高效液相色谱法测定不同产地枇杷叶中的3种黄酮类成分


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朱诗塔¹, 周巧玲¹, 金苹², 肖瑶²

1. 厦门市第五医院, 福建厦门 361101;
2. 湖南医药学院, 侗医药研究湖南省重点实验室, 湖南怀化 418000

收稿日期：2016-07-19

基金项目：厦门市科技惠民项目（3502Z20144069）.

通讯联系人： Tel:(0592)7212713,E-mail:amoystar@163.com

摘要：建立了高效液相色谱同时测定枇杷叶中3种黄酮类成分的分析方法。该方法分析了不同产地枇杷叶中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量差异。枇杷叶粉末用甲醇超声提取后，加盐酸回流，制备样品测试液。采用Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.4%（v/v）磷酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱。分别对7个不同产地的枇杷叶样品中的芦丁、槲皮素和山柰酚进行测定。结果表明，芦丁、槲皮素、山柰酚在各自的质量浓度范围内线性关系良好（r>0.99），加标回收率分别为96.33%、95.81%和95.80%，RSD分别为6.48%、0.90%和3.02%。该方法操作简单、分离度好、重复性高。不同产地枇杷叶中3种黄酮类成分的含量存在差异，其中芦丁的差异最大，而山柰酚的含量最稳定且在不同产地样品中均可检出，或可用作枇杷叶药材质量控制的标志成分。

关键词：高效液相色谱黄酮类芦丁槲皮素山柰酚产地枇杷叶

Determination of three flavonoids in loquat leaves from different producing areas by high performance liquid chromatography

ZHU Shita¹, ZHOU Qiaoling¹, JIN Ping², XIAO Yao²

1. The Fifth Hospital of Xiamen, Xiamen 361101, China ;
2. Hunan University of Medicine, Hunan Provincial Key Laboratory of Dong Pharmaceutical Research, Huaihua 418000, China

Received: 2016-07-19

Foundation Item: Xiamen Huimin Projects of Science and Technology (No. 3502Z20144069).

^* Corresponding author. Tel:(0592)7212713,E-mail:amoystar@163.com

Abstract: A method for simultaneous determination of three flavonoids in loquat leaves was established by high performance liquid chromatography (HPLC), and the variations of contents of rutin, quercetin and kaempferol in loquat leaves from different producing areas were investigated. Powder of loquat leaves was extracted with methanol under ultrasonic extraction, then the lipid substances were recovered with hydrochloric acid before analyzed. A Diamonsil C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used. The mobile phases consisted of 0.4% (v/v) phosphoric acid and acetonitrile as gradient elution. The contents of rutin, quercetin and kaempferol in eight loquat leaf samples collected from seven producing areas were determined. Three flavonoids all showed good linear relationships in external standard method. The spiked recoveries of rutin, quercetin and kaempferol were 96.33%, 95.81% and 95.80%, with RSDs of 6.48%, 0.90% and 3.02%, respectively. The method can be applied in a rapid and easy way with high resolution and good repeatability. The contents of the three flavonoids in loquat leaves showed significant differences among producing areas, especially rutin. Kaempferol had been detected in all samples with a relative stable content. Kaempferol may be selected as an active ingredient for quality control of loquat leaf medicinal materials.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) flavonoids rutin quercetin kaempferol producing areas loquat leaves

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.)的干燥叶,作为常用中药材具有清肺止咳、降逆止呕、抗炎、祛痰、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗癌和保肝等作用^[1-3],临床上广泛应用于呼吸道疾病的治疗。枇杷叶中主要的化学成分为黄酮类、三萜类、皂苷类、有机酸类和多糖类等^{[4, 5]}。目前枇杷叶中三萜类成分的研究较为成熟,2015版《中国药典》^[1]采用三萜类化合物中的熊果酸和齐墩果酸作为质量控制的标志化合物。黄酮类化合物也是枇杷叶中主要的有效化学成分^[4-7],但目前鲜有质量标准采用黄酮类化合物作标志性成分。枇杷叶中化学成分的主要测定方法有液相色谱法^[8-11]、液相色谱-质谱联用法^{[6, 12, 13]}、毛细管电泳法^{[14, 15]}、紫外分光光度法^[16]等。黄酮类成分定量分析的目标物多为总黄酮,鲜见采用HPLC法同时分离测定枇杷叶及其制剂中的芦丁、槲皮素和山柰酚的报道。为探讨黄酮类化合物作为枇杷叶药材及其制剂的标志成分的可能性,本研究采用HPLC法同时测定并比较不同产地多个批次的枇杷叶药材中的芦丁、槲皮素和山柰酚的含量。建议在枇杷叶已有的三萜类标志性化合物的基础上,增加黄酮类标志性化合物的定量检测标准,为完善枇杷叶药材及其复方制剂质量标准提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料

Agilent 1260高效液相色谱仪配有G1311B四元泵和G4212B二极管阵列检测器(美国Agilent公司); AUW120D电子分析天平(日本岛津公司); LC-350超声波中药处理机(山东济宁鲁超超声设备有限公司)。

乙腈和甲醇(色谱纯,德国Merck公司),磷酸(分析纯,广州金华大化学试剂有限公司),浓盐酸(分析纯,衡阳市凯信化工试剂有限公司),水为超纯水。

芦丁对照品(纯度:90.5%,批号:100080-200707)、槲皮素对照品(纯度:96.5%,批号:100081-200907)均购自中国药品生物制品检定所;山柰酚对照品(纯度≥98%,批号:MUST-14110508)购自成都曼斯特生物科技有限公司。8个枇杷叶样品分别来自南京(江苏)、怀化(湖南)、邵阳(湖南)、安徽、福建、浙江和云南。

1.2 对照品溶液的制备

称取芦丁、槲皮素、山柰酚对照品适量,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解至刻度,配制质量浓度分别为520、510、502 mg/L的对照品溶液,过0.45 μm滤膜,备用。

精密移取上述各对照品溶液2.5 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制质量浓度分别为130.0、127.5、125.5 mg/L的芦丁、槲皮素、山柰酚混合对照品溶液。

1.3 样品前处理

称取8个枇杷叶样品分别经干燥、粉碎、过筛(4号筛)制备枇杷叶粉末。取粉末各2.0 g,置于250 mL锥形瓶中,加入甲醇100 mL,精密称重,超声30 min后,再精密称重,用甲醇补足减失重量,加入25 mL浓盐酸,摇匀,回流酸解1 h,过0.45 μm滤膜,得样品供试品溶液,备用。

1.4 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:(A)0.4%(v/v)磷酸水溶液和(B)乙腈。梯度洗脱程序:0～15 min,83%A～72%A; 15～20 min,72%A～64%A; 20～24 min,64%A～55%A; 24～33 min,55%A～48%A; 33～35 min,48%A～40%A; 35～37 min,40%A～83%A。流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;进样体积:10 μL。

2 结果与讨论

2.1 流动相及检测波长的选择

本实验考察了不同流动相(甲醇-水、甲醇-0.4%(v/v)磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.4%(v/v)磷酸水溶液)和不同的洗脱程序对分离度的影响。在流动相为(A)0.4%(v/v)磷酸水溶液和(B)乙腈及1.4节梯度洗脱程序下,3种黄酮类成分得到良好分离,分离度均大于1.5。全波长扫描结果显示,芦丁的最大吸收峰为250 nm,槲皮素和山柰酚的最大吸收峰为360 nm,故本研究的检测波长设为250和360 nm。在360 nm下的混合对照品溶液的色谱图见图 1。

图 1 混合对照品溶液的色谱图(360 nm) Fig. 1 Chromatogram of mixed reference substance solution (360 nm)

2.2 供试液制备方法的选择

本文参考了相关文献^[8-11]和《中国药典》^[1]中样品前处理的方法,考察了枇杷叶供试液的2种不同制备方法。方法一：称取枇杷叶粉末2.0 g,加125 mL甲醇-盐酸酸解液(80∶20,v/v),超声提取1.5 h;方法二：称取枇杷叶粉末2.0 g,加100 mL甲醇超声30 min后,加25 mL盐酸回流提取1 h。结果表明,第二种提取方法对芦丁、槲皮素和山柰酚的提取量更高,故本实验采用第二种方法。

2.3 线性关系、检出限和定量限

将1.2节混合对照品溶液分别稀释2、5、10、40倍,得到不同质量浓度的混合对照品工作液,按1.4节色谱条件分析,以峰面积(Y)为纵坐标,质量浓度(X,mg/L)为横坐标,分别绘制芦丁、槲皮素和山柰酚的标准曲线。分别以3倍和10倍信噪比(S/N)对应的质量浓度计算检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果见表 1。

表 1 芦丁、槲皮素和山柰酚的线性方程、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 1 Linear equations,correlation coefficients (r),LODs and LOQs of rutin,quercetin and kaempferol

2.4 精密度试验

取1.2节混合对照品溶液,在最优色谱条件下重复进样6次,测得芦丁、槲皮素和山柰酚色谱峰面积的RSD分别为5.4%、1.2%和1.1%。结果表明该方法精密度良好。

2.5 稳定性试验

按1.2节方法配制混合对照品溶液和供试品溶液,分别于0、2、4、8、12 h进样分析,对照品溶液中芦丁、槲皮素、山柰酚色谱峰面积的RSD分别为4.91%、1.05%、1.51%,供试品溶液中芦丁、槲皮素、山柰酚色谱峰面积的RSD分别为5.42%、1.32%、1.47%。结果表明,混合对照品溶液和供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

精密称取枇杷叶(南京)粉末2.0 g (n=5),按1.3节方法制备供试液,在最优色谱条件下分析。计算得到各样品中芦丁、槲皮素、山柰酚色谱峰面积的RSD分别为5.00%、2.18%和2.46%，均符合分析测试要求。

2.7 加样回收率试验

准确称取枇杷叶(南京)粉末3.94、4.01、4.02和3.99 g,置于250 mL锥形瓶中,按1.3节方法制备供试品溶液,精密添加不同含量的芦丁、槲皮素、山柰酚对照品,使供试品溶液中3种对照品的质量浓度分别为21.00、29.00和16.00mg/L,按1.4节色谱条件进行测定,结果见表 2。

表 2 供试品溶液中芦丁、槲皮素和山柰酚的加标回收率(n=4) Table 2 Spiked recoveries of rutin,quercetin and kaempferol in test solutions (n=4)

2.8 实际样品分析

取8个枇杷叶样品的供试品溶液,在最优色谱条件下分析,其中江苏南京的枇杷叶供试品色谱图见图 2。对8个枇杷叶样品中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量进行比较(见表 3)，结果表明,不同产地的枇杷叶中3种黄酮类化合物的含量存在差异,其中芦丁的含量差异最大,山柰酚的含量最稳定,福建和南京的枇杷叶中黄酮类化合物的含量较高。

图 2 南京枇杷叶供试品溶液的色谱图(360 nm) Fig. 2 Chromatogram of a loquat leaf sample from Nanjing in test solutions (360 nm)

表 3 不同产地的枇杷叶中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量(n=3) Table 3 Contents of rutin,quercetin and kaempferol in loquat leaves from different producing areas (n=3) mg/g

3 结论

本文建立了高效液相色谱同时测定枇杷叶中芦丁、槲皮素和山柰酚3种黄酮类成分的分析方法。该方法操作简单、灵敏度高、重复性好。利用该方法测定不同产地的枇杷叶样品,发现3种黄酮类化合物的含量在产地间差异较大。其中芦丁的含量差异最大,山柰酚的含量稳定性最好,建议用作枇杷叶药材及其制剂成品质量控制的标志成分。

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