化学衍生辅助液相色谱-串联质谱测定枇杷膏中的齐墩果酸和熊果酸


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	骆丹

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	姚劲挺

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	黄涛宏

	端裕树

骆丹^1,2 , 冯钰锜¹ , 姚劲挺² , 孙友宝² , 黄涛宏² , 端裕树²

1. 生物医学分析化学教育部重点实验室, 武汉大学化学与分子科学学院, 湖北武汉 430072;
2. 岛津企业管理(中国)有限公司, 上海 200052

收稿日期：2016-08-16

基金项目：国家自然科学基金项目（21475098）

通讯联系人：冯钰锜, Tel:(027)68755595, E-mail:yqfeng@whu.edu.cn

摘要：建立了一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）同时测定齐墩果酸和熊果酸含量的分析方法，利用衍生化试剂N，N-二甲基乙二胺（DMED）和d4-N，N-二甲基乙二胺（d4-DMED）分别衍生样品和标准工作溶液中的目标分析物，并将标准工作液的衍生产物作为稳定同位素内标。该方法线性关系良好，相关系数均>0.99；齐墩果酸和熊果酸的检出限（S/N=3）分别为0.92 ng/L和1.06 ng/L，加标回收率分别为98.7%~102.7%和97.2%~105.0%。该方法简单、快速、准确，可满足枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸高灵敏度检测的需求。

关键词：液相色谱-串联质谱同位素质谱探针标记技术化学衍生齐墩果酸熊果酸

Determination of oleanolic acid and ursolic acid in loquat leaf extract by chemical derivatization coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LUO Dan^1,2, FENG Yuqi¹, YAO Jinting², SUN Youbao², HUANG Taohong², HASHI Yuki²

1. Key Laboratory of Analytical Chemistry for Biology and Medicine (Ministry of Education), College of Chemistry and Molecular Science, Wuhan University, Wuhan 430072, China;
2. Shimadzu (China) Co., Ltd., Shanghai 200052, China

Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (No. 21475098)

Abstract: A method for the determination of oleanolic acid (OA) and ursolic acid (UA) by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed. By using derivatization reagents, N, N-dimethylethylenediamine (DMED) and d4-N, N-dimethylethylenediamine (d4-DMED), OA and UA in real samples and standard samples were derivatized separately. The derivative products of the standard samples were used as stable isotope internal standards, and accurately added to the samples and standard working solutions. Good linearities were obtained in the concentration range of 0.01-10 μ g/L with correlation coefficients (r²) greater than 0.99. The limits of detection of OA and UA were 0.92 ng/L and 1.06 ng/L, and the recoveries were between 98.7%-102.7% and 97.2%-105.0%, respectively. The method can be used for the detection of OA and UA in loquat leaf extract with high sensitivity.

Key words: liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) isotope mass spectrometer probe technology chemical derivatization oleanolic acid (OA) ursolic acid (UA)

齐墩果酸(OA)和熊果酸(UA)是两种典型的五环三萜类化合物, 具有较低的细胞毒性和广泛的生物活性, 可用于杀虫、消炎、防流感、抗糖尿等^[1-4]。熊果酸现已被证明能够阻断艾滋病蛋白酶的聚合, 同时对其他恶性肿瘤细胞亦表现出强烈的抑制作用; 齐墩果酸可减轻肝损伤, 对急性、慢性肝炎及肝硬化动物均有明显的降低谷丙转氨酶和退黄的效果, 是治疗急性黄疸型肝炎和慢性病毒性肝炎的理想药物, 具有毒性低, 不良反应少等优点^[1-4]。

针对齐墩果酸和熊果酸的检测, 文献报道的方法多为薄层扫描法^{[5, 6]}、高效液相色谱法^[7-15]、毛细管胶束电动色谱法^{[16, 17]}和液相色谱-质谱法^{[18, 19]}等。薄层扫描法对薄层条件的要求较苛刻, 一般测得的结果多为齐墩果酸和熊果酸含量的总和; 采用高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)法时, OA和UA的化学结构(见图 1)使其紫外吸收较弱、基线波动大、灵敏度低; 采用质谱分析时, 含有的羧基(-COOH)在负离子模式下离子化效率低; 即使采用高灵敏度的三重四极杆质谱, 也因为OA和UA的化学结构非常稳定, 而在串联质谱中的碎裂行为不理想, 无法使用多反应监测模式(MRM)进行分析。因此, 检测复杂中药中的齐墩果酸和熊果酸时, 需要多步富集、提纯等步骤, 操作繁琐、耗时。

图 1 (a)齐墩果酸和(b)熊果酸的化学结构 Fig. 1 Chemical structures of (a) oleanolic acid (OA) and (b) ursolic acid (UA)

本课题组在前期的研究中设计并合成了衍生化试剂N, N-二甲基乙二胺(DMED)和d4-N, N-二甲基乙二胺(d4-DMED), 并将其用于酸性植物激素的检测中, 结果表明, 该试剂可显著提高羧酸类化合物的质谱检测灵敏度^{[20, 21]}。本文将该衍生化试剂应用于齐墩果酸和熊果酸的检测, 无需获得每种标准品的同位素内标, 而是通过衍生向目标分子中引入稳定同位素作为内标物, 建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸的分析方法。该方法简单、快速, 灵敏度高、可通过失去衍生化的基团得到其稳定的产物离子, 对中药中齐墩果酸与熊果酸的分离、分析具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20A液相色谱仪和LC-MS-8050三重四极杆质谱仪(日本岛津公司), 配有LC-20AD输液泵、DGU-20A3R在线脱气机、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、CBM-20A系统控制器和LabSolutions Ver. 5.60 SP2色谱工作站; DN-12氮吹仪(天津东康科技有限公司); Vortex 5涡旋振荡器(其林贝尔仪器制造有限公司)。

OA和UA标准品(纯度＞98%)购自中国药品生物制品检定所; 乙腈、乙酸乙酯(色谱纯)购自德国Merck公司; 甲酸(色谱纯)购自德国CNW科技公司; 2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)购自阿拉丁公司; N, N-二甲基乙二胺(DMED)购自美国Sigma公司; 三乙胺(TEA)、氯化钠购自上海医药集团有限公司。实验用水均由Milli-Q制备(美国Millipore公司)。

1.2 样品前处理

取0.5 g枇杷膏于50 mL容量瓶中, 用饱和食盐水稀释至刻度, 取1 mL加入200 μ L乙酸乙酯, 涡旋5 min后, 静置, 取上清液进行衍生。加入10 μ L 20 mmol/L TEA和10 μ L 20 mmol/L CMPI, 涡旋5 min, 再加入10 μ L 40 mmol/L DMED, 于40 ℃以1 500 r/min振荡1 h后, 用氮气吹干, 加入100 μ L流动相复溶。

称取适量齐墩果酸和熊果酸标准品, 用乙腈配制质量浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μ g/L的系列混合标准工作液; 分别取200 μ L各质量浓度的混合标准工作液进行衍生。衍生步骤同上。

用d4-DMED (其合成见参考文献[20])代替DMED对10 μ g/L混合标准工作液进行衍生, 衍生步骤同上。取10 μ L复溶后的溶液加至各质量浓度的混合标准工作液和实际样品中, 混匀, 上样。

1.3 仪器分析条件

色谱柱:InertSustain C18色谱柱(250 mm×2.1 mm, 3 μ m); 柱温:35 ℃; 流动相:0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈(47 : 53, v/v); 等度洗脱; 流速:0.25 mL/min。

正离子监测模式; 雾化气流速:2.0 L/min; 加热气流速:10.0 L/min; 接口温度:300 ℃; 脱溶剂管(DL)温度:250 ℃; 加热模块温度:400 ℃; 干燥气流速:10.0 L/min; 扫描模式:多反应监测(MRM)。其它质谱参数见表 1。由于OA和UA为同分异构体, 其母离子和产物离子完全一致, 可通过保留时间差异对二者进行定性。

表 1 OA和UA衍生产物的保留时间(t_R)和其他质谱参数 Table 1 Retention times (t_R) and other MS parameters of OA and UA derivatives

2 结果与讨论

2.1 质谱裂解行为

齐墩果酸和熊果酸与DMED或d4-DMED的衍生反应见图 2。经衍生反应后, 齐墩果酸和熊果酸的羧基与衍生化试剂间形成酰胺键, 同时引入叔胺基团, 提高质谱响应信号。在串联质谱分析中, 通常使用MRM来实现对化合物的准确定量, 以有效排除单四极杆质谱出现的假阳性现象。因此, 以齐墩果酸为分析物, 考察了其衍生前后在串联质谱中的碎裂行为(见图 3)。衍生前, 齐墩果酸几乎无子离子产生(见图 3b); 而衍生后, 齐墩果酸的断裂行为得到明显改善, 可获得质谱响应信号较大的子离子(m/z 482.30)(见图 3d), 有利于MRM检测。齐墩果酸和熊果酸衍生产物的母离子及相应子离子信息见表 1。

图 2 OA和UA与(a) DMED和(b) d4-DMED的衍生化反应 Fig. 2 Derivatization of OA and UA with (a) DMED and (b) d4-DMED TEA: triethylamine.

图 3 OA衍生前(a)全扫描与(b)产物离子扫描和衍生后(c)全扫描与(d)产物离子扫描的质谱图 Fig. 3 Mass spectra of OA for (a) full scan and (b) product ion scan before derivatization and (c) full scan and (d) product ion scan after derivatization

2.2 衍生条件的优化

本实验分别考察了DMED、TEA的用量及反应时间对衍生效率的影响。首先以衍生化试剂DMED的用量为变量，考察DMED与待测物(OA+UA)的物质的量的比(20~10 000)对衍生化产物峰面积的影响。结果表明, 随着DMED用量的增加, 衍生化产物的峰面积逐渐增加；当物质的量的比达到200时, 此时DMED的浓度为40 mmol/L，衍生化产物的峰面积不再增加。在实际样品和标准品的衍生实验中, DMED与待测物的物质的量的比远超过200, 保证了衍生化反应的完全。

衍生化反应中, 由TEA提供碱性环境, 将TEA的体积设为10 μ L, 当其浓度从1 mmol/L增至20 mmol/L时, 衍生化产物的峰面积基本保持不变。将反应温度设为40 ℃, 反应时间从10 min逐渐增至60 min, 衍生化产物的峰面积略有增加, 约上升10%。因此, 本实验最终将DMED与TEA的浓度分别设为40 mmol/L和20 mmol/L, 反应时间设为60 min。

2.3 样品前处理条件的选择

研究表明，当反应体系中水的含量增加时, 衍生化反应的效率降低。因此, 在样品前处理过程中采用饱和食盐水稀释枇杷膏样品, 再用乙酸乙酯将目标物从水相萃取至有机相, 然后进行衍生。由于方法灵敏度较高, 实际实验中只需用到10 mg枇杷膏。

分别在实际样品处理前、后加入标准溶液, 比较二者质谱信号的强度变化。结果表明, 处理前、后信号强度的比值大于0.95。由此可知, 前处理时, 分析物基本没有损失。因此可在进样前将内标衍生物与实际样品的衍生溶液混合, 内标仅需校正质谱受样品中的基质效应带来的误差。

2.4 分离条件的选择

OA和UA的结构区别在于OA的C-20位上的甲基移位到C-19位上, 从而形成了UA, 二者属于同分异构体, 其前体离子与产物离子均一致。因此可否准确分离OA和UA至关重要。本实验对比了采用Shim-pack VP-ODS (150 mm×2.0 mm, 5 μ m)、Shim-pack XR-ODS (75 mm×3.0 mm, 2.2 μ m)和InertSustain C18色谱柱(250 mm×2.1 mm, 3 μ m)时的分离效果, 根据其分离度, 最终确定采用InertSustain C18色谱柱。0.1 μ g/L的OA和UA经DMED衍生后的MRM色谱图见图 4。

图 4 OA和UA经DMED衍生后的MRM色谱图(0.1 μg/L) Fig. 4 MRM chromatogram of OA and UA derivatized with DMED (0.1 μg/L)

2.5 方法学考察

取齐墩果酸和熊果酸混合标准工作液, 按1.2及1.3节中的衍生条件及分析条件进行处理, OA和UA衍生物与其d4-DMED衍生物的峰面积比为纵坐标(Y), 质量浓度比为横坐标(X)制作校准曲线, 相关系数(r²)均＞0.99。齐墩果酸和熊果酸的校准曲线、线性范围、检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)见表 2。

表 2 OA和UA衍生物的校准曲线、相关系数(r²)、检出限和定量限 Table 2 Calibration curves, correlation coefficients (r²), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of OA and UA derivativess

按1.2节所述, 配制质量浓度为0.5 μ g/L的混合标准工作液(n=6), 将其衍生后检测, OA和UA衍生物与其d4-DMED衍生物的面积比的相对标准偏差为4.01%~5.84%。按样品前处理方法测定加标含量为100 μ g/kg的枇杷膏和空白枇杷膏中OA和UA的含量(n=5)。齐墩果酸和熊果酸的加标回收率(扣除空白枇杷膏中OA和UA的含量)分别为98.7%~102.7%和97.2%~105.0%。说明该方法精密度和回收率均符合检测要求。

2.6 实际样品测定

按1.2节方法对某品牌的枇杷膏样品进行处理后测定(n=5)。结果表明, 某品牌枇杷膏样品中齐墩果酸和熊果酸的含量分别为35.8 μ g/kg和115.2 μ g/kg, 其色谱图见图 5。

图 5 枇杷膏样品中(a) OA、UA和(b)同位素内标衍生物的MRM色谱图 Fig. 5 MRM chromatograms of (a) OA, UA and (b) isotope internal standard derivatives in a loquat leaf extract sample

3 结论

本文采用同位素质谱探针标记技术, 建立了化学衍生辅助高效液相色谱-三重四极杆质谱同时测定枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸含量的方法。该方法简单、快速、准确, 可满足枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸高灵敏度检测的需求。

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