蛋白质的甲基化修饰由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)依赖的甲基转移酶催化产生[1, 2],是最常见的蛋白质翻译后修饰之一。甲基化修饰在很多生理过程的调控中发挥着重要的作用[3]。研究表明:蛋白质甲基化可以调节目标蛋白质分子内或分子间的相互作用;影响它们和RNA的亲和作用,从而影响多种细胞进程,如转录调节、细胞定位、核糖体装配、RNA加工、不均一核糖核酸核糖体蛋白(hnRNPs)的成熟、蛋白质-蛋白质相互作用、准确翻译、细胞核运输、蛋白质与核酸的运输和代谢、细胞内信号传导等[4-6]。最近发现的具有赖氨酸去甲基化活性的酶[7, 8]说明蛋白质的赖氨酸甲基化修饰也是一类动态调控的修饰类型,这进一步促使研究人员深入研究甲基化修饰在生理过程中的调控作用。到目前为止,对组蛋白以及参与转录翻译过程的蛋白质上的甲基化已经有了比较深入的研究[5, 9-12],但对其他蛋白质上发生的甲基化修饰参与的调控过程的认识还比较欠缺。目前已知的大多数甲基化事件发生在精氨酸和赖氨酸残基上,属于N-甲基化,并且存在不同的甲基化类型,比如赖氨酸可以发生单甲基化、二甲基化和三甲基化,而精氨酸能发生单甲基化、对称二甲基化和非对称二甲基化[13]。除了N-甲基化,甲基化修饰还可以发生在氧和硫中心原子上[13],但相关的研究还比较少。虽然已有大量的文献报道蛋白质的甲基化修饰,由于甲基化的多样性及复杂性,在蛋白质组学水平上鉴定甲基化位点仍然十分困难,这主要是因为蛋白质中甲基的引入除了增加甲基化氨基酸残基的空间位阻和减少氨基酸残基的氢键作用力外,并没有显著改变氨基酸残基的净电荷或者等电点[14],这使甲基化蛋白质/肽段的高效分离富集比较困难,极大地影响了分析的灵敏度。
甲基化肽段的分离富集是对甲基化蛋白质组(methylome)[15]进行深入研究的关键。蛋白质的甲基化是一种低丰度的翻译后修饰类型,因而在基于质谱的“鸟枪法”[16]蛋白质组学研究中容易受到非甲基化肽段的干扰而难以得到高效的鉴定。目前用于甲基化蛋白质/肽段分离的方法主要包括基于抗体的免疫沉淀法、基于结合结构域的免疫沉淀法和色谱分离法。这些富集处理可以显著提高样品中甲基化肽段的丰度,从而使低丰度的甲基化肽段也可以被鉴定到,因而是深入研究甲基化修饰的一个关键步骤。假阳性率(false discovery rate,FDR)的控制是甲基化修饰研究中另一个需要重视的问题。甲基化引入的相对分子质量差异(+14 Da)与很多氨基酸之间的相对分子质量差异相同[17],因而在基于质谱的分析中,单纯依靠相对分子质量之间的差异很难将甲基化修饰与可能发生的氨基酸替换有效区分开,所以会引入很大的不确定性。为了提高鉴定结果的可信度,重标甲硫氨酸-细胞培养氨基酸稳定同位素标记(heavy methyl stable isotope labelling by amino acids in cell culture,hM-SILAC)技术被用来在甲基化修饰上引入额外的质量差异,从而提升甲基化修饰与氨基酸替换的质量区分度。此外,基于定量蛋白质组学的研究策略也在甲基化修饰的研究中得到了广泛的应用。通过与细胞培养氨基酸稳定同位素标记(stable isotope labelling by amino acids in cell culture,SILAC)技术相结合,可以对不同生理状况下甲基化修饰的丰度进行定量分析,从而更加深入地研究甲基化修饰参与的生理过程。到目前为止,基于质谱的“鸟枪法”分析策略在甲基化修饰的高通量研究中发挥了关键的作用,也取得了一系列的重要进展。在本综述中,我们将从甲基化修饰蛋白质/肽段的分离富集、假阳性率的控制、定量分析等方面来介绍甲基化蛋白质组的研究新进展。
蛋白质甲基化修饰的丰度很低,在进行液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)分析时,甲基化肽段的鉴定经常会受到高丰度非甲基化肽段的干扰。因此,对甲基化修饰进行深入研究的关键步骤就是对样品进行预处理,提高甲基化肽段的丰度。基于抗体的免疫沉淀方法是蛋白质组学研究中很常见的一种分离翻译后修饰肽段的方法,这一方法已经在蛋白质的乙酰化修饰[18, 19]、泛素化修饰[20, 21]等翻译后修饰的研究中得到了广泛的应用。但由于甲基化引入的修饰基团比较小,对修饰后的氨基酸残基的理化性质改变也比较小,所以在利用抗体进行分离富集的时候,富集特异性比较差,尤其是对于赖氨酸甲基化[22, 23],其检测灵敏度及特异性完全依赖于制备抗体的质量。2014年,CST(Cell Signaling Technology)公司开发了一类针对甲基化模体(motif)的广谱抗体[24],这类抗体对甲基化修饰肽段具有比较高的结合能力和特异性,在单次实验中从人源细胞系和老鼠组织样品中鉴定到超过1000个精氨酸甲基化修饰位点和160个以上的赖氨酸甲基化修饰位点。这些抗体在后续的研究中得到了广泛的应用,被用于甲基化位点的规模化鉴定以及甲基化修饰的定量研究[25, 26],极大地促进了甲基化修饰的深入研究。Garcia课题组[27]开发了一类赖氨酸甲基化抗体,从HeLa细胞中鉴定到493个甲基化肽段,对应413个蛋白质上的552个赖氨酸甲基化位点,取得了比较好的分离效果。并在后续的研究中从食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞中鉴定到多达1800个赖氨酸单甲基化修饰位点[28],是到目前为止单次实验鉴定到的最大的赖氨酸甲基化位点数据集。与二甲基化和三甲基化相比,赖氨酸单甲基化修饰对赖氨酸残基的理化性质改变比较小,这一特点使得化学富集和特异性抗体的制备都比较困难。赵英明课题组[29]巧妙地通过化学衍生法在单甲基化的赖氨酸残基上添加一个丙酰基团,而二甲基化赖氨酸和三甲基化赖氨酸不能与丙酸酐(propionic anhydride)反应,因此该方法可以特异性地对单甲基化赖氨酸进行衍生化反应,而且该反应在细胞裂解液中的效率高达98%以上;衍生得到的丙酰-单甲基化基团化学结构复杂度提高,可以制备特异性较高的抗体,用来对单甲基化修饰的赖氨酸肽段进行亲和富集;最后通过高通量的质谱分析以达到赖氨酸单甲基化修饰的规模化鉴定。作者对多种人源细胞(HeLa、K562、SW620、A549和SMM7721细胞)进行了分析,共鉴定出446个修饰位点,对应398个蛋白质,大多数修饰位点都属首次发现；作者还将该方法用于人肝癌组织样品分析,鉴定出59个修饰位点,对应49个蛋白质。
近年来,基于甲基化赖氨酸结合结构域的亲和方法也被引入甲基化蛋白质组的研究中,主要用于赖氨酸甲基化蛋白质的分离。Gozani研究组[22, 23]利用含甲基化赖氨酸结合结构域的蛋白质为富集工具,对赖氨酸甲基化的蛋白质进行了分离。L3MBTL1蛋白质的三重恶性脑瘤域(the triple malignant brain tumor domains,3×MBT)含有一个能识别甲基化赖氨酸的结合口袋,其特异性不受周围氨基酸残基的影响。作者制备了一种固载了3×MBT结合结构域的功能化树脂,对HEK293T细胞中单甲基化和二甲基化赖氨酸的蛋白质进行分离并用质谱分析,成功鉴定了上百个甲基化事件。与此同时,Shawn研究组[30]利用HP1β上的染色质域对赖氨酸甲基化修饰的蛋白质进行分离,鉴定到一个高质量的HP1β相互作用蛋白质组数据集。基于结合结构域的甲基化蛋白质组的研究不仅扩展了已知的赖氨酸甲基化位点数据集,还加深了对甲基化引导的相互作用网络的理解[30]。但这类结合结构域对甲基化肽段的作用力比较弱,所以不能有效地应用于甲基化肽段的富集,因而即使对甲基化蛋白质进行分离,酶解后样品的复杂度还是很高,难以实现甲基化位点的高效鉴定[23]。
另外,基于亲水色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)[31]、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)以及强阳离子交换色谱(strong cation exchange chromatography,SCX)[31]的色谱分离方法也在甲基化修饰的高通量分析中得到了成功的应用。精氨酸的甲基化修饰容易发生在蛋白质的亲水区域内,因而经酶解得到的精氨酸甲基化肽段的亲水性一般会比较强,可以通过亲水色谱法对甲基化肽段进行一定程度的富集[31]。在对hM-SILAC标记的HeLa细胞的研究中,Acuto研究组[31]利用HILIC分离成功鉴定到131个蛋白质上的249个精氨酸甲基化位点,其中有190个位点是之前没有报道过的新位点。另外,发生甲基化修饰后的赖氨酸残基和精氨酸残基的碳端(C端)不容易被胰蛋白酶识别而导致漏切。因为甲基化修饰不会改变赖氨酸残基和精氨酸残基的带电性质,这些漏切肽段会比普通的酶切肽段多带一些正电荷,因而可以利用SCX对这些甲基化肽段进行分离。该研究组[31]利用低pH范围的离线SCX分离策略,成功地鉴定到39个精氨酸甲基化位点,其中25个位点是之前没有报道过的新位点。但是低pH范围的SCX分离条件下,非甲基化的漏切肽段和含有组氨酸的肽段也会多带一些正电荷,因而会对甲基化肽段的高效分离造成干扰。该研究组[31]报道,在甲基化肽段比较集中的SCX馏分中,含有组氨酸的肽段占全部肽段的60%～70%,极大地影响了分离的特异性。因为漏切位置多出的赖氨酸或者精氨酸,这些带有漏切位点的甲基化肽段的等电点比普通酶切肽段的等电点高,因而可以利用等电聚焦对甲基化肽段进行分离。该研究组[31]通过分析包含已知精氨酸甲基化位点的肽段,发现90%以上的精氨酸甲基化肽段的等电点都大于9,因而可以利用这一性质对精氨酸甲基化肽段进行分离。在接下来的实验中,作者利用等电聚焦分离和质谱分析,成功地鉴定到66个精氨酸甲基化位点,其中34个是新位点。但是由于缺乏pH范围合适的梯度胶条(IPG strip),一些碱性太强的甲基化肽段不能得到很好的回收,因而影响了最终鉴定的甲基化位点数目。
另外一种方法是添加带有反应基团的甲基供体对甲基化蛋白质进行标记[32, 33],对带有反应基团的蛋白质进行基于“生物正交化学”[34]的分离,然后通过质谱分析对这些甲基化蛋白质进行鉴定。Luo课题组[32, 33]将SAM类似物的标记策略应用于全细胞体系蛋白质甲基化位点的修饰,结合生物素-亲和素富集技术及质谱检测技术发展了一种基于SAM类似物的生物正交蛋白质底物谱技术。由于这些SAM类似物的结构与天然的SAM存在比较大的差异,因而通过基因工程手段获得的能够特异性识别对应SAM类似物的甲基转移酶研究策略仅能获得某一个甲基转移酶的底物蛋白质谱,不能真正成为甲基化蛋白质组学研究的工具。为了寻找一种能被天然的蛋白质甲基转移酶广泛利用的SAM类似物,并应用于甲基化蛋白质组学的研究,赵宗保课题组和邹汉法课题组[35]针对一株SAM营养缺陷型酵母发展了一种基于allyl-SAM代谢标记的甲基化蛋白质组学研究策略。酿酒酵母被敲除掉基因SAM1和SAM2后自身不能合成SAM。在培养酵母的时候,添加能被甲基转移酶广谱利用的SAM类似物allyl-SAM,它可以在SAM转运蛋白的作用下进入胞内并对潜在的甲基化底物蛋白质进行烯丙基化修饰。通过合成含生物素官能团的探针分子,借助“生物正交化学”反应对烯丙基修饰的蛋白质进行捕获并利用生物素与亲和素树脂之间的相互作用对目标蛋白质进行分离。通过质谱分析检测及数据库搜索鉴定,成功实现了酿酒酵母甲基化蛋白质组的规模化分析,为酿酒酵母甲基化功能的深入研究奠定了基础。对鉴定结果进行详细的分析,共筛选出167个目标甲基化蛋白质,其中24%的蛋白质之前曾被证实为甲基化蛋白质,另外76%的甲基化事件则为首次发现。对得到的甲基化蛋白质组学数据进行生物信息学分析,结果表明细胞质和核糖体是酿酒酵母甲基化蛋白质丰度比较高的区域,而甲基化蛋白质的生物学功能较多涉及mRNA结合、核糖体装配、生物大分子复合、连接酶活性以及参与细胞质翻译和氨基酸代谢等,这表明甲基化修饰可能在这些生理过程中发挥着重要的调控作用。基于“生物正交化学”的方法,其最主要的缺点是只能鉴定到甲基化蛋白质而不能鉴定到具体的甲基化位点,限制了这类方法在甲基化蛋白质组学研究中的广泛应用。
目前,这些分离富集方法在应用于甲基化蛋白质/肽段分析时都存在特异性差的缺点,严重阻碍了蛋白质甲基化修饰的高通量分析。因而,该领域的研究重点在于开发选择性更高的甲基化肽段分离方法,为规模化分析甲基化修饰组及阐释甲基化参与调控的生理过程提供重要的技术支撑。
假阳性率的控制是蛋白质甲基化研究中另外一个需要关注的问题。甲基化修饰引入的相对分子质量差异(+14 Da)与很多氨基酸之间的相对分子质量差异相同。因而在基于质谱的分析中很难有效区分甲基化修饰与可能发生的氨基酸替换[17]。hM-SILAC策略通常被用来提高鉴定结果的可信度。2004年,Ong等[17]发展了一种基于抗体富集和细胞培养氨基酸稳定同位素标记相结合的鉴定和定量甲基化位点的方法。这一方法的大致流程如图 1所示:轻标样品中加入正常的甲硫氨酸,重标样品中加入同位素标记的甲硫氨酸;在细胞培养时,添加的甲硫氨酸可以在SAM合成酶的作用下转化为甲基供体-SAM,从而在轻标样品和重标样品中引入不同的同位素标签。将轻标样品和重标样品按照1:1混合,在基于质谱的鉴定过程中,不同标记的同一条甲基化肽段将成对出现,它们除了相对分子质量上的差异外,物理化学性质基本一致。这一策略首先通过数据库搜索鉴定肽段序列和修饰位点,然后比较其一级谱的XIC(extracted ion current)图,借助甲基化位点的定量信息进一步确定甲基化位点。通过这一策略对鉴定的甲基化肽段进行后续确认，可以显著提高位点鉴定的可信度。另外,在该策略中,同一条肽段相当于通过两张独立的质谱碎裂谱图得到鉴定,进一步增加了鉴定的可靠性。通过结合抗体富集和hM-SILAC策略,作者在宫颈癌细胞(HeLa)中共鉴定到33个甲基化蛋白质上的59个甲基化位点。但由于甲基化抗体的富集特异性不是很高,所以鉴定的甲基化位点数目受到了限制。hM-SILAC策略可以显著提高甲基化鉴定的可信度,但是这一方法也存在不足。首先,[13CD3]-甲硫氨酸不仅可以标记发生甲基化的氨基酸残基,它自身也会参与蛋白质的合成,这就增加了后续数据库检索和分析的复杂性,也会对鉴定结果的可信度造成影响。其次,SAM-依赖的蛋白质甲基化伴随着副产物S-腺苷高半胱氨酸的产生。半胱氨酸合酶是细胞自身存在的一种重要的酶,能以甲基四氢叶酸酯作为甲基供体在高半胱氨酸上加一个甲基使其生成甲硫氨酸[36]。因此,虽然在细胞培养基中有标记的甲硫氨酸,但无标记的甲硫氨酸也可以由细胞自身合成,从而产生无标记的SAM。细胞的这一生理过程使重标样品标记不完全,从而使分析复杂化,而且会增加分析结果的假阴性。
为了克服传统的hM-SILAC标记方法的缺陷,邹汉法课题组与赵宗保课题组[37]合作发展了一种借助SAM营养缺陷型酿酒酵母菌株研究甲基化蛋白质组的方法(见图 2)。酿酒酵母在敲除基因SAM1和SAM2后自身不能合成SAM。通过在细胞培养基中添加同位素标记的SAM直接标记甲基化位点。然后利用在线多维液相色谱-串联质谱联用技术对酿酒酵母中的甲基化蛋白质和位点进行全面的鉴定分析。在SAM缺陷型细胞中,甲硫氨酸不能转变为SAM,因而添加的SAM是唯一的甲基供体,成对的峰(色谱峰面积1:1)只会出现在含甲基化修饰的肽段上,可以极大地提高鉴定的可信度。在该文章中,作者还提出了一种MILS(methylation by isotope labeled SAM)假阳性控制策略,极大地提高了鉴定的可信度。传统的数据筛选策略考虑所有鉴定的肽段或者是有修饰的肽段,通过调节打分值来控制鉴定结果的假阳性率。但在甲基化修饰的研究中,由于多个可变修饰的引入,检索空间急剧增大,假阳性率也会随之提高,这就需要很高的打分值才能确保最终结果的可信度,而这会损失掉大量的甲基化位点信息。 2 MILS策略的分析流程 Overview of workflow for the MILS strategy MILS: methylation by isotope labeled SAM; SAM: S-adenosyl methionine. 但在MILS策略中,同一条甲基化肽段可以通过成对出现的、由轻标和重标引入的两个独立的质谱数据进行鉴定,二级谱连续的b/y离子进一步提高了鉴定的可信度。通过对酿酒酵母细胞的甲基化蛋白质组进行全面分析,共鉴定了43个甲基化蛋白质,包括分布在64个甲基化中心的68个甲基化事件。这一结果表明酿酒酵母中超过2.6%的蛋白质可以发生甲基化修饰,这是迄今为止来自酿酒酵母的最全面的甲基化位点鉴定结果,发生在不同氨基酸残基上的甲基化事件按数量排序如下:赖氨酸精氨酸＞天冬氨酸＞天冬酰胺≈谷酰胺≈组氨酸＞谷氨酸＞半胱氨酸。此外,在重标SAM标记的样品中基本上没有鉴定到重标甲硫氨酸,说明这一方法有效地克服了传统hM-SILAC方法的缺陷,加入的重标SAM并没有转化为重标甲硫氨酸,极大地提高了鉴定结果的可信度。但由于该方法未经过抗体富集,对低丰度甲基化修饰肽段可能存在漏检,一些已知的甲基化事件并未鉴定到。Acuto研究组[25]提出了一种标记策略iMethyl-SILAC(isomethionine methyl-SILAC)来避免含有甲硫氨酸肽段的干扰。在该策略中,作者利用两种同位素标记的甲硫氨酸(见图 3)对样品中的甲基化位点进行标记。T淋巴细胞分别在含有不同同位素标记的甲硫氨酸的培养基中培养,在收取细胞的时候按照细胞数目1:1混合,然后进行液相色谱-串联质谱分析。通过iMethyl-SILAC标记策略,酶解得到序列相同的甲基化肽段会带有4 Da的相对分子质量差异,并成对(1:1)出现,而序列相同的含有甲硫氨酸的肽段相对分子质量基本相同,不会对甲基化肽段的假阳性率控制造成干扰。作者通过iMethyl-SILAC标记策略获得了比传统hM-SILAC策略更好的假阳性控制结果。通过结合抗体富集和SCX分级,作者从人源T细胞(human T cells)中共鉴定到1257个蛋白质上的2502个精氨酸甲基化位点,这是到目前为止单次实验鉴定的最大精氨酸甲基化位点数据集。
虽然通过hM-SILAC策略可以极大地提高甲基化位点鉴定的可信度,但这类方法也存在一定的局限性。由于同位素标签是在细胞培养过程中引入的,因而难以用于组织样品中甲基化位点的标记。为了实现组织样品中甲基化修饰位点的高可信度鉴定,需要开发新的控制假阳性率的方法。
蛋白质甲基化一直被认为是一种很稳定的翻译后修饰,直到2006年发现赖氨酸去甲基化酶[38],越来越多的证据表明蛋白质的甲基化修饰是一类动态调控的修饰类型[3]。研究不同生理状态下甲基化水平的变化对于阐释甲基化参与的调控过程十分重要,因而蛋白质甲基化的研究越来越侧重于定量水平的分析。Shawn研究组[30]利用HP1β富集以及SILAC标记对DNA损伤修复过程中赖氨酸甲基化的动态变化情况进行了研究,利用LC-MRM-MS策略[39]对14个蛋白质上的19个赖氨酸甲基化位点在DNA损伤修复过程中的含量进行了定量分析。在依托泊甙(etoposide)的刺激之下,DNA-PKcs(catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase)第3248位赖氨酸上的二甲基化含量上调了一百多倍,而蛋白质Ku80第7位赖氨酸的三甲基化含量则下调了一百多倍。这一结果表明,赖氨酸的甲基化修饰是高度动态变化的。Nielsen研究组[26]利用放线菌素-D(actinomycin D)抑制RNA聚合酶的转录活性,结合SILAC技术对转录过程中精氨酸甲基化的动态变化情况进行了分析。他们的结果表明,在抑制转录的几个小时之内,有部分精氨酸修饰位点的单甲基化水平出现了明显的下调,而这些位点的二甲基化水平和对应蛋白质的表达水平并没有发生明显的改变,这一结果表明精氨酸的单甲基化修饰可能存在着单独的调控途径。Nguyen研究组[28]利用赖氨酸单甲基化抗体和SILAC标记定量技术对正常的ESCC细胞和过表达SMYD2的ESCC细胞的赖氨酸单甲基化修饰水平进行分析,利用LLY-507(5-cyano-2′-[4-［2-(3-methyl-1H-indol-1-yl)ethyl]-1-piperazinyl］-N-[3-(1-pyrrolidinyl)propyl]-[1,1′-biphenyl]-3-carboxamide)对SMYD2进行抑制或者利用shRNA(short hairpin RNA)对SMYD2进行基因沉默,发现了35个具有下调趋势的赖氨酸单甲基化修饰位点。为了研究T细胞的激活是否会对精氨酸的甲基化水平造成影响,Acuto课题组[25]利用抗体富集与SILAC标记定量技术对激活前后的精氨酸甲基化修饰水平进行了研究,共获得365个甲基化肽段的定量信息,对应202个蛋白质上319个甲基化位点。另外,该研究组也对这些蛋白质表达水平的变化进行了分析,并利用对应蛋白质的定量信息对甲基化肽段的含量变化进行了校正,从而得到甲基化占有率方面的信息。他们的结果表明:27/282 (9.6%)的精氨酸甲基化位点的位点占有率确实因为T细胞的激活而发生了显著性的变化。
目前,甲基化修饰的定量研究还处于比较初级的阶段,主要集中在不同生理状态下甲基化水平的差异分析上。甲基化修饰的绝对占有率对于深入研究甲基化的调控功能至关重要,这也是甲基化修饰定量研究的下一步努力方向。
到目前为止,甲基化修饰的蛋白质组学研究还是一个较新的领域。鉴于甲基化修饰在很多生理过程的调控中都发挥着关键作用,而对甲基化修饰进行高通量分析对于深入了解甲基化修饰的调控机理至关重要,所以甲基化修饰的研究方法还需要进一步的发展。今后的研究重点包括开发选择性更高的甲基化肽段分离方法、组织样品中甲基化修饰位点的高可信度鉴定、甲基化修饰位点绝对占有率的分析,这些研究方向的突破也将为甲基化修饰组的规模化分析及阐释甲基化参与调控的生理过程提供重要的技术支撑。
2016,
Vol. 34 Issue (12): 1161-1167
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