色谱  2017, Vol. 35 Issue (2): 216-221   PDF    
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邱百灵
吴迪
郭爽
朱尘琪
高杨亚雅
梁启慧
高也
宋宇
韩南银
重力场流分离系统用于聚苯乙烯颗粒的分离条件优化
邱百灵 , 吴迪 , 郭爽 , 朱尘琪 , 高杨亚雅 , 梁启慧 , 高也 , 宋宇 , 韩南银     
北京大学药学院, 北京 100191
收稿日期：2016-07-16
通讯联系人： 韩南银,Tel:(010)82805957,E-mail:nanyin.han@pku.edu.cn
摘要：重力场流分离是最简单的场流分离（gravitational flow-field fractionation，GrFFF）技术，常用于分离粒径几微米到几十微米的颗粒及生物样品。利用自组装加工的重力场流分离仪器分离3种不同粒径（3、6、20 μm）的聚苯乙烯（PS）颗粒。自制了一种混合表面活性剂，并与商品化的表面活性剂FL-70进行了比较。通过均匀设计优化流速、混合表面活性剂中聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的质量分数、载液黏度、停流时间等分离条件，以分离度（Rs）和保留比（R）为评价指标，发现FL-70的分离效能略优于自制的混合表面活性剂，可实现3种PS颗粒的完全分离（Rs1为1.771，Rs2为2.074）。结果表明该系统具有良好的分离性能。
关键词： 重力场流分离     均匀设计     聚苯乙烯颗粒     载液     表面活性剂     流速     分离度    
Optimization of experimental conditions for the separation of polystyrene particles by gravitational field-flow fractionation
QIU Bailing, WU Di, GUO Shuang, ZHU Chenqi, GAOYANG Yaya, LIANG Qihui, GAO Ye, SONG Yu, HAN Nanyin     
School of Pharmaceutical Science, Peking University, Beijing 100191, China
Abstract: Gravitational flow-field fractionation (GrFFF) is the simplest and cheapest field-flow fractionation technique. GrFFF utilizes earth's gravity as external field, providing a size-based separation. It can be applied to the separation and characterization of various micrometer-sized particles and biological samples. A GrFFF device was assembled, and three kinds of polystyrene (PS) particles with different sizes (20, 6 and 3 μm) were used as the model particles. A homemade mixed surfactant was used and was compared with the surfactant FL-70. The separation conditions of GrFFF were optimized with uniform design, including flow rate, mass percentage of polyethylene glycol octylphenol ether (Triton X-100) in mixed surfactant, viscosity of carrier liquid and stop-flow time. The resolution (Rs) and retention ratio (R) were utilized as the evaluation indexes. The results suggest that the separation performance of FL-70 was slightly better than that of the mixed surfactant. Using FL-70 as the surfactant, particles of 20, 6 and 3 μm were completely separated (with resolutions of 1.771 and 2.074). The results indicate that this system has good separation performance.
Key words: gravitational field-flow fractionation(GrFFF)     uniform design     polystyrene (PS) particles     carrier liquid     surfactant     flow rate     resolution    

场流分离(field-flow fractionation,FFF)系统是Giddings博士于1966年提出的一种分离技术,利用抛物线形载液流和垂直施加的外力场联合作用实现对不同物理特性分析物的分离[1, 2]。根据外力场的不同,FFF可分为热场流分离、流场流分离、电场流分离和沉降场流分离,而重力场流分离(gravitational field-flow fractionation,GrFFF)是沉降场流分离的一个分支技术[3]。FFF应用范围十分广泛,可用于分离和表征粒径范围在几纳米到几十微米的大分子和颗粒[4]。

GrFFF是一种最简单的场流分离技术,利用重力场为外力场引起颗粒向积聚壁沉积,并基于尺寸分离,即大粒径的颗粒先于小粒径的颗粒洗脱。GrFFF中,颗粒一般通过聚焦洗提模式洗脱,流体动力升力(hydrodynamic lift forces,HLF)将颗粒提举到积聚壁上方一定高度处,随后颗粒聚焦成一个窄区带,此处的有效颗粒重量(FG)与HLF相抵消,颗粒处于平衡位置(equilibrium particle position,δeq)[5, 6]。影响GrFFF分离效果的因素很多,包括通道角度及厚度、进样量、流速、离子强度、表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚、载液黏度、载液密度、重力场强度、通道形状等[5-11]。GrFFF通常用于分离粒径从几微米到几十微米的颗粒及生物样品,如粉煤颗粒、黏土颗粒、二氧化硅颗粒、淀粉颗粒、花粉、酵母、细胞、细菌、酶等[7, 12-14]。

本课题组郭爽等[15]利用自组装的GrFFF仪器研究了载液中叠氮化钠浓度、混合表面活性剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)和聚山梨酯-80(Tween-80)的比例,以及流速对两种粒径(6和20μm)的聚苯乙烯(PS)颗粒分离的影响,以保留比(R)、塔板高度(H)为评价指标。一般利用GrFFF分离PS颗粒时,使用的载液为0.2 g/L NaN3和0.1 g/L FL-70[4],其中FL-70为阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂的混合物,具体组成不详。FL-70价格昂贵且不易购得,为方便国内研究者,本文尝试用SDS和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)组成混合表面活性剂代替FL-70,选择3种不同粒径(3、6、20μm)的PS颗粒作为模型分析物,结合均匀设计优化分离条件(流速、混合表面活性剂中Triton X-100的质量分数、黏度、停流时间),得到了较为满意的分离效果。同时使用FL-70进行对照,结果表明FL-70的分离效果略优于自制的混合表面活性剂,可实现3种PS颗粒的完全分离。结果对实际样品的分析及实验条件的选择有一定参考意义。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

L600-DP单塞泵、L600-UV6可变波长紫外检测器、LC Win2.0工作站(北京普析通用有限公司;100 μL微量进样器(美国Hamilton公司); 7725i进样阀(美国Rheodyne公司); FA2104电子天平(上海恒平电子公司);乌氏黏度计(北京大学医学部玻璃房自制)。

聚苯乙烯微球水分散液,粒径分别为3、20μm(质量分数1%，荷兰Applied Microspheres公司)、6μm(质量分数2.5%,中国Alfa Aesar公司);NaN3(分析纯,北京化工厂); Triton X-100(纯度＞99.0%，美国Amresco公司); SDS(化学纯,天津市永大化学试剂有限公司);羟丙甲基纤维素(HPMC,分析纯,上海Aladdin试剂有限公司); FL-70(分析纯,Fisher Scientific公司);实验用水为超纯水(18.2MΩ·cm)。

实验所用的重力场流分离系统由本课题组自行加工组装,具体方法参见文献[15]。GrFFF仪器主要由4部分组成:高压输液泵A和B、进样阀、分离通道和紫外检测器。其中B泵将样品载入通道,A泵将载液泵入通道。A泵和B泵通过聚醚醚酮(PEEK)管分别与分离通道上的进液口和进样口连接,样品及载液亦通过PEEK管进入紫外检测器。分离通道从0.3mm厚的聚四氟乙烯垫片中切削出来,夹在有机玻璃块中间,通过螺栓固定,其尺寸为282.9mm×21.5mm×0.3mm,分离通道示意图如图 1所示。

图 1 重力场流分离通道示意图 Fig. 1 Schematic view of gravitational field-flow fractionation (GrFFF) channel
1.2 样品混悬液的配制

准确量取25 μL粒径3μm、20 μL粒径6μm和100 μL粒径20μm的聚苯乙烯微球水分散液加入2mL离心管中,用载液稀释至1mL,得到样品混悬液。其中粒径3、6和20μm的聚苯乙烯微球质量浓度依次为0.25、0.5和1mg/mL。

1.3 实验条件

进样量:20 μL;进样时间:1.6min;进样流速:0.05mL/min;检测波长:254 nm;载液:含0.2 g/L NaN3、1 g/L FL-70、0.9 g/L HPMC的水溶液。

1.4 评价指标
1.4.1 分离度

分离度Rs是用来度量样品中不同组分间分离情况的参数。两邻近峰的分离度可以用公式(1)和(2)表示:

(1)
(2)

式中,t1、t2、t3分别是峰1、2、3的洗脱时间;w1、w2、w3分别是邻近两峰的峰宽。依据文献[16],当Rs=1时,两组分完全分离,故实验结果要求Rs≥1。

1.4.2 保留比

GrFFF中,保留比(R)可由公式(3)给出[17]:

(3)

式中,d是颗粒直径;w是通道厚度;γ是空间相关系数,随场强、载液流速和粒径等实验条件的变化而变化,当流速增加时γ增加,这是由于HLF增加的缘故。R可通过实验测得:

(4)

式中,t0是通道的死时间,tR是样品的保留时间。由公式(3)和(4)可知,在GrFFF中,随着颗粒粒径减小,tR增加,R减小,可实现基于尺寸的分离。一般来说,随着流速、载液黏度的增加,HLF增加,推举颗粒去往更高、更快的流线,故R增加。

2 结果与讨论
2.1 均匀设计优化的试验因素和水平

影响GrFFF分离效果的因素很多,本试验选定流速(A)、混合表面活性剂中Triton X-100的质量分数(B)、载液黏度(C)及停流时间(D)4个因素进行考察。

2.1.1 混合表面活性剂中Triton X-100的质量分数

本研究初期尝试使用SDS(阴离子表面活性剂)和Triton X-100(非离子表面活性剂)组成的混合表面活性剂代替FL-70。表面活性剂的作用是减少样品在通道壁上的吸附。根据文献[18]可知,将非离子表面活性剂加入阴离子表面活性剂中,会形成混合胶束,减弱阴离子表面活性剂间的排斥作用,提高其静电稳定性,使其具有更强的润湿能力和表面活性;另外,非离子表面活性剂会与水分子形成氢键,具有弱正电性,这会部分中和阴离子表面活性剂所带的负电荷,使溶液所带的负电荷减少。而样品在通道中会受到静电排斥作用,故电荷也会影响样品在GrFFF中的保留。因此Triton X-100的质量分数会影响溶液的表面活性及所带电荷,进而影响样品在GrFFF中的保留。

预实验研究了Triton X-100的质量分数对两种粒径(6和20μm)的PS颗粒分离的影响,为均匀设计的水平设定提供参考。结果如图 2所示,Triton X-100的质量分数为0和20%时分离效果较好,40%、60%、80%、100%时有较明显的负峰,增至80%时已无法分辨出粒径6μm的PS颗粒色谱峰,从而干扰PS颗粒的分离效果。故将Triton X-100的质量分数设定为0～22%。

图 2 混合表面活性剂中Triton X-100的质量分数对GrFFF的影响 Fig. 2 Effect of themass percentage of polyethylene glycol octylphenol ether (Triton X-100) in themixed surfactant on GrFFF GrFFF conditions: carrier liquid,0.2 g/L NaN3/1 g/Lmixed surfactant of SDS and Triton X-100; flow rate,0.5mL/min; stop-flow time,3min. Polystyrene (PS) particles: 1. 20μm; 2. 6μm.
2.1.2 停流时间

停流时间是指样品进入通道后关闭泵,使各组分微粒在重力场和扩散作用的共同作用下向积聚壁靠拢、聚集的这段时间,又称样品松弛时间[19]。停流时间的长短会影响样品的分散状态,从而影响其分离效果。在本课题组前期工作的基础上考察了停流时间对3种粒径(3、6、20μm)PS颗粒分离的影响。如图 3所示,当停流时间为0.1、0.5、1.0min时,3个峰均得到一定程度的分离;停流时间增至1.5、2.0、2.5min时,只出现两个峰;而3min时仅能看到一个色谱峰。故将停流时间设定为0.1～1.2min。

图 3 停流时间对GrFFF的影响 Fig. 3 Effect of stop-flow time on GrFFF GrFFF conditions: carrier liquid,0.2 g/L NaN3/1g/L SDS; flow rate,0.5mL/min. PS particles: 1. 20μm; 2.6μm; 3. 3μm.
2.1.3 流速及黏度

依据本课题组的前期工作,将流速设定为0.2～1.3mL/min。为了在改变黏度时不影响载液密度,向载液中加入HPMC。依据文献[7]及本课题组前期工作,将HPMC的含量设定为0～1.1g/L。

2.2 均匀设计优化GrFFF的分离条件

本试验研究4个因素,每个因素设定12个水平(见表 1)。选用U13(1312)均匀设计表,结合相应的U13(1312)使用表,最终得到U12(124)表。以Rs为指标,得到如表 2所示的试验结果。其中1～12号试验的载液动力黏度依次为0.963×10-3、0.944×10-3、1.001×10-3、0.950×10-3、0.910×10-3、0.967×10-3、0.948×10-3、1.048×10-3、0.954×10-3、0.936×10-3、0.974×10-3、0.959×10-3 Pa·s。

表 1 均匀设计试验因素与水平设计表 Table 1 List of factors and levels of the uniform design

表 2 U12(124)均匀设计试验结果 Table 2 Results of uniform design U12(124)experiments

从表 2的分离度可以看出最佳条件为6号,流速0.7mL/min,停流时间0.8min,混合表面活性剂中Triton X-100的质量分数18%,HPMC含量0.8 g/L。此条件下,粒径20μm和6μm的PS颗粒的分离度Rs1为0.968,粒径6μm和3μm的PS颗粒的分离度Rs2为0.714(见图 4)。

图 4 6号试验条件下3种PS颗粒的GrFFF分离谱图 Fig. 4 GrFFF fractogram of three kinds of PS particles under the conditions of test No. 6 GrFFF conditions: carrier liquid,0.1 g/L NaN3/0.82 g/L SDS/0.18 g/L Triton X-100/0.8 g/L HPMC; flow rate,0.7mL/min; stop-flow time,0.8min. PS particles: 1. 20μm; 2.6μm; 3. 3μm.

在实际分离中,除分离度外,颗粒的保留比也常作为评价分离效果的指标。12次试验中3种颗粒的R值如图 5所示。同一条件下,20μm PS颗粒的R值＞ 6μm PS颗粒的R值＞ 3μm PS颗粒的R值,符合GrFFF理论。理论上,R值一般随流速增加而增加,但可观察到试验结果并未遵循这一规律。原因可能是加入HPMC改变了载液的黏度,而黏度会影响颗粒所受的流体动力升力;另外Triton X-100的质量分数也会影响溶液的表面活性及所带电荷,这些因素共同影响颗粒的保留行为。

图 5 均匀设计试验中3种PS颗粒的保留比 Fig. 5 Retention ratio (R) of three kinds of PS particles in uniform design tests

图 6 FL-70条件下3种PS颗粒的GrFFF分离谱图 Fig. 6 GrFFF fractogram of three kinds of PS particles with FL-70 GrFFF conditions: carrier liquid,0.2 g/L NaN3/1 g/L FL-70/0.8 g/L HPMC; elution flow rate,0.7mL/min; stop-flow time,0.8min. PS particles: 1. 20μm; 2.6μm; 3. 3μm.
2.3 表面活性剂的考察

为比较自制的混合表面活性剂和FL-70的分离效能,以FL-70代替SDS和Triton X-100组成的混合表面活性剂,选用均匀设计的最佳条件对3种PS颗粒进行分离。实验条件为:含0.2g/L NaN3、1 g/L FL-70和0.8 g/L HPMC的水溶液作为载液,流速0.7mL/min,停流时间0.8min。发现3种PS颗粒完全分离,Rs1为2.802,Rs2为1.102(见图 6)。这表明FL-70的分离效能优于自制的混合表面活性剂,因此有必要继续寻找更佳的FL-70替代物。

虽然图 6中3种PS颗粒完全分离,但峰形不好,峰宽略大。因此对实验条件进行适当调整。增大流速可减小峰宽,所以保持其他因素不变,适当增大流速,发现当流速增至0.9mL/min时峰形最佳。增大黏度会影响颗粒受到的流体动力升力从而改善分离效果,所以保持其他因素不变,适当增加黏度,发现HPMC含量达到0.9g/L时分离度最佳。综合考虑峰形及分离度,优化的实验条件为:含0.2 g/L NaN3、1 g/L FL-70和0.9 g/L HPMC的水溶液作为载液,流速0.9mL/min,停流时间0.8min。此时,Rs1为1.771,Rs2为2.074(见图 7)。

图 7 优化的FL-70条件下3种PS颗粒的GrFFF分离谱图 Fig. 7 GrFFF fractogram of three kinds of PS particles with FL-70 under the optimized conditions GrFFF conditions: carrier liquid,0.2 g/L NaN3/1 g/L FL-70/0.9 g/L HPMC; elution flow rate,0.9mL/min; stop-flow time,0.8min. PS particles: 1. 20μm; 2.6μm; 3. 3μm.
3 结论

本研究利用自行加工组装的重力场流分离系统分离3种不同粒径的PS颗粒,结合均匀设计优化分离条件(载液流速、黏度、停流时间、表面活性剂的质量比和种类),最终得到了较为满意的分离效果。以SDS和Triton X-100组成的混合表面活性剂代替FL-70,并进行对照研究,发现FL-70的分离效能略优于自制的混合表面活性剂。下一步研究尝试寻找更优的FL-70替代物,同时利用GrFFF系统分离淀粉等其他样品,以扩大其应用范围。

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