氟喹诺酮(fluoroquinolones, FQs)药物是一类人工合成的广谱抗菌药, 因其具有抗菌谱广、杀菌能力强、半衰期长等特点而广泛用于动物和人类感染性疾病的预防和治疗[1]。该类药物容易在动物组织中蓄积而导致药物残留, 长时间使用还会使致病菌产生耐药性, 对人类健康危害较大[2, 3]。因此, 基于保护消费者健康安全的目的, 许多国家都制定了氟喹诺酮类药物在动物性食品中的最高残留限量[4, 5]。为更好地保障人类健康安全, 我国农业部于2015年发布了第2292号公告[6]:禁止在动物饲养中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种药物。目前我国已对9种氟喹诺酮类药物的使用进行了明确规定，因此, 亟需开展动物性食品中上述9种药物残留检测技术的研究，以满足日常监管的需要。
动物性食品样品的基质与组成相当复杂, 目标物易被干扰, 因此, 样品前处理成为动物性食品残留检测分析的关键步骤。液液萃取法[7, 8]、基质固相分散萃取法[9]、固相萃取法[10-13]等是目前最常用的样品前处理方法, 液液萃取法通常需大量的化学试剂, 且操作复杂; 固相萃取技术具有操作简单、价格低廉、易于自动化的优点, 但常规的固相萃取吸附剂为非特异性吸附, 吸附性和选择性较差, 对复杂样品的净化和富集较难。因此, 开发免疫亲和色谱[2, 14, 15]、分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer, MIPs)[16-18]等具有高选择性的吸附剂具有重要意义。免疫亲和色谱柱需大量高质量的抗体, 价格昂贵且不易制备, 因而在实际监管时，大批量的使用受到限制。MIPs作为一种新型材料, 俗称“塑料抗体”, 能够特异性的识别与吸附目标物及其结构类似物，具有稳定性好、耐酸碱等特点, 适于分离、富集复杂样品中的痕量分析物[17-19]。MIPs作为固相萃取的吸附剂在动物性食品安全监测中受到越来越多的关注[19, 20]。Urraca等[21]建立了分子印迹固相萃取(molecularly imprinted solid phase extraction, MISPE)结合液相色谱-串联质谱测定鸡肉中FQs残留的方法, 但其仅能对恩诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、单诺沙星、诺氟沙星、沙拉沙星6种FQs药物进行检测。本研究基于MISPE的特异性, 通过优化上样、淋洗、洗脱及液相色谱分离、质谱检测等条件, 建立了一种MISPE-超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定鸡肉中9种FQs残留的分析方法。
Acquity UPLC-Xevo TQ MS超高效液相色谱-串联质谱仪、固相萃取装置(美国Waters公司); 5804R台式高速冷冻离心机、微量移液器(德国Eppendorf公司); SupelMIPTM SPE(FQs, 25 mg/3 mL, 美国Sigma公司); GHP针式滤膜(0.22 μ m, 美国Pall公司)。
甲醇、乙腈均为色谱纯(德国Merck公司); 甲酸为色谱纯(北京迪马科技有限公司); 乙酸、氨水为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。
环丙沙星(ciprofloxacin, 纯度＞94%)、达氟沙星(danofloxacin, 纯度＞93.5%)、恩诺沙星(enrofluxacin, 纯度＞99%)、沙拉沙星(sarafloxacin, 纯度＞97%)、二氟沙星(difloxacin, 纯度＞98%)、诺氟沙星(norfloxacin, 纯度＞99.1%)、氧氟沙星(ofloxacin, 纯度＞99%)、洛美沙星(lomefloxacin, 纯度＞97.6%)、培氟沙星(pefloxacin, 纯度＞99%)标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。喹诺酮母核及9种氟喹诺酮药物的化学结构式见图 1。
分别准确称取9种FQs标准物质于25 mL容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 配制质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液, 于-20 ℃避光保存; 分别移取适量标准储备液, 根据需要用流动相逐级稀释，配制适当质量浓度的9种FQs混合标准工作液, 现用现配。
色谱柱:Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μ m, 美国Waters公司); 柱温:35 ℃; 流动相:(A)乙腈和(B)0.1%(v/v)甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0～2.0 min, 10%A; 2.0～3.0 min, 10%A～15%A; 3.0～4.0 min, 15%A～55%A; 4.0～5.0 min, 55%A～80%A; 5.0～5.5 min, 80%A～10%A; 5.5～7.0 min, 10%A。流速:0.3 mL/min; 进样量:5.0 μ L。
离子源:电喷雾离子(ESI)源; 正离子模式; 离子源温度:150 ℃; 检测方式:多反应监测模式(MRM); 毛细管电压:2 700 V; 雾化室温度:450 ℃; 雾化气(氮气)流量:1 000 L/h; 锥孔气(氮气)流量:50 L/h; 碰撞气(氩气)流量:0.24 L/h。
取鸡肉样品, 匀浆, 于-20 ℃保存。参照文献[11], 准确称取2.0 g均质后的鸡肉样品于50 mL离心管中, 加入8 mL 0.5 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH 5.0), 涡旋混合, 以8 000 r/min离心5 min, 收集上清液于50 mL离心管中, 用8 mL 0.5 mol/L磷酸二氢钾溶液溶解残渣, 合并上清液, 待净化。
依次用2 mL甲醇和水活化MISPE柱, 取上清液上样, 分别经2 mL水、甲醇和0.1%(v/v)氨水溶液淋洗, 用洗耳球挤干, 用3 mL 5%(v/v)氨化甲醇溶液洗脱, 将洗脱液于50 ℃水浴下氮气吹至近干, 用1 mL 0.1%(v/v)甲酸-乙腈(9:1, v/v)复溶, 过0.22 μ m滤膜, 供检测。
FQs的分子结构中含有羧基和叔氨基, 具有酸碱两性, 在酸性溶液的条件下呈阳离子状态, 在电喷雾正离子模式下, 极易形成[M+H]+准分子离子; 通过优化各药物的特征离子对、毛细管电压、雾化室温度、碰撞电压等质谱条件, 选取相对丰度强、干扰小的离子对作为9种FQs药物的定性、定量离子。9种待测物的保留时间、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量见表 1。为提高方法的灵敏度, 降低基质干扰, 本研究采用分段扫描的方式进行数据采集, 9种FQs药物的MRM色谱图见图 2。
MISPE柱在净化基质中的痕量目标物时，除特异性地吸附目标物外，还存在非特异性吸附，需通过优化MISPE柱的淋洗和洗脱条件，最大限度地提高MIPs结合位点与目标物间的选择性吸附, 降低非特异性吸附和基质效应[16, 18, 19]。因此, 本实验对3种镇静剂(地西泮、劳拉西泮、阿扎哌隆)、3种磺胺类(磺胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶)及3种喹诺酮类(氟甲喹、恶喹酸、萘啶酸)药物进行了MISPE特异性吸附试验，分别比较了水、甲醇、0.1%(v/v)氨水、0.5%(v/v)乙酸乙腈溶液对MISPE柱进行淋洗及2%(v/v)氨化甲醇和5%(v/v)氨化甲醇进行洗脱时，9种FQs药物及非目标物的回收率。
将含有镇静剂、磺胺类、喹诺酮类药物及9种目标物的磷酸二氢钾溶液加入MISPE柱, 分别收集上样液、淋洗液和洗脱液, 测定各药物的回收率。结果表明, 上样液流经MISPE柱后, 镇静剂、磺胺类、喹诺酮类药物不能被有效保留, 有26.4%～87.5%直接流出; 经水、甲醇、0.1%(v/v)氨水溶液淋洗后, 残留的非目标物均被淋洗下来，而目标物的回收率极低; 经淋洗液淋洗后，采用5%(v/v)氨化甲醇溶液洗脱时，仅9种FQs药物被洗脱, 且回收率均高于65%，而未发现非目标物。其原因可能是镇静剂和磺胺类药物的化学结构(见图 3)与FQs药物相差较大, 且不具有FQs侧链中的羧基、哌嗪基等活性官能团, 不易与MIPs相互作用, 在上样、淋洗过程中直接被淋洗下来; 3种喹诺酮类药物虽具有与FQs药物共同的母核结构(见图 1), 但侧链R7位无哌嗪环, 缺少与MIPs特异性结合的位点。本方法采用的MISPE柱对镇静剂、磺胺类及喹诺酮类药物无特异性吸附, 对9种氟喹诺酮药物具有良好的特异性。
柱容量是指MISPE柱的活性功能基团能够吸附待测物的最大容量, 是考察MISPE柱的重要参数之一。称取2.0 g鸡肉样品, 分别添加系列质量浓度的FQs混合标准溶液, 检测各药物的回收率, 从而计算MISPE柱的最大柱容量。结果表明, 该MISPE柱对9种目标物的最大柱容量为464.7～932.4 μ g/L(见表 2)。
在空白鸡肉样品中添加不同质量浓度的混合标准溶液, 以各药物的峰面积对质量浓度绘制标准曲线, 9种FQs的基质标准曲线与试剂标准曲线的斜率比为85.3%～113.8%。程志等[22]、Matuszewski等[23]的研究表明, 基质标准曲线与试剂标准曲线的斜率比为80%～120%时, 基质效应对各药物的影响不明显。说明本方法采用基质加标标准曲线对加标回收率进行定量时，基质效应对检测结果几乎无影响。
将空白鸡肉样品按1.4节处理后，添加不同质量浓度(0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 μ g/L)的混合标准溶液, 以各药物定量子离子的峰面积(Y)为纵坐标, 基质标准溶液的质量浓度(X, μ g/L)为横坐标，绘制标准曲线(见表 3)。各药物在0.25～100 μ g/L范围内线性关系良好, 相关系数(r)均＞0.996 5。分别以3倍和10倍信噪比(S/N)确定检出限(LOD)和定量限(LOQ), 分别为0.08 μ g/kg和0.25 μ g/kg。
分别在空白鸡肉样品中添加LOQ、10倍LOQ、20倍LOQ 3个水平(0.25、2.5、5.0 μ g/kg)的标准物质, 每个水平做6个平行试验, 重复3次, 考察方法的准确度和精密度。9种FQs的平均回收率为65.8%～112.2%, 批内和批间RSD分别为0.6%～13.5%和0.5%～14.9%(见表 4)。
采用本研究建立的方法和GB/T 20366-2006方法分别对山东省某屠宰场采集的60份鸡肉样品进行检测。结果表明, 有2份鸡肉样品中含有诺氟沙星, 其余样品均未检出FQs药物残留。本方法检测出的残留值为3.78 μ g/kg和6.27 μ g/kg, GB/T 20366-2006方法的检测值为3.05 μ g/kg和6.73 μ g/kg。两种方法检测结果基本一致, RSD＜15.1%。
本研究基于MIPs特异性吸附的特点, 有效降低了样品基质的干扰, 并通过优化MISPE柱的上样、淋洗和洗脱条件, 建立了UPLC-MS/MS测定鸡肉中9种FQs残留的分析方法。该方法选择性好、灵敏度高、重复性好且操作简单、快速, 可以用于畜禽产品质量安全监测时大批量样品中FQs药物残留的筛查和确证。
2016,
Vol. 34 Issue (11): 1063-1069
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2016,
Vol. 34 Issue (11): 1063-1069
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