色谱  2016, Vol. 34 Issue (11): 1097-1105   PDF    
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气相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查食品中182种农药残留
伊雄海1, 时逸吟1, 赵善贞1, 孟令华1, 潘孝博2, 盛永刚1, 韩丽1, 朱坚1, 邓晓军1, 郭德华1     
1. 上海出入境检验检疫局, 上海 200135;
2. 上海海洋大学食品学院, 上海 201306
收稿日期：2016-06-30
基金项目：国家重大科学仪器设备开发专项（2013YQ15055705）；上海市技术性贸易措施应对专项（14TBT006，15TBT004，15TBT005）；上海市科委技术标准专项（15DZ0503201）；长三角科技合作项目（15395810100）
通讯联系人： 伊雄海, Tel:(021)38620517, E-mail:yixh@shciq.gov.cn
摘要：建立了气相色谱-四极杆-飞行时间质谱同时筛查食品中182种香港《食物内残余除害剂规例》农药残留的分析方法。样品经含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液提取，改进的QuEChERS方法净化，采用Agilent HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）进行分离。样品经电子轰击源电离，一级质谱采用全扫描模式完成化合物的定性和定量检测，对疑似物质进行二级谱库检索确证。考察了10种典型食品基质（大米、香菇、黄豆、菠菜、西红柿、西兰花、柚子、胡萝卜、生菜、黄瓜）的基质效应。在10~500 μg/kg范围内，182种目标化合物的线性关系良好（r>0.99），方法的定量限（S/N≥10）为10~100 μg/kg，在3个添加水平下的平均加标回收率分别为66.1%~121.5%、75.4%~125.8%、77.2%~128.9%，相对标准偏差（RSD）为0.8%~17.6%（n=6）。该方法操作简单、耗时短、灵敏度高、稳定性好，可显著降低日常筛查检测的成本，具有实际应用价值。
关键词： 气相色谱-四极杆-飞行时间质谱     筛查     农药残留     食品    
Rapid screening of 182 pesticide residues in foods by gas chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry
YI Xionghai1, SHI Yiyin1, ZHAO Shanzhen1, MENG Linghua1, PAN Xiaobo2, SHENG Yonggang1, HAN Li1, ZHU Jian1, DENG Xiaojun1, GUO Dehua1     
1. Shanghai Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China ;
2. College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Foundation Item: National Key Instrument Development Project (No. 2013YQ15055705); Shanghai Technical Barriers Trade Item (Nos. 14TBT006, 15TBT004, 15TBT005); Technical Standard Item of Shanghai Science and Technology Commission (No. 15DZ0503201); Yangtze River Delta Science and Technology Cooperation Project (No. 15395810100)
Abstract: A method for rapid screening of 182 pesticide residues in foods according to the Hongkong regulation was developed by gas chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry (GC-Q-TOF/MS). The target analytes were extracted by acetonitrile with 0.1% (v/v) formic acid, then purified by a modified QuEChERS method. The separation was performed on an Agilent HP-5MS column (30 m×0.25 μm×0.25 mm). The compounds were ionized under electron impact ion source. Qualitative and quantitative detection of compounds were completed by searching accurate mass database with full scan mode. Suspected compounds can be confirmed by the spectrum database of the secondary fragment ions. The matrix effects in 10 kinds of typical foods (rice, mushrooms, soybeans, spinaches, tomatoes, broccoli, grapefruits, carrots, lettuces, cucumbers) were evaluated. The results demonstrated that the linear ranges were from 10 to 500 μg/kg with good correlation coefficients (r>0.99). The limits of quantitation were in the range of 10-100 μg/kg (S/N≥10). The average recoveries at three spiked levels were in the range of 66.1%-121.5%, 75.4%-125.8%, 77.2%-128.9% with relative standard deviations (RSDs) of 0.8%-17.6% (n=6). The method is simple, sensitive and robust, as well as having practical application for its low costs.
Key words: gas chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (GC-Q-TOF/MS)     screening     pesticide residues     foods    

自2014年8月1日开始，香港实施了《食物内残余除害剂规例》(以下简称《规例》)，《规例》中规管农药数量360种、限量标准7 083个, 涉及584种(类)食品、农产品[1], 远超GB 2763-2014标准涉及的数量, 其中许多限量标准内地并未制定。中国内地是香港特区食品的主要供应地, 占香港进口总量的9成以上。《规例》的出台直接影响了内地对香港每年约47亿美元食品和农产品的供给，同时也对供港食品提出了更高的质量要求, 并对农药残留检测技术提出了挑战。针对香港《规例》中的目标物建立筛查检测方法, 为供港食品的监督检测提供技术支持, 也为我国内地还未在《规例》中规定残留限量的农药检测方法提供科学依据。

农药残留检测方法有气相色谱法[2]、液相色谱法[3]。气相色谱法主要对挥发性、半挥发性、弱极性等热稳定化合物进行分离与分析, 对液相色谱法无法分析的有机氯和菊酯类农药等有广泛应用, 但遇到结构相似、性质相近或含有同分异构体的物质, 因其保留时间相近而难以分离, 其灵敏度已不能满足国内外对某些残留物的限量要求, 且定性能力较弱。近年来, 色谱-质谱或色谱-串联质谱技术的灵敏度和定性能力逐步提升, 气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法已成为农药残留痕量分析的主流技术[4-6]。通过选择离子监测模式或多反应监测模式可实现多种化合物的同时定性和定量检测, 但受仪器扫描速度、灵敏度及分辨率的限制, 其检测通量有限且只适合已知目标物的检测, 无法满足复杂基质高通量快速筛查的需求[7]。随着高分辨质谱技术的发展, 飞行时间质谱凭借其质量范围宽、分辨率和质量测量精度高、灵敏度高、分析速度快等特点成为复杂背景下痕量化合物定性分析和快速高通量筛查确证的有效手段[8-10]。配合高通量、全质量数据采集以及谱库检索等功能可以快速、准确地对未知化合物进行筛查分析, 特别适用于在食品等复杂基质背景下的农药筛查和确证分析[11-18]。然而这些研究主要针对单一基质中多类化合物或多种基质中一类化合物的筛查, 且前处理步骤复杂、试剂用量大、检测周期长, 不能满足实际工作中多种复杂基质中跨类别化合物的非定向高通量筛查要求。

本研究根据目标物的性质, 采用改进的QuEChERS前处理方法, 建立了气相色谱-四极杆-飞行时间质谱(GC-Q-TOF/MS)同时测定香港《规例》中182种目标化合物在10种典型食品基质中残留的分析方法。该方法将GC-Q-TOF/MS的高分离定性能力与QuEChERS前处理快速、灵敏、高效的特点充分结合, 使其具有前处理操作简单、检测周期短、筛查通量高、定性准确等优点。该方法为多组分高通量筛查平台的建立提供了理论依据。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 7200气相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪, 配有电子轰击(EI)源(美国Agilent公司); PL602-L电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司); Allegra X-30R离心机(美国Beckman公司); Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。

182种农药标准品(纯度≥95%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司), 用丙酮配制成合适质量浓度的标准溶液; 十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)、N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)、石墨化炭黑(GCB)(上海安谱实验科技股份有限公司); 乙腈、甲醇均为HPLC纯(上海迪马科技有限公司); 乙酸铵、无水硫酸镁(MgSO4)、氯化钠(NaCl)、二水合柠檬酸钠、柠檬酸二钠盐均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司); 甲酸(纯度98%, 德国Fluka公司)。

1.2 色谱-质谱条件

Agilent HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m); 程序升温:60 ℃保持1 min，以40 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至310 ℃; 载气:氦气(纯度＞99.999%); 载气流速:1 mL/min; 进样口温度:280 ℃; 进样方式:脉冲不分流进样; 进样口脉冲压力:172.375 kPa; 脉冲时间:0.5 min; 进样量:2 μ L。

离子源为EI源; 电压为70 eV; 离子源温度为280 ℃; 传输线温度为280 ℃。数据采集方式:一级质谱为全扫描模式, 扫描范围为m/z 50～550;二级质谱为Target MS/MS模式, 扫描范围为m/z 50～550。碰撞能量为5～30 eV; 溶剂延迟为5 min; 采集频率为5 spectra/s。

1.3 样品前处理

称取10 g(精确至0.01 g)新鲜果蔬样品(谷物样品称取5.0 g, 加5 mL水)于50 mL塑料离心管中, 加入10 mL含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液进行提取, 依次快速加入4.0 g MgSO4、1.0 g NaCl、1.0 g二水合柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸二钠盐, 剧烈振荡1 min后, 静置5 min, 再次剧烈振荡1 min, 以4 500 r/min离心10 min, 准确移取上清液6 mL至15 mL离心管。

在上述装有上清液的离心管中加入150.0 mg C18、150.0 mg PSA、900.0 mg MgSO4和15.0 mg GCB粉末, 振荡混匀2 min, 以4 500 r/min离心5 min, 精确移取0.5 mL上述提取液, 用乙腈定容至1 mL, 过0.22 μ m有机相滤膜后, 上机检测。

1.4 数据库的建立

在优化的色谱条件下进样, 对182种化合物进行一级质谱全扫描, 获得目标物的保留时间(漂移≤±5%)、母离子、质量偏差(＜2×10-6)及离子化形式等信息。通过在PCDL数据库软件中输入每种农药的名称、保留时间、分子式、精确相对分子质量、CAS号, 建立182种化合物的一级精确质量数据库。

将目标物精确质量的母离子在不同碰撞能量下进行测定, 采集二级谱库所需的子离子信息, 通过PCDL软件, 建立化合物的二级信息谱库, 包括母离子、保留时间、不同碰撞能量下的二级全扫描质谱图。

2 结果与讨论
2.1 色谱柱的选择

本实验根据化合物的结构分类, 在有机氯、有机磷、拟除虫菊酯类及其他农用化学物中选择15种典型物质作为前处理技术优化的研究对象，考察了中等极性Agilent VF-1701MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m)和弱极性Agilent HP-5MS色谱柱的分离效果(见图 1)。结果表明, 大部分化合物在HP-5MS色谱柱上的保留比在VF-1701MS色谱柱上强, 如林丹在VF-1701MS和HP-5MS柱上的保留时间分别为7.9 min和15.5 min, 因为有机氯类农药多为弱极性物质, 在弱极性色谱柱上的保留效果更好。当筛查目标物较多、基质较复杂时, 增加化合物在色谱柱上的保留可避免共流出杂质对目标物定性和定量的干扰。因此本实验选用Agilent HP-5MS色谱柱进行实验。

图 1 15种典型化合物在(a)Agilent VF-1701MS色谱柱和(b)Agilent HP-5MS色谱柱上的色谱图 Fig. 1 Chromatograms of the 15 representative compounds on (a) an Agilent VF-1701MS and (b) an Agilent HP-5MS column 1. dichlorvos; 2. lindane; 3. chlorpyrifos-methyl; 4. diazinon; 5. tecnazene; 6. flusilazol; 7. bromacil; 8. heptachlor; 9. endosulfan; 10. flutolanil; 11. napropamide; 12. oxadiazon; 13. fenpropathrin; 14. bifenthrin; 15. metrafenone.
2.2 样品前处理的优化

以黄瓜基质中加入20 μ g/kg目标化合物的回收率为指标, 分别考察了甲醇、乙酸乙酯、乙腈和含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液对15种典型化合物提取效率的影响(见图 2)。结果表明, 采用甲醇提取时, 共提物的色素较少, 回收率为0～52.2%, 其中甲氰菊酯无法回收; 用乙酸乙酯提取时, 林丹、七氯和恶草酮的回收率为64.2%～67.6%;用乙腈提取时, 目标化合物的回收率为77.1%～124.9%;采用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液提取时, 15种化合物的回收率为91.4%～118.9%, 提取效果最佳。因此本实验选择含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂。

图 2 不同提取溶剂对15种典型化合物回收率的影响(n=6) Fig. 2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of the 15 representative compounds (n=6)

以黄瓜基质中15种典型化合物的平均回收率为判定依据, 通过设计L9(34) 4因素3水平的正交实验, 比较不同吸附剂(C18、PSA、GCB和MgSO4)的效应大小(见表 1)。结果表明, 影响回收率因素的主次顺序为GCB＞PSA＞MgSO4＞C18; 最佳净化组合为150.0 mg C18、150.0 mg PSA、900.0 mg MgSO4、15.0 mg GCB, 此时目标化合物的平均回收率最高, 净化效果最好。

表 1 吸附剂正交实验设计及结果 Table 1 Design and results of the orthogonal experiment for adsorbents
2.3 质谱条件的优化

一级质谱特征离子信息库的建立:TOF筛查数据库建立的关键是目标化合物碎片精确质量数的确定, 首先通过全扫描确定化合物的保留时间, 去除背景后得到化合物的质谱图, 通过数据处理系统对采集的数据进行分析, 再结合化合物的结构、裂解原理, 得到目标化合物的元素组成及其对应的理论精确质量数。每种农药包含多个特征离子, 182种化合物相对丰度较高的2个特征离子信息见表 2。依据所建立的方法和一级特征离子信息库, 可在没有标准物质的情况下实现对样品的分析, 利用精确质量数、保留时间、相对丰度比等相关信息实现对目标化合物的快速定性及准确定量。

表 2 182种化合物的分子式、保留时间、质谱信息和定量限 Table 2 Formulas, retention times (tR), MS information and LOQs of the 182 compounds

二级质谱信息库的建立:在最佳条件下得到的每种物质的一级全扫描质谱图中, 选择1～2个特征离子作为母离子进行二级质谱信息采集, 原则如下:(1) 选择分子离子峰; (2) 选择相对丰度较高的碎片离子峰。由于大多数农药的相对分子质量较小, 在EI源等硬电离源电离的情况下, 往往无法获得分子离子峰, 此时可选择相对丰度较大且结构解析合理的离子作为二级优化的母离子。根据不同碰撞能量下母离子的碎裂程度, 选择二级质谱图下母离子特征离子明显、碎片离子分布均匀、响应良好的碰撞能量作为最佳碰撞能量。

二级质谱定性确证:对目标物进行一级精确质量质谱分析, 会出现假阳性结果的可能, 此时需对疑似化合物进行二级子离子信息的确证。在Targeted MS/MS模式下, 输入疑似目标物的母离子、保留时间及最佳碰撞能量, 测定结果用二级质谱库检索, 根据欧盟SANTE/11945/2015决议, 当有2个或2个以上的特征离子匹配, 则可确证为目标物。在确证的过程中为排除杂质离子对检索的干扰, 需进行背景扣除, 七氯在黄瓜样品中背景扣除前后的镜像比对图见图 3。在样品背景中含有m/z 140.904 6的干扰离子, 从而使碎片离子的比例发生改变, 造成匹配检索结果的分值过低。扣除背景后, 干扰离子被排除, 子离子的相对比例正常, 提高了匹配分值。这样可以直接通过谱图检索得分情况来对化合物进行确证, 而不用对子离子进行手动匹配排查, 节约了数据处理时间。

图 3 黄瓜样品中七氯扣除背景(a)前、(b)后的碎片离子镜像信息对比图 Fig. 3 Comparison of the spectral differences of (a) before and (b) after background subtraction of heptachlor in a cucumber sample
2.4 基质效应

采用气相色谱-质谱法时，基质效应主要由与分析物共流出的组分所致, 可表现为基质增强和基质抑制效应。本实验考察了10种典型食品基质(大米、香菇、黄豆、菠菜、西红柿、西兰花、柚子、胡萝卜、生菜、黄瓜)的基质效应, 比较目标物在纯试剂和基质液中的峰面积, 得到基质响应相对强度(ME)=(基质标准样品的峰面积/试剂标准样品的峰面积)×100%。联苯菊酯、甲氰菊酯、敌敌畏、二嗪磷、甲基毒死蜱、七氯在柚子、胡萝卜、生菜、西兰花、菠菜基质中的ME＞120%, 表现为基质增强效应; 硫丹在黄豆中的ME＜70%, 在其余9种基质中为80%＜ME＜120%, 基质效应不明显; 在黄豆和大米基质中, 有7种目标物的ME＜70%, 表现为基质抑制效应。考虑到前处理成本和方法可操作性等, 本实验选用基质匹配溶液校正基质效应, 不仅前处理步骤简单，灵敏度和回收率等指标也可满足方法学要求。

2.5 方法学验证

配制空白基质标准溶液，以峰面积(Y)为纵坐标, 相应含量(X, μ g/kg)为横坐标, 绘制标准曲线, 各目标化合物在10～500 μ g/kg范围内线性关系良好, 相关系数(r)均大于0.99。在基质空白样品中添加标准溶液, 以S/N≥10确定方法的定量限。结果表明, 在多个食品基质中, 有114种目标物的定量限为10 μ g/kg, 49种目标物的定量限为20 μ g/kg, 13种目标物的定量限为50 μ g/kg, 6种目标物的定量限为100 μ g/kg(见表 2)。

选择高含水量的蔬菜, 低水分、低脂肪、高淀粉的谷物类, 高酸、高含水量的柑橘类水果等10种食品基质(大米、香菇、黄豆、菠菜、西红柿、西兰花、柚子、胡萝卜、生菜、黄瓜)，考察方法的准确性。在上述空白基质中进行低、中、高3个水平的加标回收率试验, 在优化的条件下测定, 每个添加水平做6个平行试验。182种化合物在3个添加水平下的平均回收率分别为66.1%～121.5%、75.4%～125.8%、77.2%～128.9%, 相对标准偏差(RSD)为0.8%～17.6%(n=6)。黄瓜基质中182种化合物的加标回收率见附表 1(详见http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/1606056-SI.pdf)。

2.6 实际样品测定

对市售的500例水果蔬菜进行检测, 其中329例样品检出农药残留, 检出率为65.8%。果蔬中草莓、葡萄、辣椒、茶叶、圆葱、菠菜、葱、西兰花、青菜等样品的农药检出率较高；农药检出频率较高的为噻嗪酮、杀扑磷、氟虫腈、毒死蜱、溴虫腈、哒螨灵、腐霉利、水胺硫磷、乐果、稻丰散、甲氰菊酯、马拉硫磷、氯氟氰菊酯、稻虱净、噻虫嗪、莠灭净、多效唑、哒螨酮、甲霜灵、吡氟氯禾灵、辛硫磷、乙酰甲胺磷、氟乐灵、联苯菊酯、三氯杀螨醇、六六六等农用化学物质, 但未检测到农药残留超标的样品。

3 结论

本文建立了针对香港《规例》中182种化合物的GC-Q-TOF/MS筛查与确证的分析方法。同时对提取试剂、净化吸附剂组合、质谱条件等进行优化, 并对基质效应进行了评价。本实验将QuEChERS前处理与飞行时间质谱检测结合, 可实现10种食品基质中目标化合物的快速、高通量筛查分析。方法性能指标符合国际痕量分析的规定, 显著提高了多残留的检测效率和检测结果的准确度。

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