多肽类药物是由氨基酸缩合而成的碱性多肽类化合物,在畜牧业生产中常作为治疗消化系统、呼吸系统、泌尿系统感染的兽药,也可作为饲料添加剂预防动物疾病和促进动物生长。常用多肽类药物包括粘杆菌素A、粘杆菌素B、多粘菌素B、杆菌肽A、维吉尼霉素M等,其中维吉尼霉素M是一种含内酯环的小分子多肽类药物[1]。多肽类药物对肾、神经系统有一定毒性,可通过食物链危害人类健康。为保障食品安全,我国农业部规定肌肉、内脏、牛奶、禽蛋中多肽类药物的最高残留限量为50～500 μg/kg[2],同时日本、美国、欧盟也制定了最高残留限量。为满足当前食品法规的要求,建立一种多肽类药物残留的分析方法是非常必要的。
目前多肽类药物的研究方法主要有酶联免疫法[3]、毛细管色谱法[4]、液相色谱-荧光法[5]、液相色谱-蒸发光散射检测法[6]、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[7, 8]等。LC-MS/MS法已广泛用于肌肉[9]、牛奶[10]、肝脏[11, 12]等动物源性食品中一种或多种多肽类药物的测定。但多肽类药物的分析仍存在以下技术难题:(1)多肽类药物稳定差,操作过程中易发生降解和吸附现象,影响测定结果的准确性;(2)动物组织中内源性蛋白质易发生自酶切,生成蛋白多肽,它们与多肽类药物的结构、性质相似,这些物质可干扰提取、色谱分离和质谱离子化等;(3)多肽类药物具有多种同分异构体,要求目标分析物覆盖范围广。本方法以解决现行技术难题为出发点,优化了测定5种多肽类药物的关键技术参数,利用液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-Q/Exactive)灵敏度高、抗干扰能力强的特点,通过二级子离子全扫描提高定性的准确性,最终建立了一种可快速测定5种多肽类药物残留的分析方法。
HPLC-Q/Exactive(美国Thermo Fisher公司)配Xcalibur 2.0、Mass Frontier 7.0、Trace Finder 3.0软件;S22H超声波清洗剂机(厦门致微仪器公司); CT-6E型离心机(日本日立公司)。
甲醇、乙腈和乙酸(色谱纯,质量分数99%,美国Fisher公司);甲酸(色谱纯,质量分数99%,美国Tedia公司)。杆菌肽A(质量分数78.2%)、多粘菌素B(质量分数85.7%)、粘杆菌素A(质量分数80.3%)+B(质量分数20.0%)混合物、维吉尼霉素M(质量分数90%)等标准品均购于德国Dr. Ehrenstorfer公司。实验用水为Millipore系统制得的高纯水(≥18 MΩ·cm)。
分别称取10 mg标准品于100 mL聚丙烯材质容量瓶中(维吉尼霉素M可采用玻璃材料容量瓶),加入甲醇溶解并定容,配制成质量浓度为100 mg/L的单标准储备溶液,保存于-18 ℃,有效期为6个月。分别取适量上述储备液,混合,用甲醇-水(体积比为1:1)配制成质量浓度为1 mg/L的混合工作溶液,储存于聚丙烯材质容器中,保存于4 ℃,有效期为1个月。取1 mL 1 mg/L的混合工作溶液,用1%(体积分数)乙酸乙腈-水(体积比为8:2)稀释至10 mL,配制成质量浓度为100 μg/L的混合标准溶液,溶液储存于聚丙烯材质容器中,保存于4 ℃,有效期为1周。
准确称取5.0 g样品置于50 mL聚丙烯离心管中,加入25 mL 1%(体积分数)乙酸乙腈-水(体积比为8:2),涡旋混合5 min,超声提取20 min,涡旋混合5 min,以4 000 r/min的速度离心10 min,取上清液,经0.22 μm滤膜过滤后,收集于聚丙烯进样瓶中进行Q/Exactive测定。
色谱柱:Thermo Hypersil Gold C18 (50 mm×2.1 mm,1.9 μm);流动相:乙腈(A相)和体积分数为0.1%的甲酸(B相);流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0～1.0 min,10%A; 1.0～2.5 min,10%A～60%A; 2.5～4.0 min,60%A～80%A; 4.0～5.0 min,80%A; 5.0～8.0 min,10%A。
检测器:Q/Exactive;离子化方式:电喷雾正离子(ESI+);蒸发温度:320 ℃;毛细管温度:350 ℃;喷雾电压:3 500 V;鞘气压力:344.8 kPa;辅助气压力:172.4 kPa;监测模式:目标物子离子全扫描(targeted-MS2);隔离窗口:m/z 1.2;二级分辨率:35 000;自动增益控制:106; C-Trap离子注入时间:150 ms;碰撞能量:20 eV。5种多肽类药物母离子和子离子精确质量数见表 1。二级质谱扫描时间:分析物保留时间±0.5 min。Trace Finder 3.0参数:将表 1中化合物离子导入,建立多肽类药物数据库,设定质量精度阈值为1×10-5,用于自动定性检索。
多肽类药物结构中含多个氨基和羧基,属极性化合物,常采用强酸性溶液(高氯酸、三氯乙酸、盐酸)、极性有机溶剂和有机溶剂-酸性溶液提取动物源性食品中的多肽类药物残留[13]。本方法以含粘杆菌素A+B残留的猪肝、含肝菌肽A的鸡肝为试验样品,比较了5%(体积分数)三氯乙酸、2%(体积分数)甲酸、甲醇、乙腈、1%(体积分数)乙酸甲醇-水(体积比为8:2)、1%(体积分数)乙酸乙腈-水(体积比为8:2)的提取效果。结果表明用5%(体积分数)三氯乙酸提取时,受离子抑制效应的影响,提取液不能直接进行Q/Exactive质谱分析,需增加固相萃取(SPE)操作。用2%(体积分数)甲酸提取肝脏、肾脏、鸡蛋时,提取液浑浊。用甲醇和乙腈提取时,猪肝中粘杆菌素A的测定结果为62.5μg/kg(RSD=12.2%,n=6),粘杆菌素B的测定结果为21.4 μg/kg(RSD=16.7%,n=6),鸡肝中肝菌肽A的测定结果为251.2 μg/kg(RSD=14.3%,n=6)。相对于甲醇、乙腈提取,用1%(体积分数)乙酸甲醇-水(体积比为8:2)、1%(体积分数)乙酸乙腈-水(体积比为8:2)提取时,粘杆菌素A、粘杆菌素B和肝菌肽A的测定结果增加了13.5%～26.5%,但用1%(体积分数)乙酸甲醇-水(体积比为8:2)提取时,色谱峰拖尾。综上,最终选用1%(体积分数)乙酸乙腈-水(体积比为8:2)作为提取溶剂。
为优化多肽类药物的提取条件,阴性鸡肉、鸡肝、牛奶样品中添加200 μg/kg混合标准溶液,分别采用以下方法测定5种多肽类药物的回收率:A.涡漩振荡5 min; B.完成A后,再超声提取20 min; C.完成B后,再涡漩振荡5 min; D.完成C后,静置2 h; E.完成C后,静置过夜。结果表明,维吉尼霉素M的回收率随着操作时间的延长而提高,其他4种多肽类药物的回收率均在采用方法C时最高(回收率≥71.5%)。因此,本方法采用方法C(涡漩振荡5 min,超声提取20 min,涡漩振荡5 min),样品提取时间约为30 min。
文献[14, 15]报道多肽类药物的净化方法以SPE技术为主,本方法对比了弱羰酸阳离子填料(WCX)、亲水-亲脂平衡填料(HLB)、新型亲水-亲脂填料(PRiME HLB) SPE和未净化直接测定的结果。如图 1所示,PRiME SPE法和直接测定法测定5种多肽类药物时回收率相当,因此本方法采用直接测定法。
取不含5种多肽类药物的鸡肉、鸡肝、鸡肾、猪肉、猪肝、猪肾、牛奶、鸡蛋样品,按1.3和1.4节步骤进行处理和测定,制得8种阴性样品溶液。为评价基质效应,取100 μL质量浓度为1 mg/L的混合工作溶液,分别加入900 μL阴性样品溶液,配制质量浓度为100 μg/L的5种多肽类药物基质标准溶液。同时将该基质标准溶液与100 μg/L混合标准溶液峰面积响应值进行对比,发现5种多肽类药物在质谱检测时存在明显的离子抑制/增强现象。维吉尼霉素M在以上基质中均出现离子增强现象,在牛奶、肌肉、鸡蛋中响应增强23.5%～57.8%,在肝脏和肾脏中增加11.4%～31.1%;相反,粘杆菌素A、粘杆菌素B、多粘菌素E、杆菌肽A均出现离子抑制现象,在牛奶、肌肉、鸡蛋中降低28.4%～59.5%,在肝脏和肾脏中降低10.1%～42.9%。试验数据表明,多肽类药物在富含蛋白质的样品中基质效应更高。目前还未有商品化多肽类同位素标准物质,为保证测定结果的准确性,本方法采用基质标准曲线弥补基质效应,实现分析物的准确定量。
在优化5种多肽类药物时发现粘杆菌素A、粘杆菌素B和多粘菌素B在玻璃器皿中易产生吸附降解,24 h内信号降低13.5%～56.3%。装入玻璃材质进样瓶中采用HPLC-Q/Exactive自动序列进样时,标准溶液线性相关系数不大于0.945 1。将样品装入聚丙烯材质的进样瓶中进行测定,5种质量浓度为100 μg/L的混合标准溶液3天内的平均测定值为101.4 μg/L(RSD=7.3%),基质标准溶液3天内平均测定值为99.8 μg/L(RSD=7.1%)。因此本方法操作时要避免使用玻璃材料器皿。
3种多肽类药物(粘杆菌素A、粘杆菌素B和多粘菌素B)易受色谱条件的影响。图 2对比了采用甲醇、乙腈作为有机流动相时,3种多肽类药物的分离效果。甲醇作为流动相时响应强度高,但3种多肽类药物出现双峰和拖尾峰现象;采用乙腈作为流动相时,5种多肽类药物均获得对称的色谱峰形。因此本方法采用乙腈作为有机流动相。
除维吉尼霉素M在正离子扫描时获得最强[M+H]+峰外,其他4种多肽类药物在一级母离子扫描时均呈多电荷特征分布,以带3个电荷的离子丰度最强,[M+3H]3+(100%)＞+[M+2H]2+(33.5%～45.5%)＞+[M+H]+(0～1%)。本方法以维吉尼霉素M的[M+H]+和4种多肽类药物的[M+3H]3+为目标离子采集二级子离子扫描数据,采用Mass Frontier 7.0软件分析子离子碎片,结果表明小分子化合物维吉尼霉素M的特征子离子以脱水、失去C9H17NO2途径获得,其他4种多肽类药物的裂解以终端侧链断裂为主要裂解途径。粘杆菌素A和B、多粘菌素B具有相同单电荷子离子碎片(m/z 101.090 7),肝菌肽A获得最强双电荷子离子(m/z 669.336 5)。在targeted-MS2模式下,5种多肽类药物测定结果的质量精度均小于5×10-6。
Q/Exactive的四极杆质量分析器可通过设定隔离窗口过滤进入高分辨质谱的离子。图 3对比了隔离窗口为m/z 0.7～4.0时分析物响应强度的变化。随着隔离窗口的增大,5种多肽类药物的响应强度呈逐渐增强趋势,但进入高分辨质谱的干扰离子增多。当m/z大于1.2时,响应强度增长缓慢。因此本方法将隔离窗口设为m/z 1.2。
Q/Exactive属高分辨质谱,其提取的准分子离子色谱图无基线噪声,因此无法采用S/N计算方法定量限(LOQ)。本方法采用阴性猪肉、猪肝、猪肾、鸡肉、鸡肝、鸡肾、牛奶、鸡蛋样品添加不同水平多肽类药物进行检测,测得仪器的最低检出质量浓度,粘杆菌素A、粘杆菌素B、多粘菌素B、杆菌肽A的LOQ为10 μg/kg、维吉尼霉素M的LOQ为0.5 μg/kg。图 4为LOQ水平的基质标准溶液和鸡肉加标样品的选择离子色谱图。
采用阴性样品基质配制不同质量浓度的标准溶液,按本方法所述仪器条件进行检测,结果表明:粘杆菌素A、粘杆菌素B、杆菌肽A、多粘菌素B在5～500 μg/kg范围内、维吉尼霉素M在0.25～100 μg/kg范围内,峰面积Y与质量浓度X(μg/kg)均呈良好的线性关系。粘杆菌素A的线性方程为Y=6 274.5X-2 057.1(R2=0.999 5),粘杆菌素B的线性方程为Y=6 831.6X-5 338.2(R2=0.999 0),多粘菌素B的线性方程为Y=5 429.4X+3 110.5(R2=0.996 7),杆菌肽A的线性方程为Y=9 431.7X-2 380.8(R2=0.993 1),维吉尼霉素M的线性方程为Y=19 089.0X+49 609.9(R2=0.999 3)。
选取阴性猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝、猪肾、鸡肾、牛奶和鸡蛋样品,分别添加3个质量浓度水平,按本方法1.3和1.4节条件进行试验,每个水平平行测定6次。结果如表 2所示,5种多肽类药物的方法回收率为67.4%～108.9%,RSD为4.5%～17.2%。
为了验证方法的实用性,在本实验室收集了2015和2016年度残留监控和日常送检动物源性食品进行测定。根据分析物的保留时间、一级母离子扫描质量数和特征子离子对5种多肽类药物进行确证分析,共检出5个样品含有粘杆菌素(见表 3),但测定结果均未超过我国农业部235公告[2]中规定的限量值(150 μg/kg)。
本文采用液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术,建立了动物源性食品中5种多肽类药物的确证分析方法,样品经简单稀释后直接进行测定。经优化提取、净化、基质效应、稳定性等关键技术参数,最终解决了多肽类药物检测结果重现性差的技术难题。在该优化条件下,5种多肽类药物的母离子和子离子测定结果质量精度小于5×10-6,样品基质在0.5～10 μg/kg添加水平下仍可以获得稳定的检测结果。同时对5种多肽类药物的质谱裂解方式进行了探索,实现了特征子离子的溯源。该方法省时、经济,已成功用于动物源性食品中5种多肽类药物的日常检测。
2017,
Vol. 35 Issue (2): 156-161
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