色谱  2017, Vol. 35 Issue (1): 59-64   PDF    
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张明瑜
康经武
邻苯二甲酸为背景吸收电解质的毛细管电泳法测定低分子量肝素中的阴离子
张明瑜 , 康经武     
生命有机化学国家重点实验室, 中国科学院上海有机化学研究所, 上海 200032
收稿日期：2016-08-29
基金项目：国家自然科学基金项目（21375140，21175146）
通讯联系人： 康经武, Tel:(021)54925385, E-mail:jingwu.kang@sioc.ac.cn
摘要：在生产和贮存低分子量肝素的过程中，糖链上的硫酸酯基团会被水解而损失活性，因此肝素样品中常可以检测到游离的硫酸根离子，此外在生产过程中还会引入其他阴离子。为了检测低分子量肝素的质量稳定性，常用离子色谱检测低分子量肝素中游离的阴离子。但是相对分子质量较大的低分子量肝素会污染离子色谱柱和抑制器。为此发展了一种灵敏的毛细管电泳方法用于测定低分子量肝素中游离的SO42-、Cl-、F-、PO43-和OAc-。不同于常用的背景吸收离子铬酸根，采用邻苯二甲酸根作为背景吸收电解质。与铬酸根相比，邻苯二甲酸根与所有待测阴离子电泳淌度匹配得更好，因此可以获得较窄的峰形。而且邻苯二甲酸根在230 nm检测波长下的摩尔吸光系数（4754 L/（mol·cm））比铬酸根（254 nm，2400 L/（mol·cm））高。因此，可以将毛细管电泳检测阴离子的灵敏度提高到与离子色谱法相当的水平。通过验证，该方法在0.002~1 mmol/L的浓度范围内具有较好的线性关系，日内（n=6）和日间（n=3）迁移时间和峰面积的相对标准偏差均小于3%。所测阴离子的检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.4~0.8 μmol/L和2~4 μmol/L。该方法可用于监测低分子量肝素的稳定性。
关键词： 毛细管电泳     阴离子分析     低分子量肝素     稳定性监测    
Determination of anions in low molecular weight heparin by capillary electrophoresis with phthalate as the background electrolyte
ZHANG Mingyu, KANG Jingwu     
State Key Laboratory of Bioorganic Chemistry, Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China
Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21375140, 21175146)
Abstract: The sulfate ester groups of low molecular weight heparins (LMWHs) are labile and easily hydrolyzed to produce free sulfate ions during the process of manufacture and storage. In addition, other anions such as chloride and acetylate are often introduced in the products. For monitoring the stability of the products, ion chromatography is the commonly used technique for determining the free anions in LMWHs. However, the column and the suppressor of ion chromatography are easily contaminated by LMWHs due to their relatively large molecules. Therefore, we developed a capillary electrophoresis (CE) method with indirect ultraviolet (UV) detection for determining the free anions in LMWHs, including sulfate, chloride, fluoride, phosphate and acetate. Unlike the commonly used anion separation CE method which uses chromate as the background absorption electrolyte, phthalate was used as the probe anion because its electrophoretic mobility matches better to all of the anions than chromate so that more narrow peaks could be obtained. Moreover, the molar absorptivity of phthalate at 230 nm (4754 L/(mol·cm)) was higher than that of chromate at 254 nm (2400 L/(mol·cm)). The combination of the narrow peak shape with the high molar absorptivity of the probe ion improves the detection sensitivity nearly to the lever of ion chromatography. Effects of various CE parameters on the separation of the anions were investigated and optimized. The method displayed excellent linearity in the concentration range from 0.002 to 1 mmol/L. The relative standard deviations (RSDs) for intraday (n=6) and interday (n=3) repeatabilities in terms of migration times and peak areas were all less than 3%. The limits of detection (S/N=3) and limits of quantitation (S/N=10) were determined as 0.4-0.8 μmol/L and 2-4 μmol/L for the above anions, respectively. The method was successfully applied for the stability monitoring of LMWHs.
Key words: capillary electrophoresis (CE)     anions analysis     low molecular weight heparin (LMWHs)     stability monitoring    

肝素是最早应用于临床的生物大分子药物之一, 目前仍然被广泛用于抗凝血、治疗血栓栓塞性疾病以及心血管手术、心脏导管检查、体外循环和血液透析等过程中仪器表面的抗凝处理。低分子量肝素(low molecular weight heparins, LMWHs)是由普通肝素(unfractioned heparin, UFH)通过物理化学或酶解的方法分级或解聚而得[1]。与UFH相比, LMWHs抗凝血作用更易预测, 生物利用度更高, 半衰期更长, 清除率为非浓度依赖性[2], 在临床应用中更加方便且治疗成本更低, LMWHs也因此成为制药界和学术界的研究热点。UFH和LMWHs主要通过糖链中一种特殊的五糖序列, 即AGA*IA (A为GlcNAc6SO3或GlcNSO36SO3, G为GlcA, A*为GlcNSO33SO36SO3, I为IdoA2SO3; 其中GlcN表示氨基葡萄糖, GlcA表示葡糖醛酸, IdoA表示艾杜糖醛酸, Ac表示乙酰化, SO3表示硫酸化, 数字表示呋喃环上的取代位置)与抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ, ATⅢ)专一性结合而发挥抗凝血作用。同时, 糖链与ATⅢ通过非专一性的静电结合形成复合物对于肝素的抗凝血活性也具有非常重要的作用[3]。LMWHs糖链上硫酸化程度的改变会影响这两方面的作用, 进而影响其生物活性[3, 4]。然而, UFH和LMWHs糖链上的硫酸基团并不稳定, 在生产及储存过程中易解离成游离的硫酸根[5, 6]。因此, 美国药典要求必须测定LMWHs中游离硫酸根的含量[6]。同时, 在肝素类药物的生产过程中也会引入氯离子和乙酸根离子等, 对于这些离子的检测也很有必要。

离子色谱(ion chromatography, IC)广泛应用于无机和有机离子的分析[7]。自2012年开始, 美国药典规定采用IC测定LMWHs之一的依诺肝素钠中硫酸根的含量[8]。最近, Liu等[6]进一步发展了IC方法, 研究了不同储存条件下UFH和LMWHs中多种无机阴离子的变化, 可用于监测肝素类药物的稳定性。然而, IC柱成本较高且离子色谱抑制器极易被肝素这样具有大相对分子质量的样品污染。因此, 发展操作简便、成本低廉的肝素类药物中游离硫酸根离子含量测定方法非常必要。毛细管电泳(CE)因为具有分离效率高、速度快、所需样品少、样品前处理简单、抗污染能力强等特点, 已经成为与液相色谱互补的一种液相分离技术, 尤其适用于分析含有复杂基质的样品[9]。与IC相比, CE操作更加简便, 分析时间更短, 成本更低, 是一种非常有效的有机或无机阴阳离子测定方法[10-12]。遗憾的是, CE仍然存在不足, CE-间接紫外检测法的检出限(LOD)通常只能达到10-4~10-5 mol/L。为了改善CE的检测灵敏度, Wojtusik等[13]、Doble等[14]及Quirino等[15]都对CE-间接紫外检测法中检测灵敏度的影响因素进行了详尽的研究, 并提出了多种提高灵敏度的方法。

本文的目的是发展一种更简便的CE方法以提高低分子量肝素中阴离子的检测灵敏度。选择邻苯二甲酸作为间接紫外吸收法的背景吸收电解质。与常用的铬酸根相比, 邻苯二甲酸具有较高的摩尔吸光系数, 电泳淌度与待研究的阴离子更加匹配, 可以获得较窄的峰形, 检测灵敏度更高。本文利用这一方法测定了依诺肝素钠中多个阴离子的含量, 并用于研究依诺肝素钠的稳定性与游离硫酸根含量的相关性。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂和材料

P/ACE MDQ CE系统配UV检测器(美国Beckman Coulter公司)。熔融石英毛细管柱(75 μmi.d., 363 μm o.d., 邯郸鑫诺公司)。无水硫酸钠、氯化钠、氢氧化钠、氟化铵、十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB)、邻苯二甲酸、钼酸和二乙醇胺均为分析纯, 购自上海阿拉丁公司。三水磷酸铵、乙酸钠、水杨酸、重铬酸钠均为分析纯, 购自上海国药集团。依诺肝素钠样品由杭州九源基因工程有限公司赠送。其他试剂均为国产分析纯。实验用水为18 MΩ\5cm超纯水(Millipore UV超纯水系统, 美国Millipore公司)。

1.2 缓冲溶液和样品的配制

CE的背景吸收电解质溶液为10 mmol/L邻苯二甲酸和二乙醇胺组成的缓冲溶液(含0.08 mmol/L CTAB, 用二乙醇胺调节pH为9.2)。所有缓冲溶液使用前用0.45 μ m滤膜过滤。分别配制0.1 mol/L的邻苯二甲酸(用二乙醇胺调节pH至8.0左右)、50 mmol/L的CTAB及50%(v/v)二乙醇胺储备液。优化CE分离条件时, 由储备液稀释配制不同浓度或不同pH的背景吸收电解质溶液。分别配制1 mol/L氯化钠、硫酸钠、氟化铵、乙酸钠和0.5 mol/L磷酸铵作为标准样品的储备液。配制好的溶液置于4 ℃冰箱存放。

1.3 CE条件

所有的CE实验均在配有UV检测器的P/ACE MDQ CE系统上进行。数据的采集和处理均采用Beckman公司CE工作站系统。

进样条件为3 447.5 Pa×15 s。熔融石英毛细管柱总柱长为40 cm (有效长度为29.5 cm); 柱温为25 ℃。新毛细管柱用0.1 mol/L NaOH溶液活化30 min (207 kPa), 再用超纯水和背景吸收电解质溶液分别冲洗2 min (207 kPa)。每一次分析前用0.1 mol/L NaOH、超纯水和背景吸收电解质溶液分别冲洗2 min (207 kPa)。分离电压为-18 kV。采用间接紫外检测, 检测波长为230 nm。

1.4 依诺肝素钠稳定性实验

取一定量粉末状依诺肝素钠, 分别放置于30、60及80 ℃, 于0、5、12、24和48 h时取样, 用超纯水溶解至质量浓度为1.0 g/L后直接用CE分析。

2 结果与讨论
2.1 方法的建立和优化

根据间接紫外吸收的原理[13, 16], 影响被分析物检测灵敏度(Clod)的因素如公式(1)所示：

(1)

其中, Cp是背景吸收电解质的浓度; DR是背景吸收与噪声的比例; TR是置换系数, 即一个被分析离子替代背景吸收电解质离子的个数; NBL是基线噪声, ε和l分别为背景吸收电解质的摩尔吸光系数和光程。因此, 寻找具有高摩尔吸光系数、高TR值的背景电解质离子以降低背景吸收可以获得高的检测灵敏度。背景吸收电解质离子的选择需满足以下条件:电泳淌度与阴离子匹配、在毛细管壁没有吸附、毒性小、价格低廉以及容易获得等[16, 17]。从图 1可知, 钼酸根和邻苯二甲酸根的电泳淌度与所有待测定阴离子电泳淌度更为匹配, 能够使大部分待测离子的峰形得到改善, 增加检测灵敏度[18], 因此, 这两种离子适合作为背景吸收电解质。

图 1 各种背景离子和被分析阴离子电泳淌度的对比 Fig. 1 Comparison of the electrophoretic mobilities of probe ions and analyte anions

经过测定, 邻苯二甲酸根在230 nm的表观摩尔吸光系数(4 754 L/(mol\5cm))高于钼酸根(4 157 L/(mol\5cm)), 而且邻苯二甲酸根为背景吸收电解质的TR值比钼酸根高, 即同样的一个阴离子可以替代邻苯二甲酸根离子的个数多于钼酸根。根据公式(1), 以邻苯二甲酸根作为背景吸收电解质可以获得较高的检测灵敏度。综合考虑, 邻苯二甲酸是用于毛细管电泳分析肝素类药物中阴离子较理想的背景吸收电解质。

为了达到最佳的分离分析效果, 研究了背景吸收电解质溶液的pH、邻苯二甲酸浓度、电渗流改性剂CTAB的浓度及分离电压对检测和分离的影响。如图 2所示, 邻苯二甲酸浓度较低时, Cl-和SO42-、F-和PO43-分离度较小; 浓度大于10 mmol/L后, 继续增加浓度对于分离无明显改善, 却增大了基线噪声[19], 因此最终选择邻苯二甲酸的浓度为10 mmol/L。在一定范围内变化时, pH对于分离无明显影响, 因此选择二乙醇胺的pKa即9.2为最终的pH, 以使缓冲溶液的缓冲能力最大。

图 2 邻苯二甲酸浓度对分离的影响 Fig. 2 Effects of the concentrations of phthalate on the separation Conditions: a fused-silica capillary of 75 μ m i.d. (363 μ m o.d.)×40 cm (effective length 29.5 cm from the inlet to the detection window); the CE background electrolyte was consisted of 0.08 mmol/L CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide, pH 9.2); the applied voltage was -15 kV; the capillary was thermostated at 25 ℃; all analytes were detected at 230 nm with indirect UV detection; the samples were injected by pressure of 3 447.5 Pa for 5 s. The concentrations of the anions were all 0.1 mmol/L.
Peaks: 1. Cl-; 2. SO42-; 3. F-; 4. PO43-; 5. HCO3-; 6. OAc-.

用毛细管电泳分析阴离子时, 需加入阳离子表面活性剂CTAB作为电渗流改性剂反转电渗流, 从而使电渗流与阴离子发生共迁移缩短分析时间[14]。考察了CTAB浓度在0.02~0.20 mmol/L范围内变化时, 阴离子迁移时间的变化。如图 3所示, 当CTAB浓度增加到0.08 mmol/L时, 继续增加CTAB的浓度, 迁移时间无明显减小, 因此选择CTAB的浓度为0.08 mmol/L。还考察了分离电压对迁移时间的影响。当毛细管长度一定时, 分离电压决定电场强度, 而电场强度影响电渗流速度和荷电物质迁移率, 继而决定了分析物的迁移时间。分离电压越高, 组分迁移时间越短, 但过高的电压会引起焦耳热增加, 基线噪声增大, 导致灵敏度降低。在考察了分离电压为-12~-24 kV后, 选用-18 kV为分离电压以取得最优的分离度和分析时间。

图 3 CTAB浓度对分离的影响(n=3) Fig. 3 Effects of the concentrations of CTAB on the separation (n=3) The concentration of phthalate was 10 mmol/L, and the other conditions were the same as those in Fig. 2 except for the concentrations of CTAB.

最后, 为了进一步提高检测灵敏度, 对进样量进行了优化。在固定进样压力为3 447.5 Pa的情况下, 改变进样时间。随着进样时间的增加, 样品峰面积逐渐增加, 当进样时间为18 s时, 磷酸根与溶解在水中的二氧化碳形成的碳酸根分离度降低。因此进样条件选择3 447.5 Pa×15 s较为合适。

通过方法优化, 最终采用的实验条件为:采用熔融石英毛细管柱(75 μ m i.d., 363 μ m o.d.), 总柱长为40 cm (有效长度为29.5 cm), 柱温为25 ℃, 背景吸收电解质溶液为含0.08 mmol/L CTAB的10 mmol/L邻苯二甲酸(二乙醇胺调节pH至9.2), 间接紫外吸收检测, 检测波长为230 nm, 进样条件为3 447.5 Pa×15 s, 分离电压为-18 kV。

2.2 方法验证

依诺肝素钠酸性较强, 在溶液中带有较多的负电荷, 容易和涂覆CTAB动态涂层的毛细管壁作用, 导致各个离子迁移变慢, 因此首先通过加入标准品确定了样品中各个阴离子的迁移峰(见图 4)。

图 4 实际样品中各阴离子迁移峰的确认 Fig. 4 Identification of the anions in the real sample All the separations were performed under the optimized conditions.

在优化的条件下, 首先考察了该方法的重复性。如表 1所示, 所有离子的迁移时间在日内和日间的相对标准偏差(RSD)均小于1.0%, 而峰面积在日内和日间的RSD均小于3%, 表明方法的稳定性和重复性良好。接着考察了方法的线性范围、检出限、

表 1 迁移时间和峰面积的重复性验证数据 Table 1 Validation data of the migration time and peak area repeatabilities

定量限和柱效。如表 2所示, SO42-在0.002~0.2 mmol/L范围内具有很好的线性关系, 其他离子在相应的线性范围内也都有良好的线性关系; 同时检出限(0.4~0.8 μ mol/L)和定量限(2~4 μ mol/L)也非常低, 几乎与离子色谱(检出限和定量限分别为0.2~0.4 μ mol/L和1~2 μ mol/L[6])相当, 而柱效则比离子色谱(104/m[7])高。最后, 通过回收率试验验证了方法的准确性。将5种待测离子分别加入实际样品中, 终浓度分别为0.02、0.04和0.08 mmol/L。每个浓度的样品按照优化的方法平行测试3次, 所得数据列于表 3中。在高、中、低3个加标水平下, 所有阴离子的回收率均在95.0%~118.0%之间, 证明该方法准确性较好。

表 2 各离子的柱效(N)、检出限、定量限、线性方程、相关系数(R2)及线性范围 Table 2 Column efficiencies (N), LODs, LOQs, linear equations, correlation coefficients (R2) and linear ranges of the ions

表 3 各离子在实际样品中的回收率(n=3) Table 3 Recoveries of the ions in real samples (n=3)
2.3 依诺肝素钠的稳定性研究

利用发展的CE方法研究了储存温度对依诺肝素钠稳定性的影响。分别将固体依诺肝素钠置于不同温度下, 并在不同时间点取出适量样品, 溶解后直接分析, 每个样品连续分析3次, 并以阴离子浓度随温度和时间的变化作图。未检测出乙酸根、磷酸根和氟离子, 氯离子的含量没有变化, 只有硫酸根离子含量有所增加。如图 5所示, 在同一温度下(即使低至30 ℃), 随着放置时间的延长, 依诺肝素钠中水解出的游离硫酸根也会越来越多, 证明依诺肝素钠在常温放置时不稳定。当温度升高时, 游离硫酸根水解速率变大, 证明温度升高会使依诺肝素钠不稳定性增加。

图 5 温度对依诺肝素钠稳定性的影响(n=3) Fig. 5 Effects of the temperature on the stabilities of enoxaparin sodium (n=3) All the separations were performed under the optimized conditions.
3 总结

发展了采用邻苯二甲酸作为背景吸收电解质的CE-间接紫外吸收检测方法, 用于测定低分子量肝素中的游离无机阴离子。该方法比目前常用的以铬酸根为背景吸收电解质的毛细管电泳离子分析方法更灵敏, 几乎可以达到离子色谱的检出限。与离子色谱法相比, 该方法所需样品量少、操作简便、分析快速、成本更低。因此, 该方法有望应用于肝素类药物的生产和保存过程中的质量监测。

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