表面引发原子转移自由基聚合(surface-initiated atom transfer radical polymerization,SI-ATRP)是一种强大且灵活的合成技术,其适用的单体范围广,反应条件温和,分子设计能力强,可合成预定结构和序列的聚合物[1-3]。Wang等[4]通过反ATRP技术制备手性整体固定相,以β-环糊精(β-CD)作为手性选择剂,采用ATRP技术在表面接枝亲水聚合物刷来提升柱的生物兼容性,将此材料结合HPLC检测血浆中的手性药物。Lv等[5]通过逐层修饰成功制备了限进介质分子印迹磁性微球,用于磁性微萃取牛奶中的双酚A,此限进介质分子印迹磁性微球选择性高,避免了生物样品中蛋白质在微球表面的沉积。
限进材料是20世纪80年代[6, 7]发展起来的一种用于生物样品直接进样的固相萃取材料。最初,Boos等[8-10]提出烷基-二醇基限进材料(alkyl-diol-silica,ADS),并结合HPLC检测血浆、尿液等样品中的药物分子。喻昕等[11]提出了一种制备ADS固定相的改进方法。限进材料提供了以下优势[12-14]:第一,材料的亲水性外表面可以防止样品基质中的蛋白在表面发生不可逆吸附,延长使用寿命,减少成本;第二,材料内表面的配体可以变换不同的基团种类,如C4、C8、C18或离子交换官能团等;第三,将新型材料与简便、多样及相容性较高的HPLC或LC-MS等分析系统相结合[15-17],为生物样品中药物残留检测提供了一条非常有前景的发展途径。Wang等[18]把β-环糊精固定在硅胶内部,构建手性结合层,再通过SI-ATRP反应把甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝到表面,用该手性限进材料检测并拆分生物样品中的扁桃酸和氯噻酮。Wang等[19]在硅胶表面引入十八烷基链和苄基氯,通过SI-ATRP接枝甲基丙烯酸环氧丙酯,水解得到表面含二醇基的反相限进材料,用于牛奶中邻苯二甲酸酯类物质的分离富集,但接枝十八烷基链没有采用SI-ATRP技术,以致单体接枝不够均匀,接枝密度不够高。
甲基丙烯酸十八烷基酯[20]是具有18个碳的直链烷烃,但将其应用于限进材料的制备未见报道。近年来已有将ATRP技术用于制备限进材料的文献,但功能单体接枝量和接枝密度都有待提升。本文通过二步SI-ATRP技术在硅胶表面接枝两种不同的功能单体,接枝量高,接枝密度大。新型反相限进材料外表面的亲水层有效避免样品基质的干扰,对小分子具有萃取能力,但选择性不够高,有待继续研究。最后以新型反相限进材料为萃取基质,结合HPLC检测牛奶样品中的土霉素(OTC)。
LC-20AT高效液相色谱仪、傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津公司),TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),Vario ELII元素分析仪(德国Elementar公司)。
100～200目硅胶(青岛海洋化工有限公司);甲基丙烯酸十八烷基酯(纯度96%,含质量分数为0.01%的氢醌-甲基醚稳定剂)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA,纯度97%)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(纯度98%)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM,纯度99%)、OTC(纯度99%)、CuBr(化学纯)、2,2-联吡啶(纯度99%)、2-溴异丁酰溴(纯度97%)、牛血清白蛋白(BSA,纯度98%)(上海晶纯试剂有限公司);浓盐酸、浓硫酸、异丙醇、甲醇、三乙胺、乙二胺四乙酸二钠、四氢呋喃、甲苯均为分析纯(天津市大茂化学试剂厂);牛奶(购于当地超市,宁夏夏进乳业集团股份有限公司)。其他试剂均为国产分析纯。
称取10.0g硅胶置于250 mL圆底烧瓶中,加入100 mL 20%(体积分数)盐酸,超声分散均匀,于110 ℃油浴中回流8 h。水洗至中性,用乙醇和丙酮各洗3次,于120 ℃真空干燥。取3.0 g活化硅胶置于圆底烧瓶中,加50 mL无水甲苯,超声分散均匀。在N2保护下缓慢滴加5.20 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷,于110 ℃反应24 h。用甲苯、丙酮各洗3次,于60 ℃真空干燥,即得到Silica-NH2。
冰浴条件下,将3.0 g氨丙基硅胶分散于30 mL无水四氢呋喃中,搅拌1 h,加入2.3 mL三乙胺,再逐滴加入1.5 mL 2-溴异丁酰溴,混合物在0 ℃下搅拌30 min,室温反应24 h。用四氢呋喃、甲醇和水依次洗涤,于60 ℃真空干燥,即得到Silica-Br。
圆底烧瓶中加入3.0 g溴代硅胶作为引发剂,加入143 mg CuBr和312 mg 2,2-联吡啶。另一圆底烧瓶中加20 mL无水甲苯和20 mL甲基丙烯酸十八烷基酯,采用真空惰性气体操作管线装置,充氮除氧30 min,在N2保护下于60 ℃反应24 h,分别用异丙醇、二次蒸馏水、0.2 mol/L乙二胺四乙酸二钠水溶液、水和乙醇洗涤,于60 ℃真空干燥,即得到Silica-Br-C18。
圆底烧瓶中加入3.0 g接枝C18的溴代引发剂硅胶、0.40 g CuBr和1.28 g 2,2-联吡啶。另一圆底烧瓶加入100 mL异丙醇和10 mL GMA,超声分散均匀。采用真空惰性气体操作管线装置,充氮除氧30 min。在N2保护下于40 ℃反应24 h,通入空气终止反应,依次用异丙醇、甲醇、水、0.2 mol/L乙二胺四乙酸二钠水溶液、水和丙酮洗涤,于60 ℃真空干燥,即得到Silica-Br-C18-GMA。
所得产物(Silica-Br-C18-GMA)置于100 mL圆底烧瓶中,加入60 mL 0.1 mol/L硫酸,60 ℃水解12 h,反应完毕后,水洗至中性,于40 ℃真空干燥,即得到新型反相限进材料(Silica-Br-C18-GMMA)。
为体现新型反相限进材料的限进特点,选择BSA作为排阻蛋白质大分子模型来评价其外表面的亲水性特点。BSA是相对分子质量约为 68 kDa的疏水性蛋白质,经常用于模拟生物环境实验。选择结构不同的SDM和OTC作为小分子模型(见图 1)来评价其内表面十八烷基链的萃取能力,通过静态吸附实验研究该新型反相限进材料对小分子的萃取能力。
在6 mL固相萃取(SPE)小柱内分别填充200 mg Silica-Br-C18-GMMA和200 mg Silica-Br-C18,使柱床体积为2 mL,柱上下两端用多孔性的聚四氟乙烯筛板,使小柱装填均匀且空隙较少。装填完成后,用1 mL甲醇和3 mL水平衡小柱,注入3 mL 1 g/L BSA溶液,收集流出液,用紫外分光光度计在280 nm处检测不保留的BSA的吸光度。再用2 mL水淋洗,用2 mL甲醇洗净小柱。
取20 mg Silica-Br-C18-GMMA于50 mL具塞锥形瓶中,以甲醇为溶剂分别配制一系列不同质量浓度的SDM和OTC溶液,25 ℃下振荡吸附12 h,离心,取上清液过0.45 μm滤膜,用紫外分光光度计在270 nm处检测溶液中的SDM,在365 nm处检测溶液中的OTC,重复实验3次。根据吸附前后溶液中质量浓度的变化,计算出该新型反相限进材料对SDM和OTC的平衡吸附量。平衡吸附量按公式(1)计算：
其中,Q为吸附量(mg/g),Co和Ce分别为初始浓度和平衡浓度(g/L),V为溶液体积(mL),m为反相限进材料的质量(g)。
取10.0 mL牛奶样品置于50 mL离心管中,加入一定量OTC,加20 mL乙腈,振荡混合均匀,超声20 min,以4 000 r/min的速度离心10 min,上清液过0.22 μm滤膜,备用。
准确配制一系列质量浓度为4～10 mg/L的OTC标准溶液。牛奶样品中OTC加标量分别为3、5和9 mg/L,以新型反相限进材料作为萃取基质对样品进行分离纯化,用HPLC检测牛奶中OTC的含量。
色谱柱:Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:质量分数为0.1%的乙酸铵水溶液-乙腈(87:13,v/v);检测波长:353 nm;流速:1 mL/min;进样量:20 μL。
新型反相限进材料采用二步SI-ATRP技术在硅胶内外表面分别接枝甲基丙烯酸十八烷基酯和GMA链,合成路线见图 2。以硅胶为基质,表面引入氨基后,与2-溴异丁酰溴反应得到溴代引发剂硅胶。选择CuBr/2,2-联吡啶为催化体系,甲基丙烯酸十八烷基酯和GMA分别为功能单体,分别在无水甲苯和异丙醇中进行二步自由基引发聚合,水解得到表面含二醇基的一种新型反相限进材料。得益于SI-ATRP技术,新型反相限进材料的疏水层和亲水层接枝均匀,两种功能单体接枝密度高,提高了对小分子的萃取能力和排阻蛋白质的能力。
红外光谱常用来鉴定样品表面所含有的功能基团。图 3是Silica-Br、Silica-Br-C18、Silica-Br-C18-GMA和Silica-Br-C18-GMMA的红外光谱图。808 cm-1为-C-Br的伸缩振动峰,证实溴代引发剂硅胶已制备成功。1 102 cm-1为-C-O的伸缩振动峰,1 736 cm-1为-C=O的伸缩振动峰,2 856 cm-1为-CH2的不对称伸缩振动峰,2 929 cm-1为-OH的伸缩振动峰。对比图 3中曲线b、c和a可看出,-C-O的伸缩振动峰、-C=O的伸缩振动峰和-CH2的不对称伸缩振动峰增强,说明通过二步SI-ATRP反应,活性自由基Br·成功引发单体聚合,使甲基丙烯酸十八烷基酯和GMA这两种单体成功接枝到硅胶表面。对比图 3中曲线c和d,-OH的伸缩振动峰也明显增强,说明环氧基开环成功。
对Silica-Br、Silica-Br-C18和Silica-Br-C18-GMMA进行元素分析,分析数据见表 1。经二步SI-ATRP反应后,Silica-Br-C18-GMMA与Silica-Br相比,C元素含量由10.1%增至33.71%,H元素含量由1.88%增至4.95%,充分说明甲基丙烯酸十八烷基酯和GMA成功接枝到硅胶表面。
热重分析是测定表面修饰聚合物接枝量的重要手段[21],图 4是Silica-Br、Silica-Br-C18和Silica-Br-C18-GMMA的热重分析图。Silica-Br在29～270 ℃时失重百分比为8.03%,主要由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和2-溴异丁酰溴的热分解造成。Silica-Br-C18在26～260 ℃和220～800 ℃时失重百分比分别为4.82%和28.20%,与Silica-Br相比,失重相对较大,这是由交联剂和接枝到硅胶内表面的甲基丙烯酸十八烷基酯的损失造成。Silica-Br-C18-GMMA在160～787 ℃时失重最大,失重百分比为55.49%,这主要是甲基丙烯酸十八烷基酯和GMA链的损失所致。由此可证实两种单体成功接枝在硅胶表面。
相同条件下,Silica-Br-C18和Silica-C18-GMMA的蛋白质排阻回收实验数据见表 2。Silica-Br-C18通过SI-ATRP反应在硅胶表面只接枝C18烷基链,疏水性较强,与BSA通过静电作用结合,其结合BSA的量为22.9%。Silica-C18-GMMA与BSA的结合量为12.4%,低于Silica-Br-C18,这是因为该材料外表面的二醇基具有亲水性,对BSA具有屏蔽作用,使其不能进入内表面,说明新型反相限进材料对BSA具有排阻能力。
以SDM和OTC作为小分子模型,研究Silica-Br-C18-GMMA对小分子的吸附性能,结果见图 5。随着SDM初始浓度的增大,吸附量逐渐增大,当浓度大于0.9 mmol/L后趋于吸附平衡,最大吸附量为18.08 mg/g。随着OTC初始浓度的增大,吸附量逐渐增大,当浓度大于0.15 mmol/L后,吸附量基本保持不变,最大吸附量为4.4 mg/g。Silica-Br-C18-GMMA材料内表面键合非极性的十八烷基链,与SDM和OTC的相互作用主要是疏水作用。从二者结构看,OTC中含有6个羟基,极性大于SDM,所以OTC的疏水作用小于SDM,故SDM的吸附量大于OTC的吸附量;从空间位阻看,可能由于限进材料外表面具有大量羟基,分子量小的SDM更容易进入内表面与十八烷基链产生相互作用。SDM和OTC在新型反相限进材料上都有一定量的吸附,证明新型反相限进材料除了外表面具有亲水的二醇基之外,其内表面的C18链具有萃取小分子物质的能力,体现出新型反相限进材料的双官能团特点。
用HPLC检测处理过的牛奶样品,结果未检测到OTC。以新型反相限进材料为萃取基质,进行OTC加标回收试验。
使用新型反相限进材料结合HPLC分离富集并检测牛奶样品中的OTC。图 6a为9 mg/L OTC标准溶液的色谱图,出峰时间为9 min；图 6b为牛奶加标OTC(9 mg/L)样品经新型反相限进材料处理的液相色谱图；图 6c为牛奶空白样品。以OTC的峰面积y对质量浓度x(mg/L)做标准曲线,线性方程为y=15.907x-41 617,相关系数为0.992 7,表明OTC在对应的4～10 mg/L范围内具有良好的线性关系。OTC的平均加标回收率为89.19%(n＝3),其RSD为3.03%。
本文采用二步SI-ATRP技术将甲基丙烯酸十八烷基酯和GMA键合到硅胶表面,制得新型反相限进材料。傅里叶变换红外光谱分析、元素分析和热重分析数据均表明两种功能单体接枝成功。考察新型反相限进材料结合固相萃取小柱对蛋白质大分子的排阻性能,通过对比发现其对蛋白质的排阻效果良好;通过吸附实验发现其对结构不同的小分子物质具有一定的吸附能力,说明内表面的十八烷基链具有萃取能力。该材料作为吸附剂,用于分离富集牛奶样品中的OTC,效果良好。该新型反相限进材料有望应用于含有白蛋白、免疫球蛋白或血纤维蛋白原等大量蛋白质的复杂生物样品的前处理和药物小分子的检测。
2017,
Vol. 35 Issue (2): 150-155
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