基于微流控芯片的乳腺癌细胞微环境酸化检测


扩展功能
	加入收藏夹

	复制引文信息

	加入引用管理器

	Email Alert

	RSS
本文作者相关文章
	严伟

	徐德顺

	查赟峰

	吴晓芳

严伟, 徐德顺, 查赟峰, 吴晓芳

湖州市疾病预防控制中心, 浙江湖州 313000

收稿日期：2016-07-09

通讯联系人：吴晓芳, E-mail:y1515038@163.com

摘要：建立了基于微流控芯片的乳腺癌微环境酸化模型和动态检测微环境酸化情况的分析方法。设计了一种多层复合式微流控芯片，将乳腺癌细胞悬液引入含有水凝胶前体的芯片培养室后，在硝酸纤维素薄膜上固化形成3D培养支架。芯片通道连续灌流模拟血流供应，并将非电化学的pH检测器引入芯片，通过图像分析得到实时的pH变化。通过观察癌细胞的存活率、增殖率、乳酸水平及pH值，分析微环境的酸化情况，同时与正常细胞进行比较。结果表明，连续灌流培养7 d，乳腺癌细胞的存活率保持在90%以上；随着培养天数的增加，芯片上癌细胞微环境的pH值逐渐降低，且灌流速度越低，pH值下降越明显，而正常细胞微环境的pH值无明显变化。基于微流控芯片的微环境酸化检测平台可实时动态检测微环境的pH值，有望成为相关肿瘤研究的有力工具。

关键词：微流控芯片细胞微环境酸化乳腺癌

Detection of microenvironment acidification in breast cancer cells by microfluidic chips

YAN Wei, XU Deshun, ZHA Yunfeng, WU Xiaofang

Huzhou Center for Disease Control and Prevention, Huzhou 313000, China

Abstract: An analytical method was established for dynamic detection of microenvironment acidification in a breast cancer cell model based on microfluidic chips. A multilayer hybrid microfluidic chip was designed. When the suspension of the breast cancer cells entered the chips the hydrogel grids would become skeleton for 3D cultures. Continuous perfusion in microfluidic chip channels was used to mimic blood flow in vivo. And the non-electrochemical pH sensor was introduced into the chips to give the real-time changes of pH by image analysis. Cell viabilities, cell proliferations, lactic acid levels and pH values of cancer cells were detected to analyze microenvironment acidification, while comparing with the normal cells. Continuous perfusion for 7 d, the cell viability remained above 90%. With the increase of culturing days, the pH of the tumor microenvironment decreased gradually. The lower perfusion rates, the lower pH values, but the pH of the normal cells microenvironment had no obvious change. The microenvironment acidification detection platform of the microfluidic chip could detect microenvironment pH in real time, and it is a useful tool for cancer research.

Key words: microfluidic chips cellular microenvironment acidification breast cancer

细胞微环境酸化是恶性肿瘤的特征之一, 与正常细胞的氧化磷酸化代谢途径不同, 肿瘤细胞的代谢方式主要为糖酵解^[1], 其代谢终产物以乳酸为主。乳酸的大量产生及排泄障碍使肿瘤细胞处于较低的pH微环境中^[2]。肿瘤微环境的酸化不仅影响癌细胞的代谢和迁移^{[3, 4]}，而且影响化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用^{[5, 6]}。因此, 建立肿瘤微环境酸化实时监测模型对肿瘤的代谢和治疗具有重要意义。

肿瘤细胞的生长环境空间狭小、液体量少, 其pH值难以用传统的电化学pH计测出。目前, 微量pH检测方法主要包括pH敏感微电极法、pH敏感荧光染料法和核磁共振法等^[7-9]方法, 这些方法需要特殊的设备, 且操作复杂、成本昂贵, 很难在一般实验室中开展。现有的肿瘤微环境酸化检测方法缺少仿真3D结构, 不能模拟细胞的扩散屏障所导致的酸性代谢产物蓄积, 且难以实时检测, 结果偏差较大。

微流控芯片技术因具有结构设计灵活和规模集成的特点逐渐成为细胞研究的重要手段^[10]。本研究以微流控芯片为平台、海藻酸钠水凝胶为载体, 乳腺癌MCF-7细胞为研究对象, 成功构建了细胞生长的微环境。同时利用芯片通道的连续灌流模拟体内的微血管系统, 以及时提供营养、排除废物。同时将造价低廉的非电化学pH指示器引入微流控芯片中, 通过固定光源拍照, 将颜色信号转化为pH值, 实现对微环境pH值的实时监测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

IX81激光共聚焦显微镜、AU2700全自动生化分析仪(日本Olympus公司); 聚二甲基硅氧烷(PDMS)前体及引发剂(美国Dow Corning公司); 硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)薄膜(英国Whatman公司); FE20酸度计(瑞士梅特勒-托利多公司); TS-2A微量注射泵(中国保定兰格公司)。

吖啶橙(acridine orange, AO)、溴化乙锭(ethidium bromide, EB)(纯度99%, 美国Amresco公司); 乳腺癌MCF-7细胞、乳房BHL-100细胞(中科院广州生物医药与健康研究院提供); 海藻酸钠、明胶、胰蛋白酶、氯化钙(CaCl₂)、磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、百里酚蓝、酚酞、溴百里酚蓝、甲基红、氢氧化钠(NaOH)、磷酸盐缓冲液(PBS)、台盼蓝染液(分析纯, 上海生工公司); DMEM培养基、McCoy'A培养基(美国ThermoFisher公司); 所有溶液用二次灭菌的蒸馏水配制。

1.2 芯片制作

芯片采用标准软蚀刻加工技术, 即在玻璃板上旋涂SU8光胶, 然后遮蔽含有微通道图形的掩膜, 曝光及显影处理后得到SU8模具。在含有SU8结构的基板上浇注PDMS, 获得微结构。芯片包含3层结构(见图 1a), 顶层灌流通道的长、宽、高分别为4 cm、140 μ m、180 μ m, 中央厚度为220 μ m, 底部有一个6 mm×6 mm的方形凹槽, 通道末端为直径2.5 mm的圆形通孔, 作为pH检测口; 中间层有一个5 mm×5 mm的方形通孔, 作为细胞培养池; 底层是玻璃平板。中间层与底层结合将直径5 mm的纸片分装于中间层底面的凹槽内。中间层和底层等离子处理后封接, 中间层NC膜分别用0.1%(质量分数)明胶和2%(质量分数)海藻酸钠溶液处理并烘干, 与顶层封接后得到芯片。

图 1 (a)微流控芯片结构示意图及(b)拍照装置 Fig. 1 (a) Schematic representation of a microfluidic chip and (b) a photo device

1.3 芯片实验操作

先将微量注射器、毛细管和制备好的芯片于90 ℃烘烤1 h后, 置于紫外灯下照射过夜。乳腺癌MCF-7细胞在培养瓶中培养, 待细胞进入指数成长期后制成密度为1×10⁷ cell/mL的细胞悬液。将200 μ L细胞悬液缓慢注入芯片中, 排除多余液体后放入细胞培养箱培养2 h, 向芯片通道缓慢引入40 mmol/L CaCl₂, 引发海藻酸钠聚合, 以30 μ L/h的速度进行连续灌注培养(见图 2)。

图 2 芯片灌流示意图 Fig. 2 Schematic representation of perfusion in a chip a. perfusion of cell suspension; b. cell suspension in cell culture pools; c. perfusion of culture solutions; PDMS: polydimethylsiloxane.

1.4 细胞培养分析

细胞连续灌流培养5 d后, 将荧光染液AO-EB(1 : 1, v/v)注入芯片通道染色10 min后, 将芯片置于激光共聚焦显微镜下检测, 观察芯片培养池内部细胞的结构形态。同时为考察芯片灌流与普通静态培养的差异, 将相同数量的细胞放入培养皿中静态培养, 定期更换培养液, 于5 d后将其荧光染色，同芯片培养情况进行对比。

将细胞分别培养1～7 d后, 拆开芯片, 从细胞培养池中取出水凝胶微球于干净的离心管中, 加入生理盐水使水凝胶微球溶解, 再加入适量胰酶消化细胞团块, 以2 000 r/min离心1 min后, 沉淀重悬于200 μ L PBS溶液, 混匀, 滴加台盼蓝染液染色, 加入细胞计数板计数总细胞数及存活细胞数。细胞存活率为存活细胞数与总细胞数的百分比。细胞增殖率(p)是培养不同天数的细胞数(n_d)相对于前一天的细胞数(n_d-1)增加的比率, 即p=(n_d-n_d-1)/n_d-1×100%。

1.5 pH检测器构建

称取0.5 mg百里酚蓝、10 mg酚酞、6 mg溴百里酚蓝、1.2 mg甲基红，加入10 mL 95%(v/v)乙醇水溶液, 用0.01 mol/L NaOH滴定, 直至溶液变为绿色, 将此溶液作为指示剂。将指示剂定量滴入芯片通道出口的pH检测器后, 随pH值的不同而呈现不同颜色。将芯片插入带有固定光源的拍照装置(见图 1b)进行拍照后, 通过Photoshop CS2软件分析照片的红绿蓝色彩(RGB)模式值, 作标准曲线, 将光学数值转变为pH值, 从而实现pH值的测定。

1.6 微环境酸化检测

以30 μ L/h的灌流速度持续培养细胞, 分别收集1、2、3、4、5、6、7 d时的灌流液, 比较其乳酸水平和pH值的对应关系, 同时在相同的培养条件下比较乳腺癌MCF-7细胞和正常乳房BHL-100细胞在7 d内的微环境pH值的变化情况。同时通过降低灌流速度，考察其对微环境酸化情况的影响。

2 结果与讨论

2.1 3D肿瘤细胞微环境的模拟

2.1.1 肿瘤间质的模拟

明胶处理过的NC膜具有亲水作用, 在疏水性PDMS材料上形成亲水区, 一定浓度的细胞悬液通过通道灌流进入NC膜区域后, 在重力和表面张力的作用下迅速铺满整个细胞培养池。细胞悬液进入培养池后, 与NC膜上的海藻酸钠逐渐混合, 当接触到Ca²⁺时海藻酸钠固化为水凝胶微球, 为3D细胞培养提供支撑。水凝胶微球中的明胶和海藻酸钠含有选择素和整合素成分, 具有促进细胞黏附的作用。水凝胶微球为细胞生长提供了适宜的间质硬度及支撑、连接和营养作用, 同时可避免流体剪切力对细胞的伤害, 很好地模拟了体内肿瘤间质。

2.1.2 肿瘤实质的模拟

体内细胞均为3D立体式生长而非平面生长。将芯片进行灌流培养和静态培养，均培养1 d和5 d, 分别向各自细胞培养池中引入AO-EB(1 : 1, v/v)染液染色, 用激光共聚焦显微镜观察, 比较两种培养条件下细胞培养池中细胞与间质、细胞与细胞形态学结构的变化和不同(见图 3)。结果表明, 在灌流条件下, 培养1 d时, 乳腺癌细胞由于生长时间尚短并未聚集形成微球(图 3a); 而培养5 d时, 细胞聚集生长, 形成大小不等的微球(图 3b), 提示细胞呈3D立体式生长, 与体内细胞生长方式接近。而在静态条件下，培养1 d时(图 3c)与灌流培养相比, 二者无明显差别; 但随着培养时间的增加, 灌流培养与静态培养下的细胞虽然在成球速度上差别不大, 但细胞存活率明显提高(图 3d), 说明灌流培养比静态培养更接近体内细胞的生长状况。

图 3 细胞荧光染色图(放大倍数10×10) Fig. 3 Fluorescent staining photos of cells (magnification times for 10×10) a. perfusion culture for 1 d; b. perfusion culture for 5 d; c. static culture for 1 d; d. static culture for 5 d.

2.2 细胞生长分析

在灌流速度为30 μ L/h时, 分别连续培养1、3、5、7 d, 计算细胞的存活率; 在此条件下, 连续灌流培养7 d, 计算细胞的增殖率(见图 4)。结果表明, 随着培养时间的增加, 细胞存活率逐渐下降, 但一直保持在90%以上; 细胞在第1 d时的增殖率最高, 达到45%，随着培养天数的增加, 细胞增殖率逐渐下降, 但仍保持在20%以上。细胞的密度随着培养天数的增加而持续增加, 说明细胞在水凝胶微球中不断增殖, 与2D细胞培养相比, 由于营养成分和生长空间的限制, 倍增时间显著缓慢。

图 4 灌流培养下细胞的(a)存活率和(b)增殖率(n=3) Fig. 4 (a) Viability and (b) proliferation rates in perfusion culture of the cells (n=3)

2.3 微环境的酸化检测

将浓度为0.2 mol/L NaH₂PO₄和Na₂HPO₄按适当比例混合, 配制pH值为6.5～7.4的系列标准溶液。pH检测器中加入定量的指示剂和标准溶液后, 因pH值的不同而显示出不同颜色, 通过软件分析不同pH值对应的RGB模式中的红(R)、绿(G)、蓝(B)值。研究表明, R值与pH值的关系最为密切, 将R值取对数后与pH值绘制标准曲线(见图 5), 可获得不同颜色对应的pH值。

图 5 lg R与pH值的关系(n=3) Fig. 5 Relationship of lgR and pH (n=3) R: the value of red for RGB abbreviated for red, green and blue.

在灌流速度为30 μ L/h时, 连续培养乳腺癌MCF-7细胞7 d, 每天测定癌细胞的pH值和乳酸水平(见图 6)。结果表明, 随着培养天数的增加, 乳腺癌MCF-7细胞微环境的pH值逐渐下降; 在6 d时，逐渐形成一个相对稳定的酸化微环境, 肿瘤细胞在此酸化微环境下仍能正常增殖。在相同的条件下培养乳房BHL-100细胞, 其微环境的pH值始终保持在中性范围内(图 6b), 与肿瘤细胞形成鲜明对比。同时对比MCF-7细胞的pH值和乳酸水平, 发现二者之间存在显著关联(图 6c), 说明乳酸是引起pH值变化的重要原因。

图 6 乳腺癌和乳房细胞的微环境酸化情况(n=3) Fig. 6 Microenvironment acidification of breast cancer cells and breast cells (n=3) a. the breast cancer MCF-7 cell (30 μ L/h); b. the normal BHL-100 cell (30 μ L/h); c. the breast cancer MCF-7 cell (30 μ L/h); d. the breast cancer MCF-7 cell (6 μ L/h).

本实验考察了灌流速度对乳腺癌细胞微环境酸化情况的影响(见图 6d)。在不影响MCF-7细胞存活率的基础上, 将灌流速度降至6 μ L/h, 监测其在7 d内微环境的pH值, 由于营养物的供给和代谢物的排泄存在一定障碍, MCF-7细胞在3 d时就形成了相对稳定的酸化微环境。

3 结论

利用微流控芯片的特性可以实现对细胞微环境的有效模拟^{[11, 12]}和对微环境酸化进行实时监测。本实验借助海藻酸钠与Ca²⁺固化为水凝胶的特性, 为细胞生长提供支架, 构建3D细胞培养环境, 同时将价格低廉的非电化学pH检测器集成到芯片上, 实现对微环境pH值的实时监测。本实验建立的肿瘤细胞微环境酸化检测平台为动态监测肿瘤细胞周围酸碱度的变化、分析癌细胞耐药和转移提供了科学依据。

参考文献

[1]	Liu J, Huang Y R, Kumar A, et al, Biotechnol Adv, 2014, 32 (4): 693. Doi: 10.1016/j.biotechadv.2013.11.009
[2]	Peppicelli S, Bianchini F, Calorini L, Cancer Metastasis Rev, 2014, 33 (2/3): 823.
[3]	Joyce J A, Pollard J W, Nat Rev Cancer, 2009, 9 (4): 239. Doi: 10.1038/nrc2618
[4]	Moellering R E, Black K C, Krishnamurty C, et al, Clin Exp Metastasis, 2008, 25 (4): 411. Doi: 10.1007/s10585-008-9145-7
[5]	Wojtkowiak J W, Verduzco D, Schramm K J, et al, Mol Pharm, 2011, 8 (6): 2032. Doi: 10.1021/mp200292c
[6]	Shen M, Huang Y Z, Han L M, et al, J Control Release, 2012, 161 (3): 884. Doi: 10.1016/j.jconrel.2012.05.013
[7]	Egginton S, Taylor E W, Raven J A. Regulation of Tissue pH in Plants and Animals:A Reappraisal of Current Techniques. Cambridge:Cambridge University Press, 1999
[8]	Han J Y, Burgess K, Chem Rev, 2010, 110 (5): 2709. Doi: 10.1021/cr900249z
[9]	Cheng X F, Wu R H. MR-Based Methods for pH Measurement in Brain Tumors:Current Status and Clinical Potential, Diagnostic Techniques and Surgical Management of Brain Tumors. Rijeka:InTech Press, 2011
[10]	Du J H, Liu X, Xu X P, Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32 (1): 7. 杜晶辉, 刘旭, 徐小平, 色谱 , 2014, 32 (1) : 7. Doi: 10.3724/SP.J.1123.2013.08009
[11]	Toh Y C, Zhang C, Zhang J, et al, Lab Chip, 2007, 7 (3): 302. Doi: 10.1039/b614872g
[12]	Yan W, Zhang Q, Chen B, et al, Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41 (6): 822. 严伟, 张琼, 陈斌, 等, 分析化学 , 2013, 41 (6) : 822. Doi: 10.1016/S1872-2040(13)60661-1