赭曲霉毒素是由曲霉菌和青霉菌产生的次级有毒代谢产物,包含7种结构类似的化合物,其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)在自然界中分布最广泛,毒性最强,对人类和动植物影响最大^[1]。OTA是一种稳定的无色结晶化合物(结构式见图 1),具有耐热性,易溶于稀的碳酸氢钠溶液和极性有机溶剂,微溶于水,在紫外照射下呈绿色荧光。研究表明,OTA不仅具有免疫毒性、肾毒性和肝毒性,还有致畸、致突变和致癌作用,国际癌症研究机构已将其定义为Group 2B类致癌物^{[2, 3]}。OTA虽以污染粮谷类农作物为主,但也经常能在许多啤酒、葡萄酒中检测到,国际葡萄酒组织(OIV)和欧盟地区法规中规定了葡萄酒中OTA限量标准为2.0 μg/kg,我国2013年在对食品安全国家标准《食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2011)中OTA指标的补充完善中提出了我国葡萄酒中赭曲霉毒素A限量标准为2.0μg/kg。目前,葡萄酒在我国已受到越来越多人的喜爱,并逐渐成为代替传统白酒的健康饮品,进口的葡萄酒量呈现逐年递增的态势。因此,亟须建立一种葡萄酒中OTA的快速大批量测定方法。

图 1

Fig. 1

图 1 赭曲霉毒素A的分子结构 Fig. 1 Molecular structure of ochratoxin A (OTA)

目前报道的检测OTA含量的方法主要有:薄层色谱法(TLC)^[4]、酶联免疫法(ELISA)^[5]、毛细管电泳法(CE)^[6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[7]、高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)^{[8, 9]}和高效液相色谱-串联质谱法^[10-13]等。TLC是较早用于毒素检测的一种方法,但是该方法灵敏度相对较差,所需试剂繁多、检测周期长、重现性不好等,已远远不能满足现代检测要求。ELISA是一种免疫化学检测方法,它具有灵敏、快速、简便的特性,适合于大批量样本的检测,但由于存在交叉反应而易造成假阳性,因此需要用其他的方法来验证。HPLC是目前最常用于OTA检测的方法,检测结果准确、可靠、灵敏度高、重现性好,但由于葡萄酒中的OTA含量较低,考虑到其成分复杂,前处理往往需要价格比较昂贵的免疫亲和柱。

实时直接分析(direct analysis in real time,DART)是一种快速解析和离子化技术^[14]。其原理是在环境空气条件下,载气(如氮气、氦气或氩气)经放电产生的激发态原子解吸并离子化样品中的分子,进而用质谱或串联质谱检测。相比于现行的液相色谱-质谱联用技术,实时直接分析-串联质谱(DART-MS/MS)分析不需要耗时的色谱分离,并且具有抗盐、抗溶剂、快速、绿色、便捷、广谱等优势^{[15, 16]}。采用合适的内标物可对样品进行定量、半定量分析,使结果具有更高的准确度。本文采用QuEChERS技术对样品进行简单的前处理,DART-MS/MS检测,建立了葡萄酒中OTA的检测方法,并与HPLC-ESI-MS/MS的检测结果进行了比较。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

质谱仪(AB Science Qtrap 5500);实时直接分析离子源(Ionsense DART);液相色谱(Waters UPLC);万分之一天平(Mettler,AE163);振荡器(IKA,MS1); 5 mL一次性注射器;0.45μm针头过滤器;离心机;氮吹仪(N-EVAP-111)。

OTA标准品质量浓度10.01 mg/L,U-[¹³C₂₀]-OTA标准品质量浓度10.08 mg/L,溶于乙腈中-20 ℃保存(购自Biopure公司,奥地利),乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯),水为Milli-Q超纯水,使用前过0.45μm滤膜;石墨化碳(GCB)、中性Al₂O₃(分析纯)、N-丙基乙二胺粉(PSA)、二甲基十八碳硅烷粉(ODS)、氨基粉(NH₂)均购自Agela Technologies公司(天津)。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 含有内标的定容液

准确移取适量的U-[¹³C₂₀]-赭曲霉毒素A内标,用甲醇-醋酸铵水溶液(50:50,v/v)配制成100μg/L的溶液(用时现配)。

1.2.2 标准溶液

准确移取适量的赭曲霉毒素A标准品,用1.2.1节得到的含有内标的定容液配制成质量浓度分别为1、2、4、10、20、50μg/L的标准工作液,其中内标质量浓度为4 μg/L。

1.3 样品前处理

取葡萄酒4 mL,加入80 μL 100 μg/L的赭曲霉毒素A内标溶液,加入1.0mol/L盐酸溶液2 mL,加入4 mL乙酸乙酯,旋涡振荡2 min,以10 000 r/min离心5 min,取上层乙酸乙酯层3 mL转移至试管中。加入200 mg ODS吸附剂于玻璃试管中,以2 000 r/min涡旋混匀2 min,取2 mL氮吹,甲醇-水(3:7,v/v)定容至1 mL,过0.22μm微孔滤膜,上机检测。

1.4 DART-ESI-MS/MS条件

1.4.1 DART条件

DART参数:离子源、传送管间距25mm;电晕针电压4 000 V;氦气体积流量4 L/min;气流温度350 ℃;出口电极偏转电压+100 V。

1.4.2 质谱条件

电离方式:ESI⁺;扫描方式:多反应监测(MRM);电喷雾电压:5 500 V;雾化气压力(GS1): 379 kPa (55 psi);气帘气压力(CUR):241 kPa (35 psi);辅助气压力(GS2): 345 kPa (50 psi);气流温度350 ℃。定量离子m/z 404.0/239.0;定性离子m/z 404.0/221.0;赭曲霉毒素A的同位素内标m/z 424.0/250.2

1.5 HPLC-ESI-MS/MS条件

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱(100 mm×3.0mm,1.8μm);柱温:40 ℃;流速:0.3 mL/min;进样量:10 μL;流动相:A,0.1%(v/v)甲酸水;B,甲醇;梯度洗脱程序:0~2.0 min,10%B; 2.0~6.0 min,10%B~90%B; 6.0~9.0 min,90%B; 9.0~12.0 min,10%B,平衡3 min。

1.5.2 质谱条件

同1.4.2节。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

用于提取目标组分的试剂一般包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等。本实验通过在葡萄酒中添加目标物,提取后直接上机检测的方法分别对乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷3种提取剂的提取效果进行考察。结果发现,二氯甲烷、三氯甲烷作为提取剂时的回收率均小于40%;乙酸乙酯作为提取剂时回收率较高,大于80%,并且毒性小较易浓缩。故本实验选用乙酸乙酯为提取剂。

2.2 净化条件的选择

葡萄酒样品中因含有大量的色素等杂质,需对粗提液进行进一步净化处理。Zhang等^[10]采用了微固相萃取法检测赭曲霉毒素A; Wang等^[11]采用了固相萃取法同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A。本文采用QuEChERS技术对样品进行净化^[17-19],QuEChERS技术是2003年由美国化学家Steven J. Lehotay和德国的Michelangelo Anastassiadas提出的一种快速、简单、低成本的样品处理方法^{[20, 21]},该方法采用分散固相萃取(dispersive-SPE)净化法,即在提取液中直接加入吸附剂粉进行净化,经离心后取上清液进行检测。

2.2.1 各种吸附剂粉对回收率的影响

为了选择合适的吸附剂,首先考察了各种吸附剂粉对回收率的影响。样品经乙酸乙酯提取后,取3 mL乙酸乙酯层分别加入200 mg不同的吸附剂,经振荡、离心后,取2 mL上清液,氮吹,定容至1 mL,进行测定,重复6次试验,计算平均回收率,结果见图 2。由图 2可以看出,ODS对目标物的吸附较少,同时又可以很好地吸附脂肪酸、维生素、色素、甾醇等杂质,因此选择ODS作为最终的吸附剂。

图 2

Fig. 2

图 2 不同吸附剂对OTA回收率的影响(n=6) Fig. 2 Recoveries of OTA adsorbed by different sorbents (n=6)

2.2.2 提取后添加法考察基质效应的影响

采用乙酸乙酯提取后,取3 mL乙酸乙酯层转移至试管中加入标准品,加入200 mg不同的吸附剂于玻璃试管中,以2 000 r/min涡旋混匀2 min,取2 mL氮吹,用甲醇-水(3:7,v/v)定容至1 mL,过0.22μm微孔滤膜,上机检测,试验重复6次。比较不同条件下的回收率,基质效应(ME)=S₂/S₁(其中S₁为纯标准品的响应值,S₂为空白基质提取后添加标准品的响应值),结果显示空白基质的ME值为41.1%,说明红酒样品中的基质抑制效应比较强,提取后添加OTA标准品的回收率仅为41.1%,经过GCB、Al₂O₃、ODS、NH₂、PSA净化之后的ME值分别为8.4%、30.4%、62.3%、0.56%、0.86%,说明经过ODS净化后去除了一部分杂质的干扰,显著地提高了回收率,减少了基质效应。

2.3 DART-MS/MS条件的考察

2.3.1 前处理的必要性及离子的选择

DART技术的优势在于对某些样品进行定性检测时,不需要流动相,不需要色谱分离,交叉污染很小,而且样品前处理简单,整个分析过程会更快速、经济。为考察直接上样检测的可行性,通过12-DIP-it sampler进样模块分别进样质量浓度为2.0 μg/L的标准品、葡萄酒空白样品、添加水平为2.0 μg/kg的葡萄酒样品,每个样品各进样两次,从图 3中可以看出,3个样品中都出现了m/z 404.0/193.0的离子,说明m/z 404.0/193.0的离子存在干扰;添加水平为2.0 μg/kg的葡萄酒样品没有出现m/z 404.0/239.0和m/z 404.0/221.0这两对离子,说明基质抑制效应很强。因此得出如下两个结论:1)直接进样葡萄酒样品无法达到检测的目的;2)在DART-MS/MS方式下,选择m/z 404.0/239.0作为定量离子,m/z 404.0/221.0作为定性离子。

图 3

Fig. 3

图 3 DART-MS/MS检测不同样品的提取离子流图 Fig. 3 MRM chromatograms of different samples using DART-MS/MS TIC: total ion current. DART: direct analysis in real time. 1. OTA standard of 2.0 μg/L; 2. blank wine sample; 3. blank wine spiked with 2.0 μg/kg OTA.

2.3.2 DART离子源温度的影响

气流温度会影响待测物的离子化效率,是DART源的关键参数,分别采用100、150、200、250、300、350、400、450、500 ℃进行检测。选取m/z 404.0/239.0离子对进行检测,信号强度变化如图 4所示,在350 ℃时,信号强度最大。

图 4

Fig. 4

图 4 不同DART气流温度下OTA的响应值(n=6) Fig. 4 OTA response at different temperatures of DART gas flow (n=6)

2.4 线性范围、定量限、回收率和精密度

2.4.1 标准曲线和线性关系

以待测化合物和内标的峰面积比值为纵坐标(Y)、待测化合物的标示浓度为横坐标(X,μg/L)进行线性回归分析,得到线性回归方程和相关系数(r)。 DART-MS/MS:在1～50 μg/L范围内,线性关系良好,回归方程为Y=0.202X+0.026 9,r为0.994 5;HPLC-MS/MS:在1～50 μg/L范围内,线性关系良好,回归方程为Y=0.199X+0.126,r为0.999 7。

2.4.2 回收率、精密度和定量限

用空白样品加标方法进行回收率和精密度实验。分别对葡萄酒进行1.0、2.0、10 μg/kg加标水平的回收率测定,每个水平平行测定7次,计算回收率和相对标准偏差,定量限根据10倍信噪比计算得出。DART-MS/MS:回收率为88.7%～105.7%,RSD为8.5%～12.8%,定量限为0.5 μg/kg,添加水平为2.0 μg/kg葡萄酒样品中赭曲霉毒素A的MRM谱图见图 5。HPLC-ESI-MS/MS:回收率为94.3%～102.6%,RSD为6.8%～9.7%,定量限为0.1 μg/kg,添加水平为2.0 μg/kg葡萄酒样品中赭曲霉毒素A的MRM谱图见图 6。

图 5

Fig. 5

图 5 DART-MS/MS检测葡萄酒样品中添加2.0 μg/kg OTA的MRM谱图 Fig. 5 MRM chromatograms of a blank wine spiked with 2.0 μg/kg OTA using DART-MS/MS

图 6

Fig. 6

图 6 HPLC-ESI-MS/MS检测葡萄酒样品中添加2.0 μg/kgOTA的MRM谱图 Fig. 6 MRM chromatograms of a blank wine spiked with 2.0 μg/kg OTA using HPLC-ESI-MS/MS

2.5 实际样品的检测

前处理方法参照1.3节,分别采用DART-MS/MS和HPLC-MS/MS进行定量测定,结果见图 7和图 8。 DART-MS/MS得到的结果为2.87 μg/kg,HPLC-ESI-MS/MS法得到的结果为3.15 μg/kg,偏差为8.9%,说明两种方法的结果基本吻合,可以满足实际样品的准确定量检测。

图 7

Fig. 7

图 7 DART-MS/MS检测阳性样品的MRM谱图 Fig. 7 MRM chromatograms of a positive sample using DART-MS/MS

图 8

Fig. 8

图 8 HPLC-ESI-MS/MS检测阳性样品的MRM谱图 Fig. 8 MRM chromatograms of a positive sample using HPLC-ESI-MS/MS

3 结语

本文利用QuEChERS技术对样品进行前处理,采用DART-MS/MS进行检测,建立了葡萄酒中OTA的检测方法。该方法仅需要简单的前处理,直接进样分析,无需色谱分离,节省了时间,减少了试剂的耗费,非常适用于葡萄酒中OTA的快速大批量的检测。

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