药物中即使微小杂质的存在都会影响药效甚至用药安全性[1]。药物杂质可分为有机[2]、无机[3]和残留溶剂[4]三大类。离子型杂质一般包括药品生产过程中处理大批原料时带入的试剂、催化剂、配体、重金属等物质。虽然许多离子型杂质在低浓度时毒性较低,但通过监测各批次药品之间的杂质差异可以对药品生产过程的质量控制提供依据,如若发现同一药品在不同批次下的杂质含量差异显著,则说明该药品生产过程中质量控制出现问题。因此,在制药工业中鉴别、定量测定和控制无机杂质是十分重要的。
离子色谱法是测定无机阴阳离子的理想方法[5-7],但药物基体复杂,一般需要借助有机试剂(如甲醇)溶解才能将其中的无机离子完全萃取出来,而有机溶剂不可避免地会萃取药物中的一些有机物质,如果溶解液直接进入色谱柱,药物中的有机基体会吸附在色谱柱上而使柱效下降。阀切换[8-13]是一种能够除去离子色谱样品中有机基质的在线前处理技术,具有简单、快捷等显著特点。
氯离子和三氟乙酸根是难溶性药物(如头孢克肟、月桂酰吲达帕胺、布地奈德等)在生产过程中最容易引入的离子型杂质,它们的大量存在会使得药物的稳定性降低,甚至影响药效。因此,本文建立了一种利用阀切换技术,直接进样在线前处理消除基体干扰,离子色谱测定药物中氯离子和三氟乙酸根的分析方法,取得了令人满意的结果。
Aquion离子色谱仪(美国ThermoFisher公司),配电导检测器,Chromeleon色谱工作站;IonPac AS23(250 mm×4 mm)分离柱,IonPac AG23(50 mm×4 mm)保护柱;AMMS-300型电化学自再生抑制器;IonPac TAC-UPL1浓缩柱;AXP Pump辅助泵;电磁十通阀;0.22 μm尼龙滤膜过滤头。
Cl-标准溶液(1 000 mg/L,上海市计量测试研究院),三氟乙酸为分析纯(Sigma公司)。甲醇(色谱纯,Fisher公司),实验用水均为18.2 MΩ\5cm的二次去离子水。配制质量浓度为1 000 mg/L的三氟乙酸储备液;然后用其与Cl-标准溶液配制成系列质量浓度的混合标准溶液。实验用药品头孢克肟、月桂酰吲达帕胺、布地奈德均从医院药剂房领用。
准确称取样品25 mg置于50 mL容量瓶中,加入稀释液(水-甲醇,4∶1,v/v),超声使其溶解均匀,用稀释液定容至刻度,摇匀,经0.22 μm过滤后,滤液供IC分析。
淋洗液:3.5 mmol/L碳酸钠+1.0 mmol/L碳酸氢钠,等度淋洗;流速:1.0 mL/min; AMMS-300(4 mm)化学抑制模式,抑制液:20 mmol/L硫酸水溶液;进样体积:25 μL; AXP辅助泵流速:0.55 mL/min。
通过3个步骤完成难溶性药物中痕量阴离子的分析:1)将已溶解的样品充满定量环;2)被测离子富集在浓缩柱上、有机分子被洗脱;3)洗脱被保留的离子。
将样品充满25 μL定量环(至少通过4倍定量环体积的样品,4×25 μL=100 μL),用稀释液(水-甲醇,4∶1,v/v)以淋洗液相反的流向将样品推至浓缩柱。稀释液的流速为0.55 mL/min,阴离子被保留在浓缩柱上,药物有机分子在浓缩柱上不保留而被稀释液冲洗出来;最后切换六通阀(切换时间2.5 min),淋洗液将浓缩柱上的阴离子洗脱下来,并在AS23分析柱上进行分离检测。仪器结构示意图见图 1。
因为样品在水溶液中不溶解。准确称取样品25 mg置于50 mL容量瓶中,加入1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1 (v/v)的水-甲醇进行溶解性实验。发现有机溶剂比例过大,污染环境;有机溶剂比例过小,样品不溶解。因此选择4∶1 (v/v)的水-甲醇作为稀释液。
阴离子交换色谱柱的交换基团主要分为两大类:季铵烷功能基和季铵烷醇功能基。三氟乙酸根等离子易极化,所以选择亲水性较强的季铵烷醇功能基色谱柱IonPac AS23,被测离子峰对称性好,灵敏度更高。
季铵烷醇功能基色谱柱IonPac AS23是碳酸盐淋洗液体系与KOH淋洗液体系两用色谱柱。样品中只有氯离子与三氟乙酸根两个被测组分,因此选择碳酸盐淋洗液体系对样品进行测定。实验中采用3.5 mmol/L碳酸钠+1.0 mmol/L碳酸氢钠作为淋洗液时,氯离子、三氟乙酸根可与其他常见阴离子得到较好的分离。
进样后,用稀释液将样品带至浓缩柱,预富集的阴离子保留在浓缩柱中,有机药物分子不保留而直接从浓缩柱中洗脱到废液；待冲洗完全后,切换六通阀,分析泵中的淋洗液将浓缩柱中的阴离子带至分离柱中分析,电导检测。通过探究实验发现2.5 min后有机药物分子冲洗完全。所以确定切换阀的切换时间是2.5 min。
精密量取标准储备液配制成0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mg/L的混合标准溶液,依次进样,以峰面积为纵坐标,标准溶液质量浓度为横坐标建立标准工作曲线,其线性回归方程、相关系数及线性范围见表 1,实验结果表明,这些离子都具有良好的线性关系。标准溶液的色谱图见图 2。
吸取氯离子与三氟乙酸质量浓度为1.00 mg/L的混合标准溶液,重复进样11次,记录色谱图,它们保留时间的RSD分别为0.27%、0.49%,峰面积的RSD分别为1.13%、0.84%,峰高的RSD分别为1.06%、0.72%,精密度较好。
在1.3节所述实验条件下,以信噪比(S/N)为3计算检出限,氯离子与三氟乙酸根的检出限依次为0.006 mg/L、0.06 mg/L。
按1.2节样品预处理方法对难溶性药物样品进行前处理,并按1.3节色谱条件进行测定,外标法定量,得到3种样品中氯离子和三氟乙酸根的含量(见表 2)。从表 2可以看出,这三类难溶性药物中的氯离子含量较为接近,而三氟乙酸根离子的含量则相差较大。其中月桂酰吲达帕胺药物中这两种离子的含量均较其他两种药物少。
为检验方法的准确性,选取头孢克肟样品做3个不同水平的加标回收试验,其分析结果及回收率结果见表 3,结果表明该方法符合分析要求。样品色谱图见图 3。
本文建立的阀切换-离子色谱测定难溶药物如头孢克肟、月桂酰吲达帕胺、布地奈德中阴离子的方法,无需繁复的样品前处理步骤,方法简便、快捷,线性范围内相关性好,准确度高,受其他因素干扰小,可用于实际药物样品中氯离子及三氟乙酸根的快速同时测定,该分析方法在药品中离子型杂质的检测方面具有较高的实用价值。
2016,
Vol. 34 Issue (10): 960-963
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