色谱  2017, Vol. 35 Issue (2): 191-195   PDF    
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杜晖
李静静
范菲
杨会鸽
刘鹏鸣
郑妍
细胞膜色谱法定量分析5-羟色胺受体的别构效应
杜晖 , 李静静 , 范菲 , 杨会鸽 , 刘鹏鸣 , 郑妍     
西安市食品药品检验所, 陕西 西安 710054
收稿日期：2016-07-24
基金项目：陕西省中医药管理局科研课题（13-ZY005）
通讯联系人： 杜晖,Tel:(029)85535544,E-mail:duhui0504@126.com
摘要：建立了大鼠纹状体细胞膜色谱法研究5-羟色胺（5-hydroxytryptamine）受体1D亚型（5-HT1D）的别构效应。利用大鼠纹状体制备得到细胞膜色谱固定相，特异性地识别混合对照品中的尼群地平、欧前胡素和藁本内酯。以不同浓度（4.62×10-7~4.62×10-5mol/L）的欧前胡素为竞争剂平衡细胞膜色谱柱，考察流动相浓度的变化对样品保留行为的影响。结果表明，欧前胡素的添加可使藁本内酯与受体作用的平衡解离常数（KD）增大2.06倍，说明欧前胡素结合5-HT1D受体后会影响藁本内酯在受体上的结合强度。在流动相中添加藁本内酯（5.26×10-7~5.26×10-5mol/L），考察欧前胡素保留因子的变化，测得藁本内酯的KD为（4.15±0.12）μ mol/L，与文献报道值基本一致。该方法为定量研究受体的别构效应提供了一种全新思路。
关键词： 细胞膜色谱     5-羟色胺受体     别构效应     欧前胡素     藁本内酯    
Quantitative analysis of allosteric effects for 5-hydroxytryptamine receptor by cell membrane chromatography
DU Hui, LI Jingjing, FAN Fei, YANG Huige, LIU Pengming, ZHENG Yan     
Xi'an Institute for Food and Drug Control, Xi'an 710054, China
Foundation Item: Scientific Project of Shaanxi Administration of Traditional Chinese Medicine (No. 13-ZY005)
Abstract: A rat striatum cell membrane chromatography (CMC) method was developed for characterizing the allosteric effects for 5-hydroxytryptamine receptor subtype 1D (5-HT1D). The cell membrane stationary phase prepared by rat striatum was applied to specifically recognize the mixed standard solution of nitrendipine, imperatorin and ligustilide. Imperatorin was pumped through a CMC column continuously as a competitor to evaluate the effect of the competitor's concentrations on the retention of ligustilide. A decrease in the retention factor of ligustilide was observed in the range of 4.62×10-7-4.62×10-5mol/L. The addition of imperatorin weakened the affinity that ligustilide binding to 5-HT1D by 2.06 times, which suggested that imperatorin occupied certain binding sites of 5-HT1D on the column thus hindering the association of ligustilide. For further competitive studies, the mobile phase containing ligustilide (5.26×10-7-5.26×10-5mol/L) was pumped through the column, and imperatorin was injected onto the column. The equilibrium dissociation constant was (4.15±0.12) μmol/L for ligustilide, which corresponded well with the previous studies. The results indicated that the CMC method could be a new way for quantitative analysis of allosteric effects for 5-hydroxytryptamine receptor.
Key words: cell membrane chromatography (CMC)     5-hydroxytryptamine (5-HT) receptor     allosteric effects     imperatorin     ligustilide    

药物-受体相互作用在许多生物过程如信号转导、生理调节和基因转录等方面都起着重要的作用[1, 2]。目前研究二者相互作用的方法主要有放射配体与受体结合分析(RBA)法和亲和色谱法。RBA法中配体需用同位素标记,操作繁琐,受体纯化难度大[3];亲和色谱法多是研究药物与蛋白质而非受体的亲和作用[4-6]。细胞膜色谱(cell membrane chromatography,CMC)法已被证明是研究药物与受体作用的有力技术手段[7, 8]。实践证明,该方法使用具有分离和生物活性双重功能的细胞膜色谱固定相,可在体外动态地模拟药物与受体靶标的相互作用,其研究结果与经典的RBA结果显著相关[9-11]。

前期研究工作表明,欧前胡素和藁本内酯是川芎-白芷药对中潜在的抗偏头痛的活性成分,可通过CMC法测得藁本内酯与5-羟色胺(5-HT)受体1D亚型(5-HT1D)亲和作用的平衡解离常数(KD)[12, 13]。但是进一步研究发现,流动相中欧前胡素的存在会使藁本内酯的KD发生变化,这说明受体结合药物分子后,其构象可能会发生变化。Fitos等[14]将人血清白蛋白固定在硅胶表面,表征布洛芬等药物与蛋白质的相互作用,发现人血清白蛋白在药物的作用下可产生别构效应；Hage等[15]在Fitos等[14]的基础上研究发现在竞争剂R-和S-布洛芬存在的情况下,S-氯羟安定的KD会发生变化。目前别构效应的研究多集中于药物与人血清白蛋白的作用上[16-19]。

本实验拟通过记录样品的保留因子随竞争剂浓度变化而变化的规律,计算KD和别构常数,表征正/负别构效应,推断药物分子与受体结合的协同(竞争)关系,最终定量阐述5-HT1D受体的别构效应。

1 原理部分

当分析物A与配体M同时竞争受体R的某一位点或结合受体R的不同区域时,M与R的结合使受体发生了别构效应(见图 1),这时A与R亲和作用的平衡解离常数KAR变为了KAR′。此时样品在细胞膜色谱系统中的保留可通过式(1)[15]表示:

(1)
图 1 受体别构效应的示意图 Fig. 1 Schematic of receptor allosteric effects A: the analyte; M: the competitor with a known concentration in the mobile phase; R: the immobilized receptor on the cell membrane chromatography (CMC) column; KAR: the equilibrium dissociation constant for the binding of A and R. The association equilibrium constant for A changed from KAR to KAR′,if M induced an allosteric change in R.

当流动相中不存在配体M时,式(1)可转化为:

(2)

式(1)和(2)中,k′为样品在CMC中的保留因子;KMR为配体M和受体R作用的平衡解离常数(mol/L); [M]为流动相中M的浓度(mol/L); Rs为固定相上受体的物质的量(mol); mL1为固定相上与M结合的受体的物质的量(mol); mL2为未与M结合的受体的物质的量(mol); Vm为细胞膜色谱柱的死体积(L)。

通过式(1)和(2)可变换得到:

(3)

用别构常数βM→A来表示KAR/KAR′,并引入X值[20],这时式(3)变为:

(4)
2 实验部分
2.1 仪器与试药

U3000高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器(美国赛默飞世尔公司); HC-3018R型低温冷冻高速离心机(合肥科大创新股份有限公司);色谱预柱的柱套及配套柱芯(10 mm×2.0mm)。

尼群地平对照品(批号100585-200602)和欧前胡素对照品(批号110826-201214)均购自中国食品药品检定研究院;藁本内酯对照品为实验室自制,经HPLC测定,纯度为98.0%;甲醇为色谱纯(美国TEDIA公司);ZEX-Ⅱ大孔硅胶(5μ,10 nm)购自青岛美高化工有限公司;实验用水来自Milli-Q超纯水系统(美国密理博公司);其他试剂均为分析纯。健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(5～7周龄,约250 g)购自第四军医大学实验动物中心。

精密称取0.605 g三羟甲基氨基甲烷、0.370 g KCl、0.253 g MgSO4·7H2O于1 000 mL烧杯中,用500 mL超纯水溶解,加入适量HCl调节pH至7.4,配制浓度为10 mmol/L的低渗缓冲液,于4 ℃保存,以备用。

精密称取3.60 mg尼群地平、2.70 mg欧前胡素、5.26 mg藁本内酯于同一10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配制混合对照品溶液，于4 ℃避光保存,1周内使用。

2.2 大鼠纹状体细胞固定相的制备

将健康SD大鼠断颈处死后,迅速取出大脑,剥离纹状体,置于10 mL预冷的生理盐水中,洗尽其他残留组织,剪碎后置于冰浴内的玻璃匀浆管中匀至糜状。将糜液转入50 mL离心管中,加入20 mL生理盐水,以3 000 g离心10 min,共2次,去除上清液,用低渗缓冲液混悬沉淀,并超声破膜30 min,悬液经1 000 g离心10 min后,吸取上清液,于4 ℃以12 000 g离心20 min后,取出膜沉淀,加入10 mL预冷的生理盐水重悬,采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白质含量。将悬液一分为二,其中一份水浴加热10 min,使蛋白质变性。在真空低温的条件下将2份悬液分别加入装有0.05 g大孔硅胶粉末的具支试管中,与活化的硅胶混悬5 min后,静置12 h。装柱前,将细胞膜固定相用5 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)洗涤5次,除去未吸附的细胞膜,在高压下将其装入色谱柱中,于4 ℃冷藏保存,以备用。

2.3 色谱条件

细胞膜色谱条件:流动相为(A)5 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、(B)水和(C)用水配制而成的一定浓度的欧前胡素或藁本内酯溶液;进样量为5 μL;柱温为37 ℃;流速为0.2 mL/min。

液相色谱条件:Dikma C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温为30 ℃;等度洗脱;流动相为甲醇-20 mmol/L磷酸氢二钠(70:30,v/v;pH 4.0);流速为1.0 mL/min;进样量为5 μL;检测波长为237 nm。

2.4 大鼠纹状体细胞膜色谱的建立

用流动相A平衡细胞膜色谱柱至基线稳定后,将尼群地平、欧前胡素和藁本内酯的混合对照品溶液进样分析,记录三者的细胞膜色谱图,并分别收集各自的保留组分,进行色谱分析。

2.5 亲和作用表征

首先用流动相B平衡细胞膜色谱柱,此时流动相中不存在竞争配体,将1 mmol/L藁本内酯样品进样,记录保留时间;然后将比例由低到高的流动相C(欧前胡素的浓度分别为4.62×10-7、9.25×10-7、1.85×10-6、3.70×10-6、7.40×10-6、1.16×10-5、2.31×10-5和4.62×10-5mol/L)通过细胞膜色谱柱,直至流出液的紫外吸收达到平台值,此时再将藁本内酯进行色谱分析,记录保留时间。通过观察样品的保留因子随流动相中竞争剂欧前胡素浓度增大的变化规律,分析藁本内酯与5-HT1D受体的亲和作用特性,考察流动相中欧前胡素的添加对藁本内酯与5-HT1D亲和作用的影响。随后,将一定浓度的藁本内酯(浓度分别为5.26×10-7、1.05×10-6、2.10×10-6、4.21×10-6、8.41×10-6、1.31×10-5、2.63×10-5和5.26×10-5mol/L)通过细胞膜色谱柱,计算藁本内酯与5-HT1D的KD值。所有亲和作用参数以平均值±标准误差(Mean±SEM,n=6)表示。

3 结果与讨论
3.1 大鼠纹状体细胞膜色谱有效性的验证

欧前胡素和藁本内酯都被证明可与5-HT1D受体发生亲和作用[12, 13],而尼群地平与该受体不存在特异性结合。实验选用三者的混合对照品溶液验证系统的特异性识别能力。样品在细胞膜色谱上的保留行为见图 2a,在0.7、2.1和11.8 min有3个洗脱峰,分别记为R1、R2和R3;分别收集、浓缩上述3个洗脱组分,进行高效液相色谱分析(见图 2b),保留时间分别为4.6、7.4和15.4 min,其色谱峰峰形良好、无干扰,与混合对照品色谱图(见图 2c)比对,3个洗脱组分(R1、R2和R3)分别为尼群地平、欧前胡素和藁本内酯。

图 2 (a)尼群地平、欧前胡素和藁本内酯混合对照品溶液在细胞膜色谱模型中的色谱图、(b)洗脱组分R1、R2、R3和(c)混合对照品溶液的HPLC色谱图 Fig. 2 (a) CMC chromatogram of a mixed standard solution of nitrendipine,imperatorin and ligustilide,HPLC chromatograms of (b) R1,R2,R3 fractions and (c) a mixed standard solution of nitrendipine,imperatorin and ligustilide 1. nitrendipine; 2. imperatorin; 3. ligustilide.

将蛋白质变性的细胞膜色谱柱接入色谱系统,进行仪器分析,结果表明，大部分样品随溶剂一起流出,未得到有效保留。这说明是覆盖在大孔硅胶表面的活性细胞膜对样品的保留起了关键作用。

3.2 亲和作用的初步分析
3.2.1 欧前胡素对藁本内酯亲和作用的影响

将1 mmol/L欧前胡素和藁本内酯的对照品溶液分别注入同批生成的6根细胞膜色谱柱,记录其保留时间,计算得到二者保留时间的RSD(n=6)分别为3.86%和4.05%,用于消除后续实验中因细胞膜色谱柱间的差异引起的样品保留因子的计算误差;将上述对照品溶液连续进样50次,记录样品保留因子的衰减规律,发现两种样品的保留因子分别缩短了10.65%和11.33%,用于排除由细胞膜活性降低带来的影响。

实验发现,藁本内酯的保留因子随流动相中欧前胡素浓度的增大(4.62×10-7～4.62×10-5mol/L)而逐渐减小。当欧前胡素浓度达到2.31×10-3mol/L时,藁本内酯的保留时间基本不再变化,这时样品的保留因子(X值)为4.05。根据式(4),利用(k0-X)/(k′-k0)对1/[M]进行线性回归(见图 3a)。结果表明,其线性方程为y=-(9.41±0.16)×10-6x-(1.95±0.11)(r2=0.998 0)。其中,回归曲线截距的倒数加1即为别构常数β;斜率与截距之比即为竞争剂的KD。经计算,欧前胡素与5-HT1D亲和作用的KMR为(4.84±0.20)μmol/L,与文献报道值(4.59±0.33)μmol/L[12]接近,别构常数β为0.49±0.03。研究表明,受体发生了负别构效应,藁本内酯的KD增大了2.06倍,这说明欧前胡素作为流动相竞争剂可以减弱藁本内酯与5-HT1D的亲和作用。

图 3 (k0-X)/(k′-k0)对1/[M]的回归曲线(n=6) Fig. 3 Regression curves achieved by plotting (k0-X)/(k′-k0) versus 1/[M] (n=6) a. Results for injection of ligustilide in the presence of imperatorin in the mobile phase; b. results for injection of imperatorin in the presence of ligustilide in the mobile phase.
3.2.2 藁本内酯KD的计算

将一定浓度(5.26×10-7～5.26×10-5mol/L)的藁本内酯通过细胞膜色谱柱,记录欧前胡素在细胞膜色谱固定相上的保留(见图 3b)。结果表明,其线性方程为y=-(9.64±0.18)×10-6x-(2.32±0.11)(r2=0.997 6)。同法计算得到藁本内酯与5-HT1D的KD为(4.15±0.12)μmol/L,与文献报道的KD值(4.21μmol/L)[13]非常接近,该结果也从侧面印证了该方法的有效性和稳定性。

4 结论

本研究通过记录配体在固定相上的保留特征,利用Hage方程判断竞争剂的添加对配体亲和作用产生的影响。研究结果表明,欧前胡素结合5-HT1D受体后会降低藁本内酯在受体上的结合强度,药物分子间与受体的结合存在竞争关系。这为表征不同药物分子间与受体结合关系提供了新的研究思路,也拓展了方法的应用范围。但是细胞膜色谱有它的特殊性,载体表面细胞膜的活性呈不断下降的趋势。这些应用对方法的分析时间、灵敏度和固定相的均一性提出了更高的要求,需要我们进一步完善细胞膜色谱柱的制备及其相关技术。

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