色谱  2016, Vol. 34 Issue (11): 1084-1090   PDF    
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袁晓鹰
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惠希东
苏征
金伟
刘冰
梯度淋洗-电导抑制离子色谱法同时测定果汁中26种有机酸和阴离子
宋卫得1, 袁晓鹰1, 吕宁2, 陈太法1, 惠希东1, 苏征1, 金伟1, 刘冰1     
1. 日照出入境检验检疫局, 山东 日照 276826;
2. 山东出入境检验检疫局, 山东 青岛 266002
收稿日期：2016-06-30
基金项目：山东出入境检验检疫局科研项目（SK201619）
通讯联系人： 宋卫得, E-mail:woxinyh2006@163.com
摘要：通过对色谱柱类型、流速、柱温、pH值、淋洗液浓度等影响因素的研究，建立了多级梯度淋洗-电导抑制离子色谱同时测定果汁中26种有机酸和阴离子的分析方法。结果表明，当流速为1.00 mL/min、柱温为30℃、pH值为5.5~6.8时，26种组分的测定结果更准确。26种组分在0.02~10.0 mg/L范围内具有良好的线性关系（r均大于0.995），检出限（S/N=3）为0.17~52.0 μg/L；在0.20~2.00 mg/L添加水平下的回收率为85.58%~108.86%，相对标准偏差为0.15%~7.65%（n=6）。该方法简便快速、灵敏度好、准确度高，适于果汁中26种组分的痕量分析。
关键词： 离子色谱     抑制电导检测     梯度淋洗     有机酸     阴离子     果汁    
Simultaneous determination of 26 organic acids and anions in fruit juice by ion chromatography with suppressed conductivity detection using gradient elution
SONG Weide1, YUAN Xiaoying1, LV Ning2, CHEN Taifa1, HUI Xidong1, SU Zheng1, JIN Wei1, LIU Bing1     
1. Rizhao Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau, Rizhao 276826, China ;
2. Shandong Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China
Foundation Item: Research Project of Shandong Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau (No. SK201619)
Abstract: A method for simultaneous determination of 26 organic acids and anions in fruit juice by ion chromatography (IC) with suppressed conductivity detection using gradient elution was established. The effects of selection of columns, flow rates, column temperatures, pH values of solution, and eluent concentrations were studied, and then the suitable gradient elution conditions were found for the determination. The testing results of the 26 components in fruit juice were accurate under the conditions that the flow rate was 1.00 mL/min, column temperature was 30℃ and pH values of the solution were in the range of 5.5-6.8. As a result, the linear relationships of the 26 components were good in the range of 0.02-10.0 mg/L and the correlation coefficients (r) were greater than 0.995, the limits of detection (S/N=3) of the 26 components were in the range of 0.17-52.0 μg/L. In the added levels of 0.20-2.00 mg/L, the recoveries of the 26 components in fruit juice ranged from 85.58% to 108.86%, and the relative standard deviations (RSDs) were in the range of 0.15%-7.65% (n=6). The method is simple, quick, sensitive and accurate, and it is absolutely suitable for the trace analysis and determination of the 26 organic acids and anions in fruit juice.
Key words: ion chromatography (IC)     suppressed conductivity detection     gradient elution     organic acids     anions     fruit juice    

果汁中富含人体所需的有机酸、维生素、微量元素等营养物质[1, 2], 在生产过程中常添加甜味剂、防腐剂或其他食品添加剂来改善果汁的口味和延长保质期, 这些营养物质和添加物在果汁中常以有机酸和阴离子的形式存在。有机酸和阴离子是果汁的重要组成成分[3, 4], 有机酸的含量大小会直接影响果汁的口感和风味, 通过测定特征有机酸含量可以表征果汁的质量状况, 识别果汁的新鲜程度, 并可辨别果汁中是否掺假。阴离子是果汁自身含有或生产加工过程中引入的组分, 某些有毒有害阴离子(如NO2-、BrO3-)的含量过高会危害人体健康[5, 6], 甚至会在体内累积转化为致癌物, 可见果汁中有机酸和阴离子含量的检测至关重要。

目前果汁中有机酸和阴离子的监测项目有10多种, 如有机酸(GB/T 5009.157-2003, 苹果酸、柠檬酸、丁二酸)、防腐剂(GB/T 23495-2009, 苯甲酸)、添加剂(GB 5009.33-2010, 硝酸盐、亚硝酸盐)、阴离子(GB/T 5750.5-2006, F-、Cl-、NO3-)等，需采用不同的标准方法进行检测。采用不同的检测标准、前处理方法、色谱分析条件耗费资源多、检测效率低, 无法满足快速、多组分同时分析的绿色检测需求。因此, 研究并建立一种简便快速、绿色节能、多种有机酸和阴离子同时检测的方法具有重要的现实意义和应用价值。

目前有机酸的检测方法主要有气相色谱法[7]、液相色谱法[8, 9]、离子色谱法[10, 11]等分析方法。气相色谱法需要衍生等前处理步骤, 操作繁琐; 液相色谱法测定有机酸的研究较多, 具有快速、准确、选择性好等特点, 但不能同时检测有机酸和阴离子。离子色谱法具有简便、快速、灵敏、准确等优点[12-15], 是多种有机酸和阴离子同时测定的理想方法。目前离子色谱法同时测定果汁中有机酸和阴离子的研究较少, 且同时测定的组分数量不足10种[16], 说明离子色谱法在果汁中多组分的检测技术还有很大的发展空间。

本文采用电导抑制离子色谱法, 在多级梯度淋洗条件下, 通过考察多种影响因素, 建立了果汁中18种有机酸(D-奎尼酸、乳酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、乙酸、丙二酸、L-苹果酸、柠檬酸、戊二酸、马来酸、富马酸、苯甲酸、草酸、顺乌头酸、反乌头酸)和8种阴离子(F-、Cl-、NO3-、NO2-、ClO2-、BrO3-、PO43-、CrO42-)同时测定的方法, 实现了快速、绿色、多组分同时分析的目标。该方法选择性好、灵敏度高, 可为果汁的质量控制及真伪辨别提供技术参考。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

Dionex ICS2100离子色谱仪(美国ThermoFisher公司), 配备电导检测器和自动进样器(AS-DV)、ASRS 300电化学自动再生抑制器; Rotina 380R高速离心机(德国Hettich公司); ML802/02电子天平(瑞士梅特勒公司); Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

8种阴离子(F-、Cl-、NO3-、NO2-、ClO2-、BrO3-、PO43-、CrO42-)标准溶液(1 000 mg/L, 国家有色金属分析测试中心); 18种有机酸(D-奎尼酸、乳酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、乙酸、丙二酸、L-苹果酸、柠檬酸、戊二酸、马来酸、富马酸、苯甲酸、草酸、顺乌头酸、反乌头酸)为分析纯及以上级别(国药集团化学试剂有限公司); 氢氧化钾为分析纯(国药集团化学试剂有限公司); 超纯水(电阻率18.2 M Ω \5cm)。实际样品为市场上随机购买的常见果汁(苹果汁、葡萄汁、橙汁、桃汁、梨汁、混合果汁), 于4 ℃冷藏保存。

1.2 色谱条件

阴离子分离柱:Dionex IonPacTMAS11-HC(250 mm×4 mm)，保护柱:Dionex IonPacTMAG11-HC(50 mm×4 mm); 抑制器再生模式:外加水电导抑制检测器检测; 流动相:KOH梯度淋洗液; 流速:1.00 mL/min; 柱温:30 ℃; 进样量:50 μ L; 初始淋洗浓度:1.25 mmol/L; 抑制器电流:174 mA。多级梯度淋洗条件见表 1。

表 1 离子色谱多级梯度淋洗条件 Table 1 Gradient elution conditions of ion chromatography
1.3 样品前处理

采用浓度为4.0 mol/L的KOH溶液调节果汁样品的pH值至5.5～6.8, 取调节过pH值的果汁样品(10 mL)于50 mL离心管中, 以10 000 r/min离心15 min, 取上清液1.0 mL至100 mL容量瓶中, 用超纯水定容至刻度, 摇匀、静置10 min, 取10.0 mL溶液, 过0.22 μ m水相滤膜, 弃去前3 mL, 收集后面的清液, 待上机检测。

1.4 标准溶液配制

称取适量标准物质用超纯水配制质量浓度为1 000 mg/L的标准混合储备液; 采用超纯水将标准混合储备液稀释成一定质量浓度的标准混合工作液, 于4 ℃避光冷藏保存, 现配现用。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的选择
2.1.1 色谱柱的选择

本实验分别考察了AS11、AS11-HC、AS19色谱柱(250 mm×4 mm)对分离效果的影响。采用AS11-HC色谱柱时, 多数组分的色谱峰峰形尖锐、灵敏度高, 综合分离效果最好。因为AS11-HC是强亲水性、高柱容量色谱柱, 对复杂基质中有机酸和阴离子具有较好的保留作用, 尤其适合多种有机酸和阴离子的同时分析。因此本实验最终选择AS11-HC色谱柱。

2.1.2 流速的选择

本实验考察了不同流速(0.50、0.75、1.00、1.25 mL/min)对目标物组分分离效果的影响。当流速为0.50 mL/min和0.75 mL/min时, 26种目标物的整体分离度较流速为1.00 mL/min时有所增大, 但总出峰时间由39 min增至50 min, 且随流速降低, 色谱峰峰宽增大, 灵敏度下降；当流速为1.25 mL/min时, 色谱峰的出峰时间减少, 但色谱系统压力达到了17.86 MPa, 已接近色谱系统的压力上限(20.68 MPa), 且较流速为1.00 mL/min时的压力(13.51 MPa)大幅升高，系统压力过大易造成色谱柱塌陷, 进而影响色谱柱的使用寿命, 也易造成色谱系统漏液, 不利于整个色谱系统运行的稳定性。综合考虑分离效果、检测时间、色谱系统稳定性等因素, 最终将流速设为1.00 mL/min。

2.1.3 梯度淋洗条件的选择

梯度淋洗条件是不同保留特性的离子在交换树脂上竞争吸附的重要影响因素。为提高检测灵敏度, 本实验考察了不同淋洗时间段、不同淋洗浓度、不同淋洗斜率对分离效果的影响, 并最终确定了梯度淋洗条件(见表 1)。在最优淋洗条件下, 0.50 mg/L的混合标准溶液的离子色谱图见图 1。研究发现, 淋洗液的初始浓度对26种目标组分的整体分离效果影响较大, 是整个梯度淋洗条件的基石。在0～8.0 min时, 考察了不同初始浓度(1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L)对前10种弱保留组分分离效果的影响。当初始浓度为1.00 mmol/L时, 目标组分的出峰时间长、灵敏度低; 初始浓度为1.50 mmol/L和2.00 mmol/L时, 10种弱保留组分不能完全分离; 初始浓度为1.25 mmol/L时, 10种组分的分离效果较理想, 因此将淋洗液的初始浓度设为1.25 mmol/L。在8.0～18.0 min, 浓度梯度斜率为1.375 mmol/min, 实现了BrO3-、Cl-、NO2-(组分11～13)的有效分离; 在18.0～29.0 min, 浓度梯度斜率为1.182 mmol/min, 主要针对戊二酸、苹果酸、丙二酸、马来酸、NO3-、草酸、富马酸、苯甲酸(组分14～21)8种中等保留组分的有效分离, 其中某些组分的离子半径相近、保留特性相似使分离难度大, 淋洗浓度斜率的微小变化便会导致8种组分出峰顺序发生改变或重叠; 在29.0～40.0 min, 分离测定的是PO43-、柠檬酸、顺乌头酸、CrO42-、反乌头酸(组分22～26)5种强保留组分, 因此浓度斜率设为3.818 mmol/min, 以快速提高淋洗液浓度, 确保5种组分的有效分离, 同时最大程度地节省分析时间。本实验尝试通过提高8.0～18.0 min时的梯度斜率来节省总检测时间，但梯度斜率过高时，无论如何调整18.0～29.0 min时的斜率都无法实现期间8种组分的完全分离, 说明前面梯度淋洗时间段的浓度和斜率会影响后面各组分的分离。由图 1可知, 26种组分的总体分离效果良好, 其中24种组分的分离度(R)大于1.2, 满足定性和定量分析的要求; 甲酸和丁酸(组分6和7)的分离效果不理想, 但二者的分离度大于1.0, 分离程度可达98%。

图 1 混合标准溶液(0.50 mg/L)的色谱图 Fig. 1 Chromatogram of mixed standard solution (0.50 mg/L) 1. D-quinic acid; 2. fluorin ion (F-); 3. lactic acid; 4. acetic acid; 5. propionic acid; 6. formic acid; 7. butyric acid; 8. pyruvic acid; 9. chlorite ion (ClO2-); 10. valeric acid; 11. bromate ion (BrO3-); 12. chloride ion (Cl-); 13. nitrite ion (NO2-); 14. glutaric acid; 15. L-malic acid; 16. malonic acid; 17. maleic acid; 18. nitrate ion (NO3-); 19. oxalic acid; 20. fumaric acid; 21. benzoic acid; 22. phosphate ion (PO43-); 23. citric acid; 24. cis-aconitic acid; 25. chromate ion (CrO42-); 26. trans-aconitic acid.
2.1.4 柱温的选择

柱温能够影响色谱柱的柱效、选择性、灵敏度和稳定性, 柱温的改变直接影响分离效果和分析速率。升高柱温, 色谱柱内离子交换速率随之提高, 有利于提高柱效、缩短分析时间, 但降低了分离选择性, 不利于组分间的分离。本文分别考察了在20、25、30、35 ℃柱温条件下26种组分的分离效果。结果表明, 当柱温为20 ℃和25 ℃时, 前7种组分无法有效分离, 总分析时间较长; 当柱温为35 ℃时, 离子交换速率提高, 柱效提高, 分析时间缩短, 但分离选择性降低, 特别是组分14～21的分离度明显减小, 无法确保定量的准确性。当柱温为30 ℃时, 分析速率适宜, 26种组分的总体分离效果最好。因此本实验将柱温设为30 ℃。

2.1.5 pH值对检测的影响

在配制标准溶液时, 随着有机酸浓度的增加, 溶液的酸性逐渐增强。当混合标准溶液的质量浓度从0.10 mg/L增至10.0 mg/L时, pH值由5.13降为3.56。移取相同量的标准储备液, 调节溶液酸性配制成不同pH值的标准溶液, 考察不同pH值对有机酸和阴离子检测含量的影响, 其中6种组分的检测含量受溶液pH值的影响较大(见图 2)。当pH值从2.6增至4.5时, 6种组分的检测含量逐渐增加, 其中ClO2-和NO2-的变化最为显著, 这是因为酸性较大时, 溶液中弱酸离子易与高浓度的H+结合生成分子状态或析出气体分子而损失, PO43-和CrO42-也易受高浓度H+的影响从而转化为其他离子态物质(HPO42-、H2PO4-、Cr2O72-), 相对来说乳酸和苯甲酸的含量变化最小。当pH值为4.5～6.8时, 8种阴离子受酸性影响较小, 含量稳定, 另外包括乳酸和苯甲酸在内的18种有机酸的检测含量较为稳定, 这是因为多数有机酸的pKa在4.5～6.8之间, 在弱酸性状态下, 恰好处于解离平衡状态, 溶液中离子含量稳定, 易于定量。当pH值大于8.5时, 6种组分的含量出现了明显的波动, 不利于定量分析。

图 2 溶液pH值对6种组分测定的影响 Fig. 2 Effect of pH value of the solution on the determination of the six components

调节pH值后, 混合标准溶液中弱酸根离子的线性得到了实质性的改进, 如在质量浓度0.10～5.0 mg/L范围内, ClO2-的相关系数由0.851提高至0.999, 显著提高了定量的准确性。测定标准品和样品前, 将溶液的pH值统一调至5.5～6.8, 可有效减小因pH值差异引起的检测含量偏差, 显著提高了有机酸和阴离子同时检测的灵敏度和准确性。因此本文实验最终选择pH值为5.5～6.8, 即弱酸性条件下进行实验测定。

2.2 方法学考察
2.2.1 线性范围与检出限

配制系列质量浓度的混合标准工作溶液, 以待测组分的峰面积(Y)为纵坐标, 质量浓度(X, mg/L)为横坐标, 绘制校准曲线; 通过色谱峰信噪比计算待测组分的检出限(S/N=3)。结果表明, 26种组分在0.02～10.0 mg/L范围内线性关系良好, 相关系数均大于0.995(见表 2)。25种组分的检出限为0.17～14.4 μ g/L, 苯甲酸的检出限为52.0 μ g/L, 远低于液相色谱法[17]中苯甲酸的LOD(1 800 μ g/kg)。

表 2 26种组分的线性范围、线性方程、相关系数(r)及检出限 Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r) and LODs of the 26 components
2.2.2 回收率与精密度

分别选取苹果汁、葡萄汁、橙汁各5个样品, 依次添加质量浓度为0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/L的混合标准溶液, 每个浓度水平进行6次平行试验, 计算检测不同果汁基质时方法的回收率和精密度(见表 3)。

表 3 26组分在不同添加水平下的回收率及精密度(n=6) Table 3 Recoveries and precisions of the 26 components at different added levels (n=6)

在0.10 mg/L添加水平下, 24种组分的回收率为85.17%～109.30%, 苯甲酸和顺乌头酸的回收率分别为62.23%和64.27%, 但仍满足食品理化检验技术要求[18](测定含量小于0.10 mg/L, 回收率应为60%～120%), 说明在低于0.10 mg/L添加水平时, 苯甲酸和顺乌头酸不够稳定、易受基质干扰, 检测时应通过改变稀释倍数等方法在高于0.20 mg/L水平下进行分析。在质量浓度为0.20～2.0 mg/L水平下, 26种组分的回收率为85.58%～108.86%, RSD为0.15%～7.65%, 说明该检测方法准确性高、精密度好。

2.2.3 准确度

向苹果汁中添加质量浓度为0.20 mg/L的标准溶液, 分3天进样, 每天进行3次平行样品测定, 计算回收率, 进而计算测定值和真值的相对偏差。结果表明, 26种组分的9次平行结果与理论真值的相对偏差在-13.82%～9.57%范围内, 符合食品理化检测规范中的准确度要求[18], 说明该方法稳定性好、准确度高。

2.3 实际样品测定

对6种果汁样品中的有机酸和阴离子进行含量测定(见表 4)。3种代表性果汁的色谱图见图 3。

表 4 6种果汁样品中有机酸和阴离子的含量 Table 4 Contents of organic acids and anions in the six fruit juice samples

图 3 3种果汁样品的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of the three fruit juice samples Nos. 1-24 are the same as in Table 2.

果汁中含有的葡萄糖、果糖、维生素等物质会对有机酸和阴离子的检测造成一定影响, 果汁样品的色谱图基线稳定, 峰形尖锐, 受干扰小, 说明该方法稳定性良好。从表 4可知, 果汁中含有的有机酸主要是柠檬酸、草酸、苹果酸、乳酸、乙酸、甲酸; 含有的无机离子主要是PO43-、NO3-、Cl-; 橙汁中有机酸种类和含量最丰富, 其次是苹果汁。其中具有致癌性和毒害性的阴离子(F-、BrO3-、CrO42-、ClO2-)均未检出, 说明6种果汁的原料和水质均较好。

3 结论

本文通过对流速、柱温、溶液pH值、淋洗浓度等多种实验影响因素的分析讨论, 建立了梯度淋洗-电导抑制离子色谱同时测定果汁中26种有机酸和阴离子的分析方法。在优化选择的条件下, 26种组分的分离测定结果令人满意, 完全适于果汁中26种有机酸和阴离子的痕量分析。作为一种绿色联合检测技术, 梯度淋洗-电导抑制离子色谱法实现了有机酸、防腐剂、阴离子、添加剂等多类组分共同检测的目标。但是在多种实验因素和多种基质的交互影响下, 如何进一步提高多组分同时检测时的分离度、准确度以及方法适用性必将成为该项色谱技术研究和发展的重要方向之一。

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