回收率略有下降,可能是因所加氨水过量,而后续步骤加入的浓硫酸体积不足,使辛酸有部分阴离子形式残留于水样中所致。所以最终选择25%～28%氨水的体积为110 μL,加入氨水后测得溶液的pH值为9.46。

FA-IT-DLLME方法中加入硫酸的目的是把阴离子形式的脂肪酸转变为其本身疏水的形式,所加硫酸的量至少要将溶液的pH值降低至比辛酸pKa值小3[13]。在本方法中考察了不同体积(0.4～1.0mL)的98%浓硫酸对回收率的影响。98%浓硫酸的体积为0.8 mL时,4-EP和4-EG的回收率可达88%和89%,之后随98%浓硫酸体积的增加,回收率略有下降,可能是稀释效应所致。因此,选择98%浓硫酸的体积为0.8 mL。

2.3 盐的加入量

盐效应的影响一般分为两种:一是最常见的盐析效应——加入盐可以降低目标化合物在水相中的溶解度,使其更多地转移到有机相中,从而提高萃取率,该效应多见于极性较大、亲脂性弱的目标化合物[15];二是盐溶效应——盐的加入增大了溶液的离子强度,增加了溶液的黏度和密度,产生了黏度阻碍效应,从而阻碍目标化合物的传质转移过程[16]。如两种效应相互抵消,则加盐对萃取率无影响。鉴于本文的两种目标化合物均为亲脂性中等的有机物,在10 mL水样中加入0～3.7g NaCl[17],结果如图 3所示,随着盐的加入量从0增加到3.0 g,回收率持续增大;盐的加入量为3.0 g时,因受盐析效应的影响,回收率最大;盐的加入量高于3.0 g以后,回收率略有下降,可能是稀释效应导致的。所以本试验选择NaCl的加入量为3.0 g。另外,因FA-IT-DLLME方法萃取的实质是表面活性剂效应,虽然加入浓硫酸之后脂肪酸萃取剂可以恢复本身疏水的形式,但溶液经过离心之后仍然会有泡沫漂浮在表面,不利于萃取剂的取出。本试验发现,向溶液中加入盐阻止了泡沫的生成,从而利于溶液的分层、冷冻和取样。

图 3 氯化钠加入量对萃取回收率的影响(n＝3) Fig. 3 Effect of amount of salt addition on the extraction recoveries (n＝3) Conditions: sample volume,10 mL; salt addition,0-3.7 g NaCl; extractant volume,100 μL; 25%-28% NH4OH,110 μL; 98% H2SO4,0.8 mL.
2.4 水样体积

大部分液相微萃取方法中所用样品体积为1～40 mL,在一定条件下,增加样品的体积可提高分析物的萃取效率[17]。本试验考察了水样体积为5.0、8.0、10.0和15.0mL时对富集倍数和回收率的影响,水样体积与富集倍数、回收率的关系如图 4所示。随水样体积从5.0 mL增加到15.0 mL,回收率缓慢变小,富集倍数则一直升高。水样体积为10.0 mL时,4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚的回收率分别为79%和86%;水样体积继续增大,回收率下降较快。为了得到较高的回收率,同时使方法的富集倍数足够大,最终选择水样体积为10.0 mL。

图 4 水样体积对萃取回收率和富集倍数的影响(n＝3) Fig. 4 Effect of the volume of samples on the extraction recoveries and the enrichment factors (n＝3) Conditions: sample volume,5.0-15.0 mL; salt addition,3.0 g NaCl; extractant volume,100 μL; 25%-28% NH4OH,110 μL; 98% H2SO4,0.8 mL.
2.5 方法验证

本实验最佳萃取条件为:10.0mL水样(含1.0 mL乙醇),100 μL辛酸,110 μL 25%～28%氨水,0.8 mL 98%浓硫酸,3.0 g NaCl。向10.0 mL水样中添加5个水平(0.02～1.0 mg/L)的目标化合物,在最佳条件下萃取,每个浓度重复3次,结果见表 1。由表 1可知,4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚在0.02～1.0 mg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数分别为0.9997和0.9999。向纯水中添加0.02 mg/L的目标化合物进行精密度试验,重复3次,得到相对标准偏差为6.2%和3.5%。方法的检出限为6.33 μg/L和5.81 μg/L,富集倍数为79和86。

表 1 4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚的线性方程、线性范围、相关系数、相对标准偏差、检出限和富集倍数(n=3) Table 1 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients,relative standard deviations (RSDs), limits of detection (LODs) and enrichment factors (EFs) of 4-EP and 4-EG (n=3)
2.6 与其他方法的比较

表 2比较了本方法与其他方法在检出限、样品前处理所需的时间、样品体积和加标回收率方面的差别。因紫外检测器的灵敏度远低于质谱分析的灵敏度,本试验所建方法的检出限高于DLLME-GC-MS和USAEME-GC-MS/MS等的前处理方法;本方法的加标回收率与以前的方法相比处于相同水平;本方法的萃取时间仅需4 min,操作过程比常规DLLME方法更为简单。

表 2 本方法与其他方法的溶剂、检出限、萃取时间、样品量和回收率的比较 Table 2 Comparison of solvents used,LODs,extraction time,volumes of the sample and recoveries of this method and other methods
2.7 实际样品分析

为验证方法的可行性,将白葡萄酒和啤酒样品作为实际样品,经0.45 μm微孔滤膜过滤后,在最佳条件下对两种样品进行分析,结果如图 5所示,白葡萄酒样品中未检出目标化合物,啤酒中检出4-乙基愈创木酚含量为25.3μg/L。计算得到方法的加标回收率和精密度(见表 3),每个样品平行测定3次,实际样品的加标回收率为81.4%～108.7%,相对标准偏差为2.7%～8.9%。

图 5 实际样品经FA-DLLME-SFO萃取后的色谱图 Fig. 5 Chromatograms of real samples after the extraction with FA-DLLME-SFO a. a white wine sample spiked with 125 μg/L of 4-EP and 4-EG; b. a non-spiked white wine sample; c. a beer sample spiked with 125 μg/L of 4-EP and 4-EG; d. a non-spiked beer sample.
表 3 实际样品中4-EP and 4-EG的加标回收率及相对标准偏差(n＝3) Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 4-EP and 4-EG spiked in real samples (n＝3)
3 结论

本文对FA-IT-DLLME前处理方法的萃取剂收集过程进行了简化,建立了FA-DLLME-SFO方法,考察了萃取剂的种类和体积、氨水和硫酸的用量、盐的加入量及水样的体积对萃取效率的影响,并与HPLC联用进行检测,为酒类样品中4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚提供了一种新的检测方法。该方法操作简单、快速,所用试剂仅有脂肪酸、氨水和硫酸,对环境友好。

参考文献
[1] Larcher R, Nicolini G, Puecher C, et al, Anal Chim Acta,2007, 582 :55. doi:10.1016/j.aca.2006.08.056 ()
[2] López R, Aznar M, Cacho J, et al, J Chromatogr A,2002, 966 :167. doi:10.1016/S0021-9673(02)00696-9 ()
[3] Domínguez C, Guillén D A, Barroso C G, Anal Chim Acta,2002, 458 :95. doi:10.1016/S0003-2670(01)01581-1 ()
[4] Pizarro C, Sáenz-González C, Pérez-del-Notario N, et al, J Chromatogr A,2011, 1218 :1576. doi:10.1016/j.chroma.2011.01.055 ()
[5] Pizarro C, Sáenz-González C, Pérez-del-Notario N, et al, J Chromatogr A,2012, 1244 :37. doi:10.1016/j.chroma.2012.04.070 ()
[6] Rezaee M, Assadi Y, Milani Hosseini M R, et al, J Chromatogr A,2006, 1116 :1. doi:10.1016/j.chroma.2006.03.007 ()
[7] Leong M I, Huang S D, J Chromatogr A,2008, 1211 :8. doi:10.1016/j.chroma.2008.09.111 ()
[8] Khalili Zanjani M R, Yamini Y, Shariati S, et al, Anal Chim Acta,2007, 585 :286. doi:10.1016/j.aca.2006.12.049 ()
[9] Asadi M, Dadfarnia S, Haji Shabani A M, et al, J Sep Sci,2015, 38 (14):2510. doi:10.1002/jssc.201500237 ()
[10] Asadi M, Haji Shabani A M, Dadfarnia S, et al, Chinese Jounal of Chromatography,2015, 33 (6):634. AsadiM, HajiShabani A M, DadfarniaS, 等, 色谱,2015, 33 (6):634. ()
[11] Wang Y, Zhu C H, Zou X L, et al, Chinese Jounal of Chromatography,2013, 31 (11):1076. 王宇, 朱成华, 邹晓莉, 等, 色谱,2013, 31 (11):1076. ()
[12] Wang J C, Zhang H J, Chen J P, et al, Chinese Jounal of Chromatography,2014, 32 (9):913. 王金成, 张海军, 陈吉平, 等, 色谱,2014, 32 (9):913. ()
[13] Shih H K, Shu T Y, Ponnusamy V K, et al, Anal Chim Acta,2015, 854 :70. doi:10.1016/j.aca.2014.11.021 ()
[14] Vakh C, Pochivalov A, Andruch V, et al, Anal Chim Acta,2016, 907 :54. doi:10.1016/j.aca.2015.12.004 ()
[15] Moradi M, Yamini Y, Esrafili A, et al, Talanta,2010, 82 :1864. doi:10.1016/j.talanta.2010.08.002 ()
[16] Wu C X, Liu N, Wu Q H, et al, Anal Chim Acta,2010, 679 :56. doi:10.1016/j.aca.2010.09.009 ()
[17] Bai X H, Hu S, Chen X, Liquid-Phase Microextraction[M].1st ed. Beijing: Chemical Industry Press, 2013 白小红, 胡爽, 陈璇, 液相微萃取[M].1版. 北京: 化学工业出版社, 2013 ()
[18] Diez J, Dominguez C, Guilend D A, et al, J Chromatogr A,2004, 1025 :263. doi:10.1016/j.chroma.2003.10.073 ()
[19] Peng Q R, Dong R, Xun S, et al, Flavour Fragr J,2013, 28 :137. doi:10.1002/ffj.v28.3 ()
[20] Valente I M, Santos C M, Moreira M M, et al, J Chromatogr A,2013, 1271 :27. doi:10.1016/j.chroma.2012.11.026 ()
[21] Carpinteiro I, Abuín B, Rodríguez I, et al, J Chromatogr A,2012, 1229 :79. doi:10.1016/j.chroma.2012.01.044 ()