超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱测定果蔬中维生素C


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刘真真^1,2, 齐沛沛², 王新全², 陈文学¹, 吴莉宇², 王强^1,2

1. 海南大学食品学院, 海南海口 570228;
2. 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所, 浙江杭州 310021

收稿日期：2016-07-13

基金项目：国家自然科学基金项目（31501556）；浙江省自然科学基金项目（LQ15B050001）；公益性行业（农业）科技专项（201503107）

通讯联系人：王强, Tel:(0571)86404355, E-mail:qiangwang_zaas@163.com

摘要：利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）快速与高分辨的分析优势，通过系统地考察样品制备、仪器分析中影响维生素C响应灵敏度和稳定性的各主要因素，建立了果蔬中维生素C的定量分析方法。果蔬样品在干冰保护下高速匀浆获得均匀的匀浆液，用0.1%（v/v）甲酸溶液提取后，采用Waters Acquity-UPLC T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）分析，柱温为30℃，进样量为5 μL，流动相为0.05%（v/v）甲酸-甲醇溶液（8：2，v/v），流速为0.25 mL/min。提取的定量离子为[M-H]^-（m/z 175.0238），定性离子为[M-C₃H₄O₃]^-（m/z 87.0077），质量允许误差为5×10^-6（5 ppm）。结果表明：维生素C在0.02~5.0 mg/L范围内峰面积与质量浓度呈线性，线性相关系数（R²）为0.9992；检出限及定量限分别为0.008 mg/L（S/N=3）和0.02 mg/L（S/N=10）；在不同添加水平下，维生素C的平均回收率为89.3%~113%，相对标准偏差小于5.40%。在优化的条件下，对32批次的国产和新西兰猕猴桃样品进行检测，国产猕猴桃中维生素C的含量范围为498~1625 mg/kg，新西兰进口猕猴桃中维生素C的含量范围为247~449 mg/kg。该方法操作简便，重复性良好，可用于果蔬中维生素C含量的准确测定。

关键词：超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱维生素C 果蔬

Determination of vitamin C in fruits and vegetables by ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry

LIU Zhenzhen^1,2, QI Peipei², WANG Xinquan², CHEN Wenxue¹, WU Liyu², WANG Qiang^1,2

1. Food College, Hainan University, Haikou 570228, China ;
2. Institute of Quality and Standard of Agro-Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China

Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (No. 31501556); Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (No. LQ15B050001); Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public Interest (No. 201503107)

Abstract: A method was developed for the determination of vitamin C in fruits and vegetables by ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry. The main factors which affect the sensitivity and stability of vitamin C in the sample preparation and instrument analysis were investigated. Fruit and vegetable samples were prepared by high speed homogenate under the protection of dry CO₂, and then extracted by 0.1% (v/v) formic acid solution. The analysis was performed using an Acquity-UPLC T3 column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) with the column temperature of 30℃. The injection volume was 5 μL. The mobile phase consisted of 0.05% (v/v) formic acid solution and methanol with a volume ratio of 8:2. The flow rate was set at 0.25 mL/min. The extracted ion [M-H]^-(m/z 175.0238) was selected for quantification, while extracted ion [M-C₃H₄O₃]^-(m/z 87.0077) was selected for qualification. The mass error was 5×10^-6 (5 ppm). The results displayed that the linearity of vitamin C ranged from 0.02 to 5.0 mg/L with the correlation coefficient (R²) of 0.9992. The limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) were 0.008 mg/L (S/N=3) and 0.02 mg/L (S/N=10), respectively. The recoveries of the vitamin C in the spiked samples ranged from 89.3% to 113% with the RSD less than 5.40%. The developed method was then utilized to analyze the real kiwifruit samples. The results showed that the contents of the vitamin C ranged from 498 to 1625 mg/kg for the domestic kiwifruit samples. Regarding the New Zealand kiwifruit samples, the contents of the vitamin C ranged from 247 to 449 mg/kg. The present method demonstrated the advantages of easy operation, good precision and repeatability, making it feasible for accurate determination of vitamin C in fruits and vegetables.

Key words: ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) vitamin C fruits and vegetables

维生素C又名L-抗坏血酸, 是一种天然的抗氧化剂, 主要以还原型维生素C的形式存在于新鲜的果蔬中^[1]。它可以与生育酚、还原型辅酶Ⅱ在体内协同清除自由基, 发挥抗氧化作用^[2-4]; 同时, 它能够阻止亚硝胺的形成, 具有防癌和增加机体抵抗力的作用^{[5, 6]}。

目前, 果蔬中维生素C的测定方法有氧化还原滴定法、自动电位滴定法、分光光度法和高效液相色谱法等^[7-17]。氧化还原滴定法因人为判定终点, 易造成偏差; 自动电位滴定法依据电极变化率判定终点, 可避免人为因素偏差, 但易受基质中还原性物质的影响; 分光光度法通过测定维生素C的紫外吸光度而定量, 而果蔬基质在紫外区也存在本底吸收, 易干扰测定结果; 高效液相色谱法通常利用紫外检测器测定, 因此同样存在基质干扰的情况。

质谱检测具有高选择性、高灵敏度、特异性强等特点, 检出限低, 可以进行低浓度样品的定量检测, 在分析中展现出良好的应用前景。近年来已有报道采用液相色谱-三重四极杆串联质谱等用于维生素C的分析测定^{[18, 19]}。而超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)兼具超高效液相色谱和飞行时间质谱的优势, 是近年来发展起来的一项新的定性定量分析技术^{[20, 21]}。超高效液相色谱系统使样品的色谱分离更快速; 四极杆-飞行时间质谱则具有高分辨率、高选择性的特点, 可以通过精确相对分子质量和碎片信息匹配等方式来排除三重四极杆质谱可能存在的假阳性问题, 实现更精准的化合物定性功能。而目前尚未有研究报道利用UPLC-Q-TOF/MS分析果蔬中的维生素C。因此, 本研究基于UPLC-Q-TOF/MS快速、高分辨等优势, 选择富含维生素C的典型果蔬品种——猕猴桃、橙子及番茄为分析对象, 建立果蔬中维生素C的快速准确测定方法。

本工作针对维生素C在水溶液及碱性条件下易被氧化的特性, 采用0.1%(v/v)的甲酸作为提取溶剂, 并着重研究色谱柱及流动相组成对其分离和响应的影响, 结合UPLC-Q-TOF/MS建立了果蔬中维生素C的定量分析方法, 为果蔬中维生素C的测定提供新的方法依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪ACQUITY^TM UPLC和飞行时间质谱仪Xevo G2-S-Q-TOF/MS(美国Waters公司); Waters Acquity-UPLC T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μ m, 美国Waters公司)。Waters UPLC-BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μ m, 美国Waters公司), Phenomenon LC-HILIC色谱柱(150 mm×2 mm, 3 μ m, 美国Phenomenon公司)。IKA T18 basic Ultra-Turrax匀浆机(德国IKA公司); Filter Unit滤膜(0.22 μ m, 天津Agela Technologies公司); 甲酸(色谱纯, 美国ACS公司), 甲醇(色谱纯, 美国Merck公司), 实验用水为超纯水(Milli-Q超纯水系统, 美国Millipore公司)。

维生素C标准品(含量99.7%)购于上海伯奥生物科技有限公司。猕猴桃、西红柿、橙子购于浙江省杭州市超市。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

将果蔬样品去皮洗净, 分别快速切碎混匀。准确称取20.00 g(±0.05 g)于匀浆杯中, 加入20 mL 0.2%(v/v)的甲酸, 然后加入20 g干冰, 放置于组织匀浆机中匀浆。准确称取2.00 g(±0.05 g)匀浆液于烧杯中, 加入适量0.1%(v/v)甲酸溶液将其转容至500 mL棕色容量瓶中, 并定容至刻度(将烧杯进行多次洗涤, 保证果蔬样品完全转入容量瓶中), 充分混匀, 静置提取20 min, 用0.22 μ m滤膜过滤待测(实验均避光操作)。

1.2.2 UPLC-Q-TOF/MS分析

采用UPLC-Q-TOF/MS对猕猴桃中的维生素C进行测定分析。色谱柱为Waters Acquity-UPLC T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μ m)。流动相为水和甲醇(8 : 2, v/v), 其中水相中加入0.05%(v/v)甲酸。流速为0.25 mL/min, 柱温为30 ℃, 进样量为5 μ L。质谱条件:采用MS和分辨率模式分析, 电喷雾负离子源(ESI^-), 毛细管电压为2.00 kV, 锥孔电压为40 V, 脱溶剂气和进样锥孔气流速分别为800 L/h和50 L/h, 脱溶剂气温度为450 ℃, 离子源温度为120 ℃, 碰撞气为高纯氩气, 雾化气为高纯氮气; 提取的定量离子为[M-H]^-(m/z 175.023 8), 定性离子为[M-C₃H₄O₃]^-(m/z 87.007 7)(碰撞能量(CE): 20 eV), 质量允许误差为5×10^-6(5 ppm); Lockspray采用亮氨酸脑啡肽(leueine enkephalin)进行质量数实时校准, 系统控制和数据采集分析采用MassLynx^TM 4.1软件。

2 结果与讨论

2.1 方法优化

2.1.1 质谱条件的确定

采用蠕动泵进样来优化样品, 其中样品为维生素C的标准溶液(0.1%(v/v)甲酸溶解并定容), 质量浓度为2 mg/L, 流速为5 μ L/min。在负离子源模式下, 采用Q-TOF/MS对维生素C进行质谱扫描, 通过优化毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂气流速等质谱条件, 获得较高响应的质荷比(m/z为175.023 8), 而维生素C的[M-H]^-的m/z理论为175.024 3, 质量相对偏差为2.86 ppm, 在测定允许精度5 ppm的范围内。进一步对母离子m/z175.023 8施加CE 10、12、15、20 eV, 获得其二级质谱图(见图 1)。由图 1可知, [M-H]^-(m/z 175.023 8)随着CE的增大发生不同程度的裂解, 产生更多的碎片离子, CE为10、12、15 eV时, 离子丰度最高的特征碎片为115.004 0, 对应于[M-C₂H₅O₂]^-(m/z理论值为115.003 1), 质量相对偏差为7.83 ppm; CE为20 eV时, 丰度最高的特征碎片为m/z 87.007 7, 对应于[M-C₃H₄O₃]^-(m/z理论值87.008 0), 质量相对偏差为3.45 ppm, 各碎片离子的结构如图 1所示。同时, 随着CE的增加, 母离子和碎片离子的响应都呈下降趋势, 因此, 为实现对维生素C的准确定量, 选择定量离子为[M-H]^-(m/z 175.023 8), 定性离子为[M-C₃H₄O₃]^-(m/z 87.007 7)(CE: 20 eV), 质量允许误差为5 ppm。

图 1 不同碰撞能量下维生素C的质谱图 Fig. 1 Mass spectra of vitamin C on different collision energies

2.1.2 色谱柱的选择

本研究考察了3种色谱柱(C18、T3和HILIC)对维生素C的保留和响应的影响。流动相流速均设定为0.25 mL/min, 柱温为30 ℃。C18和T3色谱柱采用水和甲醇(8 : 2, v/v)为流动相, 水相中加入0.05%(v/v)的甲酸; HILIC柱的流动相为水和乙腈(2 : 8, v/v)。对同等浓度的维生素C标准溶液的分析结果如图 2所示, 可以看出, 维生素C在HILIC柱上出现严重的拖尾现象, 说明其不适用于维生素C等酸性化合物的分离测定; 维生素C在C18、T3色谱柱上的保留时间相当, 但在T3色谱柱上的响应明显高于C18色谱柱。因此, 选取T3色谱柱用于维生素C的分析测定。

图 2 维生素C在3种色谱柱上的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of vitamin C on three chromatographic columns

2.1.3 流动相的选择

反相色谱的流动相通常由水和有机溶剂(如甲醇、乙腈)等组成, 并通过加入能与流动相互溶的修饰剂来改善化合物的保留和色谱峰峰形, 如甲酸铵、甲酸、乙酸铵、乙酸等, 尤其是与质谱联用时, 必须使用挥发性缓冲溶液^[22-26]。由于维生素C属于酸性极性化合物, 且性质不稳定^[13], 因此, 尝试通过加入不同体积分数(0.05%、0.1%、0.2%、0.5%)的甲酸作为修饰剂, 一方面使其保持稳定状态, 另一方面可以抑制维生素C电离, 增强保留, 并改善峰形^[22]。在不同甲醇及甲酸用量条件下分析维生素C标准溶液的色谱图见图 3。

图 3 不同流动相条件下维生素C的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of vitamin C with different mobile phases FA: formic acid; MT: methanol.

由图 3可知, 同等甲醇用量条件下, 水相中加入甲酸增加了维生素C在T3色谱柱上的保留时间, 但甲酸含量的增加对其在色谱柱上的保留时间影响不显著, 响应值反而逐渐降低, 因此选取在水相中加入0.05%(v/v)的甲酸作为修饰剂。同等甲酸含量条件下, 流动相中甲醇比例由20%降至10%(v/v)时, 维生素C在T3色谱柱上的保留时间相当, 但其在色谱柱上的响应值均明显降低, 这可能是由于有机溶剂的比例降低, 导致离子化效率的降低, 从而使化合物响应降低。因此, 最终确定最佳的流动相为水和甲醇(8 : 2, v/v), 其中水相中加入0.05%(v/v)甲酸。

2.1.4 样品制备方法优化

维生素C性质不稳定, 在热、氧气及光照等条件下易氧化分解, 因此, 样品制备方法也是影响结果分析准确度的关键环节。为探明制样方式对维生素C分析测定的影响, 选取猕猴桃样品为代表, 将其去皮洗净, 快速切碎混匀, 3等分, 分别称取20.00 g(±0.05 g)于研钵和匀浆杯中, 然后加入20 mL的0.2%(v/v)的甲酸水溶液。采用研磨成浆、组织高速匀浆和干冰保护下组织高速匀浆3种方式制样, 按照优化的样品前处理方法及分析条件对维生素C进行测定, 结果表明:高速匀浆法制备样品时, 猕猴桃中维生素C的含量高于研磨成浆法的测定结果; 而干冰保护下高速匀浆制备样品时, 猕猴桃中维生素C的含量高达750 mg/kg, 与研磨成浆制样(441 mg/kg)和高速匀浆制样(682 mg/kg)相比, 其测定结果分别提高了70.1%和9.97%, 且样品间的平行性更好。这可能是由于高速匀浆条件下样品的均匀性较好, 且高速匀浆制样仅需20～30 s, 避免了人工研磨过程中样品长时间与空气接触造成维生素C的氧化分解; 而匀浆过程加入干冰, 则降低了高速匀浆过程产热对维生素C造成的热分解, 进一步提高了分析结果的准确度。因此, 在维生素C的分析测定中, 采用干冰保护下组织高速匀浆法制备样品。

2.2 方法验证

2.2.1 线性关系和灵敏度

配制维生素C的标准溶液, 其质量浓度梯度为0.02、0.04、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L。经UPLC-Q-TOF/MS分析后, 以色谱峰面积(Y)对分析物质量浓度(X, mg/L)进行线性拟合, 得出回归方程及相关系数。结果显示, 维生素C在0.02～5.0 mg/L范围内具有良好的线性关系, 线性方程为Y=19 485X-732.04, 线性相关系数(R²)为0.999 2。

通过逐级稀释测定的方法确定本方法维生素C的LOD值为0.008 mg/L(S/N=3), LOQ值为0.02 mg/L(S/N=10)。

2.2.2 添加回收率及精密度

果蔬中维生素C含量较高, 难以选取空白基质进行添加回收试验。因此, 根据选取的果蔬样品的本底值设定适宜的添加水平, 以验证该方法的回收率及精密度。

分别称取2.00 g(±0.05 g)猕猴桃、橙子、西红柿匀浆液进行添加回收试验, 并根据样品中维生素C的本底值来确定添加水平, 其中猕猴桃和橙子的添加水平为100、200、300 mg/kg, 西红柿的添加水平为10、20、30 mg/kg(分别做3个平行)。在质谱分析中, 由于样品基质中化合物种类多样, 通常会对靶标化合物的离子化效率产生影响, 即产生基质增强或抑制效应, 进而影响分析结果的准确性和可靠性。因此, 为提高分析准确度, 目前通常采用基质匹配标准溶液校准法来进行定量计算。然而, 果蔬中维生素C含量较高, 难以获取空白基质溶液。而据研究报道^{[27, 28]}, 在综合考虑仪器的灵敏度和方法检出限的条件下, 通过样品稀释法可以减弱基质效应对结果造成的影响, 当稀释倍数达到100以上时, 基质效应已基本消除。本研究方法中, 将样品基质稀释500倍至线性范围内进行分析测定, 可忽略基质效应对结果所造成的影响。果蔬中维生素C在不同添加水平下的回收率结果见表 1。猕猴桃中维生素C在不同添加水平下平均回收率在89.3%～113%之间, RSD为0.63%～1.13%,; 橙子中维生素C在不同添加水平下平均回收率在90.0%～102%之间, RSD为0.50%～2.90%;西红柿中维生素C在不同添加水平下平均回收率在103%～112%之间, RSD为2.79%～5.40%, 说明该方法的准确度和精密度均符合分析要求。

表 1 果蔬中维生素C在不同添加水平下的回收率(n=3) Table 1 Recoveries of vitamin C at different spiked levels in fruits and vegetables (n=3)

2.2.3 稳定性试验

为探明维生素C在样品提取至完成仪器测定过程中的稳定性, 选取猕猴桃样品为代表, 按照优化的样品前处理和仪器分析条件制备样品, 并配制维生素C的标准工作溶液(质量浓度为1 mg/L)。所有样品放置于棕色进样瓶中避光存放, 同等分析条件下, 分别于0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h进行分析测定, 根据维生素C的提取离子色谱峰峰面积来计算维生素C在不同时间段内的降解率, 具体结果见图 4。可以看出, 1 h内, 标准工作溶液和猕猴桃样品中的维生素C均具有较好的稳定性, 降解率在5%以内; 2 h时, 标准工作溶液中维生素C的降解率为16.5%, 猕猴桃样品中其降解率为16.3%, 两者维生素C的降解率相当; 而4 h时, 标准工作溶液中维生素C的降解率为89.2%, 猕猴桃样品中其降解率为43.2%。因此, 为了提高分析的准确度, 用于维生素C定量分析的标准溶液应现配现用, 并尽量在样品提取完成、盛装于进样瓶后1 h内完成样品分析测定。由此, 综合统计样品制备、提取及仪器分析各过程所需时间, 合理安排实验操作流程, 建议在两人配合操作的情况下, 每批次可完成20个样品, 总计所需时间约为2 h; 并可以以20个样品为单元重复操作, 在仪器分析时开始下一组20个样品的制备、提取, 从而可以同时保证样品的分析效率和准确度, 避免在完成大批量样品制备后再进行批量分析所带来的准确度严重降低现象。

图 4 维生素C在不同时间段的降解率 Fig. 4 Degradation rates of vitamin C under different predetermined time

2.3 实际样品测定

为进一步验证该方法的适用性, 将该方法应用于实际样品分析。从市场上选购32批次猕猴桃, 其中16批次新西兰绿果猕猴桃和16批次国产猕猴桃。在优化的条件下对猕猴桃样品进行分析, 结果如下:国产猕猴桃维生素C含量范围为498～1 625 mg/kg; 进口新西兰猕猴桃维生素C含量范围为247～449 mg/kg。国产猕猴桃维生素C含量明显高于新西兰绿果中维生素C含量。Student T-test检验结果也显示国产与进口猕猴桃中维生素C含量确实存在显著性的差异(p=0.000 021)。

同时, 将本实验结果与文献中3种果蔬的维生素C含量进行对比分析(见表 2), 可以看出, 本方法测定的猕猴桃、橙子、番茄中维生素C的含量与文献结果基本吻合。但是, 果蔬品种、成熟度﹑贮藏条件等均会影响果蔬中维生素C的含量, 故而维生素C的含量分布也相对较为分散。

表 2 本方法与文献中维生素C测定值的对比 Table 2 Comparison of the contents of vitamin C in this method and references

此外, 在测定方法上, 本方法与文献方法(如氧化还原滴定法、高效液相色谱法、液相色谱-三重四极杆串联质谱法等)相比, 优势在于:前处理萃取效率高, 操作过程简单、快速; 仪器分析定性准确、分析时间短, 既避免了分析过程中维生素C的损失, 又提高了样品分析结果的准确度; 系统的方法验证工作也证实了该方法的可靠性和适用性。

3 结论

本研究采用组织高速匀浆过程加入干冰的方式制样, 0.1%(v/v)甲酸为提取溶剂, 以0.05%(v/v)甲酸-甲醇溶液(8 : 2, v/v)为流动相等度洗脱, 并结合UPLC-Q-TOF/MS准确定性、定量的优势, 建立了果蔬中维生素C的定量分析方法, 方法的准确度和精密度均符合分析要求。整个操作过程简单、快速、仪器分析时间短, 避免了维生素C的损失, 准确度高, 适于维生素C含量的定量分析, 为维生素C的快速准确测定提供新的方法依据。

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