色谱  2016, Vol. 34 Issue (10): 998-1004   PDF    
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赵博
邓美林
杨小珊
段云鹏
吴晓琴
屠大伟
分散固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中9种N-亚硝胺类化合物
赵博, 邓美林, 杨小珊, 段云鹏, 吴晓琴, 屠大伟     
重庆市食品药品检验检测研究院, 重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心, 重庆 401121
收稿日期：2016-07-10
基金项目：重庆市食品药品检验检测研究院资助项目（SNKY-2015-07）.
通讯联系人： Tel:(023)67952759,E-mail:fldml@163.com
摘要：建立了分散固相萃取-同位素稀释-气相色谱-串联质谱同时测定动物源性食品中9种N-亚硝胺的方法。样品用乙腈提取，上清液经分散固相萃取（dSPE）净化后浓缩。选用DB-WAX极性毛细管色谱柱对待测物进行分离，经EI源电离后以多反应监测（MRM）模式采集数据并做定性筛查和定量分析。9种N-亚硝胺在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，对4类典型的动物源性食品进行3个不同浓度的加标试验，平均回收率为62.5%~118%，RSD为2.11%~25.6%，检出限（LOD，S/N=3）为0.02~0.31 μg/kg。该方法成本低廉、灵敏可靠，适用于同时对动物源性食品中9种N-亚硝胺进行定性和定量测定。
关键词： 分散固相萃取     同位素稀释     气相色谱-串联质谱     N-亚硝胺     动物源性食品    
Determination of nine N-nitrosamines in animal derived foods by dispersive solid-phase extraction-gas chromatography-tandem mass spectrometry
ZHAO Bo, DENG Meilin, YANG Xiaoshan, DUAN Yunpeng, WU Xiaoqin, TU Dawei     
Chongqing Institute for Food and Drug Control; Chongqing Engineering Research Center for Pharmaceutical Process and Quality Control, Chongqing 401121, China
Received: 2016-07-10
Foundation Item: Support Program of Chongqing Institute for Food and Drug Control (No. SNKY-2015-07).
* Corresponding author. Tel:(023)67952759,E-mail:fldml@163.com
Abstract: A method has been developed and validated for the determination of nine N-nitrosamines in animal derived food using dispersive solid-phase extraction (dSPE) coupled with isotope dilution-gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). The samples were extracted by acetonitrile. The extracts were purified using mixed adsorbent by dSPE and then concentrated. The analytes were separated on a DB-WAX polar capillary column, and ionized by EI source. The data were collected by multiple reaction monitoring (MRM) mode, followed by qualitative screening and quantitative analysis. The correlation coefficients of linear calibration curves were over 0.99 in the corresponding linear ranges. Four kinds of typical animal derived foods were spiked at three levels. The average recoveries of the nine N-nitrosamines ranged from 62.5% to 118% with RSDs of 2.11%-25.6%. The limits of detection (LODs, S/N=3) were 0.02-0.31 μg/kg. The method is of low cost, sensitive, reliable, and suitable for the determination of nine N-nitrosamines in animal derived foods.
Key words: dispersive solid-phase extraction (dSPE)     isotope dilution     gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS)     N-nitrosamines     animal derived foods    

N-亚硝胺类化合物是国际公认的一类强致癌物,是四大食品污染物之一,目前已知的300种亚硝胺类化合物中,90%至少可诱导一种动物致癌。N-亚硝胺类化合物的前体物是亚硝酸盐、氮氧化物和胺类,这些物质广泛存在于食品中,至今还没有发现有一种动物对亚硝胺的致癌作用有抵抗力。近年来的研究表明人类胃癌和食管癌病与N-亚硝胺类化合物关系密切[1]。

目前《食品污染物限量》(GB 2762-2012)中规定N-亚硝基二甲胺(NDMA)在肉及肉制品(肉类罐头除外)中的含量≤3.0 μg/kg,水产制品(水产品罐头除外)中的含量≤4.0 μg/kg。推荐的检测方法GB/T 5009.26-2003中方法一需要专用的热能分析仪,方法二需要分辨率大于7 000的气相色谱-高分辨质谱仪,样品前处理复杂、耗时长,适宜范围较窄,且两种方法所用的色谱柱均为填充柱,而现在分析实验室大多配毛细管色谱柱和质谱检测器,上述两种方法已严重不适应实验室对N-亚硝胺类化合物常规检测的要求。

目前报道测定动物源性食品中N-亚硝胺的方法较少,研究多集中在非动物源性食品检测方面,主要使用气相色谱-单极质谱法[2-10]、气相色谱-氮磷检测法(GC-NPD)[11]、气相色谱-氢火焰检测法(GC-FID)[12]、气相色谱-热能分析法[13]、液相色谱-串联质谱法[14, 15]和液相色谱法[16]。采用气相色谱-单极质谱法易产生N-亚硝基二甲胺假阳性;气相色谱和液相色谱法灵敏度较低且难以实现确证分析;气相色谱-热能分析仪为专用设备,实际可操作性不强;液相色谱-串联质谱法对低质量数N-亚硝胺响应不足。气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)具有高特异性和高灵敏度,是目前针对低残留物质广泛采用的检测方法。

动物源性食品普遍油脂含量高,腌制肉制品色素含量高,凤爪、罐头等产品水含量高,传统的蒸馏法存在重现性差的缺点,而固相萃取法需不同功能的萃取柱对色素、油脂和水分进行净化,存在耗时长和成本高的不足。分散固相萃取(dSPE)具有简便、快速和廉价的特点,被广泛应用于植物性食品中多农药残留的检测,近年来国内外学者已将该技术引入到动物源性食品中兽药[17-23]和农药[24]的检测中。本文通过优化样品前处理及色谱-质谱条件,建立了分散固相萃取-同位素稀释-气相色谱-串联质谱同时快速测定动物源性制品中9种N-亚硝胺的方法,该方法适用的动物源性食品种类覆盖面广,提取净化效果好,成本低廉,灵敏度高,选择性好。采用同位素内标定量能有效消除基质效应,结果准确可靠,为动物源性食品检测提供了技术支持。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

SHIMADZU TQ8040三重四极杆质谱仪,配岛津GC-2010 plus气相色谱仪(日本岛津公司);Allegra X-30R离心机(美国贝克曼仪器有限公司); Vortex 2漩涡混合器(德国IKA仪器有限公司); MD200-2氮吹仪(杭州奥盛仪器设备有限公司);乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯(德国Sigma公司);氯化钠(分析纯,重庆川东化工有限公司);无水硫酸镁(分析纯,成都科龙有限公司),十八烷基键合硅胶吸附剂(C18E)和N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)(上海月旭股份有限公司)。

9种亚硝胺混合标准品:NDMA、N-亚硝基甲乙胺(NMEA)、N-亚硝基二乙胺(NDEA)、N-亚硝基二正丙胺(NDPA)、N-亚硝基二正丁胺(NDBA)、N-亚硝基吡咯烷(NPYR)、N-亚硝基哌啶(NPIP)、N-亚硝基吗啉(NMorPh)、N-亚硝基二苯胺(NDPhA)购自美国Supelco公司,质量浓度均为2 000 mg/L,除N-亚硝基吗啉纯度为96.6%外,其余纯度＞99.5%; N-亚硝基二甲胺-d6(NDMA-d6,1 000 mg/L)和N-亚硝基二正丙胺-d14(NDPA-d14,1 000 mg/L)购自美国AccuStandard公司。

J&W DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)购自美国Agilent公司。

1.2 标准溶液的配制

混合标准储备液:准确移取9种N-亚硝胺标准溶液各0.5 mL至100 mL容量瓶中,用乙腈配制成10 mg/L的N-亚硝胺混合标准储备液;准确移取两种同位素内标(NDMA-d6和NDPA-d14)溶液各0.5 mL至50 mL容量瓶中,用乙腈配制成10 mg/L的混合内标储备溶液。置于棕色瓶中,保存于-20 ℃。

混合中间储备液:准确移取混合标准储备液和混合标准内标储备液各1 mL至两个10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯分别稀释成1 mg/L的混合中间储备液。置于棕色瓶中,保存于-20 ℃下。

混合标准工作溶液:使用前将混合标准中间储备液放至室温,吸取一定量的混合标准中间储备液和30 μL混合内标中间储备液,用乙酸乙酯稀释至1 mL,溶液中NDMA-d6和NDPA-d14的质量浓度均为30 μg/L。

1.3 样品处理

准确称取匀质试样10.00 g(精确至0.01 g),含水量较少的干质试样取样量为5.0 g,置于50 mL聚丙烯离心管中,加入90 μL混合内标中间储备液后加入15 mL乙腈,涡旋2 min混匀,再加入脱水试剂(4.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠),振荡1 min后以8 000 r/min离心5 min,取7 mL上清液于分散固相萃取管中(吸附剂为1 000 mg无水硫酸镁、200 mg C18E和100 mg PSA),漩涡1 min混匀后以8 000 r/min离心5 min,取5 mL上清液至氮吹管中,用氮气吹至近干,用乙酸乙酯定容至1 mL,将样品液移入瓶垫不含碎片离子m/z=74的进样瓶中,待测定。

1.4 GC-MS/MS条件

色谱条件   J&W DB-WAX毛细管色谱柱。程序升温:初始温度50 ℃,保持1 min,以10 ℃/min升温至110 ℃,以15 ℃/min升温至200 ℃,以40 ℃/min升温至240 ℃,保持8 min。进样口温度:240 ℃,进样口压力:250 kPa,保持1 min后压力降为35.3 kPa。进样模式:不分流进样,进样量为1 μL,分流平板1 min后打开,分流比为10∶1。载气:He(纯度＞99.999%),线速度:36.3 cm/s。传输线温度:230 ℃。

质谱条件 离子源温度:240 ℃;电离方式:电子轰击离子(EI)源;电子能量:70 eV;电子倍增器电压:1.01 kV(MRM模式下相对于调谐结果+0.6 kV);碰撞气:Ar(纯度＞99.999%)；碰撞气压力:200 kPa;采集模式:MRM模式;两个四极杆分析器(MS1及MS2)的分辨率:单位质量分辨率(Unit)；溶剂延迟时间:5 min。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化

9种N-亚硝胺化合物的极性差异较大。在参考已有文献[25]的基础上,考察了N-亚硝胺在中等极性和强极性毛细管色谱柱上的色谱行为。结果表明:选用Agilent J&W DB-17毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)时,N-二甲基亚硝胺的色谱峰形较差,分离效果不佳;选用极性色谱柱DB-WAX时,所有色谱峰都是尖锐的窄峰,且峰形对称,大多数化合物分离度高,几乎达到基线分离。因此选用DB-WAX色谱柱作为实验用色谱毛细柱。通过试验发现,上述文献[25]报道的6种N-亚硝胺的气相色谱程序升温条件满足本实验的9种N-亚硝胺及其2种内标物的测定要求。随着温度升高,色谱柱柱流失增加,所以在13.0~16.5 min关闭灯丝。

2.2 质谱条件的优化

使用单针进样分析目标化合物的混合标准中间储备液,对9种N-亚硝胺及其2种内标物进行质谱全扫描分析。化合物进入一级质谱后,确定母离子,母离子进入二级质谱,对化合物的碰撞电压进行优化。在子离子扫描(product scan)模式下,对化合物母离子逐一施加一定步长的碰撞能量(CE),目标化合物发生断裂或重排等反应，产生不同的离子碎片,得到不同碰撞能量下相应的离子碎片,根据欧盟发布的2002/657/EC决议[26],每个目标化合物选取2对最具特征且响应最高的MRM离子及相应的仪器参数作为最终的质谱采集参数(见表 1)。

表 1 9种N-亚硝胺和2种内标物的串联质谱参数 Table 1 MS/MS parameters of the nine N-nitrosamines and the two internal standards

按照上述优化的GC-MS条件,对9种N-亚硝胺及2种内标化合物进行分析,得到11种化合物的总离子流图(见图 1)。

图 1 9种N-亚硝胺和2种内标物混合标准溶液的总离子流色谱图(90 μg/L) Fig. 1 Total ion chromatogram of a mixed standard solution of the nine N-nitrosamines and the two internal standards (90 μg/L) Peak Nos. are the same as those in Table 1.
2.3 样品前处理条件的选择
2.3.1 样品提取方法的优化

为了简化提取和净化过程,根据9种N-亚硝胺的极性差异,选用乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮作为提取溶剂,比较提取效果,结果见图 2。从实验结果看出,乙腈作为溶剂提时提取效果明显高于其他溶剂。同时,乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮溶剂对动物源性食品特别是高脂肪含量食品的油脂和色素的溶解性较高,给后续的净化处理和上机测试带来极大干扰。所以最终选用对极性和非极性化合物具有较好提取效率的乙腈作为提取溶剂,同时也为分散固相萃取净化提供溶剂条件。

图 2 9种N-亚硝胺在不同提取溶剂时的提取效率 Fig. 2 Extraction efficiencies of the nine N-nitrosamines with different extraction solvents
2.3.2 样品净化条件的优化

分散固相萃取技术具有快速、高效和廉价等优点,被广泛运用于残留检测的前处理中。它主要通过非极性相互作用、极性相互作用、离子相互作用等选择性保留基质干扰成分,进而达到净化的效果。常用的吸附剂材料有无水MgSO4、C18E、PSA和石墨化碳黑(GCB)。PSA吸附剂在硅胶上键合了乙二胺-N-丙基官能团,主要作用力是极性相互作用及弱阴离子交换作用,可有效去除样品中的有机酸、脂肪酸和糖等干扰物,但对分子结构中带有羧基的化合物有一定的保留作用;C18E吸附剂在硅胶上键合了十八烷基官能团,产生强非极性相互作用,对极性较弱的脂肪酸、烯烃类及甾醇类、色素等大分子基质干扰物有较好的吸附效果;无水MgSO4主要用于吸收样品溶液中的水分,以保证PSA的吸附能力。为了获得最佳的净化剂用量配比,选取因素A(无水MgSO4用量)、因素B(C18E用量)及因素C(PSA用量)3个因素,每个因素取4个水平,按照L16(34)正交表进行试验。由于同位素稀释法会校正试验结果,所以用外标法比较3.0 μg/kg加标水平下各因素组合的回收率和净化效果,以选择最佳组合。正交试验因素水平见表 2。图 3为正交试验效应曲线图。均衡考虑,使用1 000 mg无水MgSO4、200 mg C18E及100 mg PSA组成的净化剂可以获得良好的净化效果。

表 2 吸附剂及无水MgSO4用量配比的正交试验因素水平 Table 2 Orthogonal test factors and levels of the adsorbents and MgSO4
图 3 正交试验效应曲线图 Fig. 3 Effect of curve diagram of orthogonal test C18E: C18 sorbent; PSA: primary secondary amine sorbent.
2.4 基质效应的消除

由于质谱分析往往会存在基质效应[27],在气相色谱-质谱分析中,客观存在的基质效应会对分析方法的灵敏度、精密度以及准确度造成影响。采用同位素稀释内标法,并同步优化色谱分离条件,利用内标法和外标法的拟合曲线对9种N-亚硝胺的回收率进行了比较。结果显示外标法的回收率为87%～165%,且较集中在高回收率端;而内标法的回收率为78%～111%,说明内标法能很好地消除基质效应,减少萃取、浓缩、移取等处理过程中可能带来的误差,有效地保证了定性、定量结果准确可靠。

2.5 线性范围、线性方程和检出限

在优化的色谱-质谱条件下,对6个质量浓度水平的系列混合标准工作溶液进行测定。9种待测物以其定量离子与相应同位素内标的峰面积比(Y)为纵坐标,以标准溶液的与相应同位素内标的质量浓度比(X)为横坐标,获得线性方程。线性相关系数(r2)为0.996 1～0.999 8,表明待测物在10～120 μg/L范围内有良好的线性关系。以信噪比(S/N)=3确定9种N-亚硝胺的LOD为0.02～0.31 μg/kg(见表 3)。

表 3 9种N-亚硝胺的回归方程、相关系数、线性范围及检出限 Table 3 Regression equations,correlation coefficients (r2),linear ranges and limits of detection (LODs) of the nine N-nitrosamines
2.6 准确度和精密度

按前述方法,取不含目标化合物的牛肉干、凤爪、腊肉和墨鱼干等4种空白样品,通过添加回收试验考察了方法的准确度和精密度。添加水平为0.5、1.0和3.0 μg/kg(最大限量值(MRL)),回收试验结果见表 4。结果表明,9种N-亚硝胺的平均加标回收率范围为62.5%～118%,相对标准偏差为2.11%～25.6%(n=6),方法的准确度和精密度均符合残留分析要求。

表 4 9种N-亚硝胺在动物源性食品中的添加回收率和相对标准偏差(n=6) Table 4 Spiked recoveries and RSDs of the nine N-nitrosmines in animal derived foods (n=6)
2.7 实际样品的检测

采用本方法对牛肉干、墨鱼干、腊肉和虾米等动物源性食品进行检测,结果如表 5所示。在所检测的样品中,NDMA和NPYR的检出率较高,且墨鱼干中NDMA的含量较高,这与墨鱼生活在含大量硝酸盐的海水中有关。

表 5 不同动物源性食品中9种N-亚硝胺的检测结果 Table 5 Determination of the nine N-nitrosmines in different animal derived foods
3 结论

通过优化色谱和质谱条件,考察提取和净化方法,建立了分散固相萃取-气相色谱-串联质谱测定动物源性食品中9种N-亚硝胺的分析方法。该方法前处理简单、灵敏度高、线性关系、准确度和精密度等均满足方法学指标,方法检出限能满足法规限量要求,能够满足动物源性食品中9种N-亚硝胺的残留分析,有效地提高了检测速度和检测通量。

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