细胞是生物体结构和功能的基本单位。为了揭示生命活动的规律,必须以研究细胞为基础,深入探索细胞的生长与分化、代谢与繁殖、运动与通讯、衰老与凋亡、遗传与进化等生命过程中的化学本质和规律。由于研究手段在灵敏度和样品体积等方面的限制,通常的生命科学研究主要以大量的细胞为研究对象。但是,同种细胞的不同个体间存在着显著的微观不均一性(异质性),基于大量细胞的实验结果难以反映单细胞水平上的生命活动规律。因此,基于单细胞的生命科学研究将能在更深的层次上揭示生命活动的本质和规律,为探究重大疾病的起因、发展和治疗提供更可靠的科学依据。2012年,美国《Science》杂志成功预测了单细胞研究将成为2013年6大重点研究之首[1, 2]。同年,美国国立卫生研究院(NIH)发布了单细胞分析计划,计划5年内投入9000万美元以上,用于单细胞分析工具的研发[3]。2013年,《Science》杂志展望单细胞研究将成为21世纪生命科学研究的主要突破口[4]。
尽管单细胞分析技术在很多应用领域中是至关重要的,如神经科学、干细胞生物学、发育生物学、癌症诊断和个性化药物筛选等等,然而单细胞分析技术面临着巨大的挑战。哺乳动物细胞一般较小(直径通常为10～30 μm),体积为10-13～10-11 L,所测组分含量常在10-18～10-15 mol水平,有时甚至低至10-21 mol,一些对细胞起关键作用的生物分子的含量更低,使得检测与分析变得非常困难。另一方面,单细胞分析要求细胞在分析后仍保持存活,目前大多数的单细胞分析技术均难以胜任。
本文针对单细胞研究难点对现有的单细胞分析技术进行归纳总结,旨在为单细胞分析新方法、新技术的开发和研究提供参考。
微分离技术是最早的单细胞分析技术,主要包括微柱液相色谱和毛细管电泳(CE)。微柱、毛细管的内径和进样体积与单细胞相匹配,从而促进了单细胞分析的发展,但是除激光诱导荧光(LIF)外,其他检测器的灵敏度往往不够,检测组分较少。
单细胞分析技术最早出现于50多年前。1965年,Matioli等[5]报道了单个血红细胞中血红蛋白的电泳分离,但由于分辨率和灵敏度的不足,该技术未获得进一步的发展。1976年,Neher和Sakaman[6]发明了膜片钳技术,可以检测单个离子通道,为单细胞神经生理学研究提供了强有力的研究工具,Neher和Sakaman因此获得1992年诺贝尔生理学和医学奖。1987年,Kennedy和Jorgenson等[7]报道了微柱液相色谱-电化学检测装置用于分析单个神经细胞中的神经递质和氨基酸等化合物。但由于该装置比较复杂,后续报道很少。1988年,Ewing等[8]首次报道了用于分析单个蜗牛神经细胞中神经递质的CE-电化学检测装置。稍后,Kennedy和Jorgenson等[9]构建了CE-LIF装置并用其分析了单个神经细胞中的氨基酸和神经递质。CE由于具有超低进样体积(nL～fL)、超高灵敏度(amol～zmol,即10-18～10-21 mol)、多组分分析和分析速度快的特点,因此特别适合于单细胞分析。依阿华大学Yeung研究组[10-12]利用CE-LIF开展了单细胞分析的一系列工作,利用内生荧光、间接荧光、细胞内衍生、免疫计数和粒子计数等方法分析了血红细胞中从离子到蛋白质等物质。程介克研究组[13]是国内最早开展单细胞分析研究的少数研究组之一,于1996年利用CE-安培检测联用实现了单个交感神经细胞中神经递质的分析。Sweedler研究组[14]利用CE、激光诱导荧光、放射化学、光谱、质谱和核磁共振等多种方法联用,研究了海兔单细胞中的神经肽等物质,在单细胞水平上获得多重信息。金文睿研究组[15]利用CE与电化学检测结合分析了单个红细胞中的谷胱甘肽。任吉存研究组[16]利用CE与化学发光检测联用装置分析了单个红细胞中的血红蛋白。2000年,Dovichi研究组[17]率先提出了“单细胞蛋白质组”的研究方向,将超灵敏的LIF检测与二维CE等多维分离技术联用,分析了单个人结肠癌细胞中的30多种蛋白质,检出限达zmol级别[18, 19]。最近,Dovichi等[20]利用级联雪崩光电二极管光子计数器为检测器构建了先进的CE-LIF系统,检测线性浓度范围达9个数量级(10-12～10-3mol/L),检测限达70个分子。邹汉法等[21, 22]发展了CE-LIF与流式细胞术联用的方法,通过高通量定量检测导入至单个细胞中的特定荧光分子,用于研究细胞膜的特性。刘笔锋等[23, 24]提出了一个基于微阵列-CE-LIF装置的单细胞化学蛋白质组学研究策略,分析了单细胞上的低丰度膜蛋白。不过,目前已报道的单细胞蛋白质组学研究平台的分离和检测能力有限,离全蛋白质组分析的要求仍有很大的差距。
微流控芯片是推动单细胞分析的又一重要工具。微流控芯片的微结构与细胞的体积相匹配,对细胞的操控、传输、定位、进样、溶胞、反应、分离和检测等功能均可集成到一块几平方厘米大小的微流控芯片上完成,采用微泵和微阀进行控制,可实现自动化分析。利用微流控芯片进行CE分析,分析效率可提高1～2个数量级,分离过程可在数秒内完成。
Zare研究组[25]研制出用于单细胞分析的微流控芯片,集成了对单细胞的进样、定位、试剂引入及检测等功能,成功应用于单个白血病细胞钙离子流的监控。Ramsey研究组[26]研制出高通量细胞微流控芯片,集成了细胞操控、快速溶胞、芯片电泳和激光诱导荧光检测等功能,细胞内容物的分离能在2.2 s内完成,细胞分析速度达每分钟7～12个细胞。Kennedy研究组[27]报道了基于芯片电泳的免疫分析,能连续检测单个胰岛细胞的胰岛素释放,检测限达3 nmol/L,该微流控芯片经改进后还可以用于药物的筛选[28]。程介克等[29, 30]发展了集成单细胞操控、传输、定位和时间监测的微流控芯片,实现了单个PC12神经细胞中多巴胺量子释放的实时检测。方肇伦研究组[31]则将细胞注射、溶胞、分离和检测等功能集成到微流控芯片上,用于分析单细胞内容物。金文睿研究组[32]报道了微流控芯片与电化学检测联用的单细胞分析装置。谢晓亮研究组[33]构建了单分子激光诱导荧光成像微流控芯片装置,实现了单细胞中随机表达的蛋白质单分子水平实时监测。Zare研究组[34]报道集成了细胞注入、捕获、清洗、溶胞、电泳分离、荧光标记和单分子计数激光诱导荧光检测的微流控芯片装置,实现了单个昆虫细胞中的β2-肾上腺素能受体以及单个蓝藻细菌细胞中的藻胆蛋白的分析。方群研究组[35]发展出用于单细胞分析的多功能微流控pL级液滴操控平台。杨朝勇研究组[36]报道了用于单细胞分析的基于微流控液滴的PCR技术。唐波研究组[37, 38]研制出可高灵敏检测单个活细胞表面膜蛋白的微流控液滴的PCR技术和分析单个神经细胞中的超氧化物和一氧化氮的微流控芯片电泳装置。
光学成像分析技术一直是细胞生物学研究的重要手段,也是单细胞分析的重要支撑技术之一。目前单细胞成像分析已经研究及开发了多种方法,主要有光学显微镜(一般荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、多光子荧光显微镜、全内反射荧光显微镜、荧光相关显微镜、近场扫描光学显微镜等)、原子力显微镜、扫描电化学显微镜及其他显微成像方法。
中国科学家曾在单细胞光学成像分析上做出了开拓性的工作。20世纪90年代,陈观铨研究组[39-43]研制出阿达玛变换显微成像分析仪,成功应用于单细胞中蛋白质和DNA的成像分析。但该技术由于数据采集时间长,没有得到广泛应用。Yeung研究组[44]利用倒置荧光显微镜、激光诱导荧光与电荷耦合元件成像结合,得到了单个活神经胶质细胞中5-羟色胺的天然荧光图像。该研究组发展出的单分子成像分析装置[45, 46],为单细胞成像分析提供了先进的技术。Ewing和Cans等[47, 48]将荧光成像与电化学检测相结合,研究了人工合成细胞和囊泡胞吐释放过程。共聚焦扫描显微镜可以将光束聚焦为直径1 μm,探测体积可低达1 fL,适合探测化合物在细胞内的空间分布。Kennedy等[49]利用共聚焦荧光扫描显微镜获得了单个鼠胰腺β-细胞Zn2+释放的图像。但是共聚焦荧光显微镜对细胞的光损伤较大,荧光染料易产生光漂白作用,光散射穿透样品深度不够。多光子荧光显微镜能有效克服以上问题。Bousso等[50]使用双光子荧光显微镜研究了胸腺细胞间反应动力学。Miller等[51]利用双光子荧光显微镜观察了T细胞在活体脉管中的快速移动。Zhang等[52]用量子点标记天花蛋白,利用双光子荧光显微镜研究了人绒癌细胞内天花蛋白的分布。Webb等[53]利用三光子荧光显微镜实时检测鼠白血病细胞中5-羟色胺囊泡图像。全内反射荧光显微镜的激发光仅深入到距离细胞表面100 nm处,特别适合观察细胞膜上的分子荧光图像和相关动力学过程[54]。荧光相关显微镜(FCM)可通过很小体积测量细胞内局部浓度、分子扩散、分子间反应过程图像,以用于活细胞研究[55, 56]。荧光寿命显微镜可以根据荧光寿命的差异有效避开干扰,已经成功应用于活细胞内的pH成像分析[57]和酶活性成像分析[58],但由于分辨率有限且需要复杂的数学处理,应用前景有限。近场扫描光学显微镜(NSOM)[59]、受激发射损耗显微镜(STED)[60]、光敏定位显微镜(PALM)[61]、荧光光敏定位显微镜(FPALM)[62]、随机光学重建显微镜(STORM)[63-65]等超分辨成像技术突破了光衍射的光学极限,空间分辨率可达20 nm甚至更低,是探测细胞内部精细结构的重要研究手段。虽然这些超分辨成像技术需要较长的成像时间和复杂的数学处理,目前在单细胞的化学成分及动态过程检测方面应用有限,但随着技术的进步,预期今后的发展潜力巨大。除应用广泛的光学显微镜外,原子力显微镜、同步加速器X射线显微镜等仪器与装置在单细胞分析中有一定的应用,而扫描电化学显微镜(SECM)则具有更广泛的应用。SECM不仅可以进行单细胞成像分析,而且可以测定电活性物质跨细胞膜的传递与转移[66-72]。
质谱分析能提供可靠的化合物结构信息,是单细胞分析中极具潜力的技术之一。一方面,单细胞内容物可以通过溶胞或通过微萃取后与质谱仪联用进行分析;另一方面,质谱还可以对单细胞进行成像分析,以揭示单细胞化学组成的空间分布。
Sweedler研究组[73-75]在单细胞质谱分析方面做了大量深入的研究工作,利用基体辅助激光解析电离质谱(MALDI MS)建立了单细胞质谱分析方法,分析了海洋软体动物及昆虫神经细胞中的神经肽[76-78]、连接神经中神经肽的分布[79]以及单个神经细胞中神经肽的空间分布[80]。基于MALDI MS的成像分析分辨率较低(通常为10～50 μm),只适用于尺寸较大的细胞。最近,Dreisewerd研究组[81]利用激光诱导定位技术实现了5 μm分辨率的MALDI MS成像。在单细胞成像方面,二级离子质谱(SIMS)[82, 83]是非常有前途的质谱技术,空间分辨率约为50 nm,可以对元素和生物分子的空间分布进行分析。Ewing等[84, 85]发展出基于飞行时间质谱(TOF MS)的SIMS成像技术,获得了细胞表面的分子形态图像,得到了鼠PC12细胞膜上的脂质图像并鉴定了部分细胞质的化学组成。Passarelli研究组[86]利用SIMS技术研究了加州海兔神经细胞上的脂质分布。Ewing等[87]利用SIMS成像技术揭示了单细胞生物嗜热四膜虫在交配中脂质结构域的形成过程。张新荣研究组[88]发明了梯度电压纳喷雾离子化质谱接口,可以便捷有效地消除萃取探针上的样品基体效应。以微米级的钨丝探针插入单细胞萃取细胞中的代谢产物,萃取后探针直接与电喷雾质谱联用,检测到单个洋葱细胞中的果聚糖、脂类和黄酮等的多种衍生物[89]。Dovichi研究组[90]研制出毛细管区带电泳-串联质谱联用技术,从HeLa细胞蛋白质组酶解产物中鉴定出10000个肽段和2100个蛋白质。
流式细胞术是支撑单细胞分析的重要技术之一[91-93]。流式细胞仪不仅可以对细胞进行分选,还可以对单个细胞进行分析,尤其在不均匀的细胞群体中,可快速探测单细胞的物理及化学参数,比如细胞大小、细胞体积、细胞计数、蛋白质或者核酸的全部含量。流式细胞术的另一个重要优势是分析通量大(每秒104个细胞)。
早在20世纪70年代末,Dolbeare[94]就利用流式细胞仪对单细胞进行动态酶活分析。流式细胞仪通常采用荧光检测,利用多色荧光技术,可实现高内涵检测。采用双荧光流式细胞仪,Murphy等[95]对单细胞的内生pH进行了检测。采用多色荧光流式细胞仪,Nebe-von-Caron等[96]实现了细菌单细胞水平的细胞功能分析。Krutzik等[97]利用流式细胞术发展了高内涵单细胞药物筛选技术。目前,基于流式细胞术的单细胞分析技术已经获得广泛的应用,例如,急性髓样白血病单细胞水平的磷酸-蛋白信号通路的绘制[98]和单细胞蛋白质组分析[99]。但是,空间分辨率和检测灵敏度的不足是流式单细胞分析技术的明显局限。
在各种各样的单细胞操控和分析技术不断发展和进步的同时,核酸扩增技术和测序技术取得了显著的进步。基于核酸扩增及测序技术的单细胞分析技术是目前最为成熟和应用最广的技术。
Wigler等[100]报道了一种新颖的肿瘤单细胞测序技术,对分别来自两个人类乳腺癌病例的100个单细胞进行了拷贝数变异检测,证实其中一种肿瘤包含3种不同的细胞亚群,而另一种是由遗传上相同的细胞群构成。Sandberg等[101]发明了一种称为Smart-Seq的基因组测序新方法,可以深入分析临床相关的单细胞,为了解肿瘤形成的复杂性提供可靠信息。Quake研究组[102]公布了来自一个成人男子91个精子的全部基因组序列,首次绘制了个体基因重组图谱,也首次发现了来自同一个人的不同精子的不同突变率。深圳华大基因组学中心等单位[103, 104]报道了单个癌细胞全外显子测序技术,能实现单个癌细胞的单核苷酸水平的序列解析能力,揭示了特发性血小板增多症病人在肿瘤发生中遵循单克隆演化模型和肾癌与常见突变基因VHL和PBRM1间的关系。
随着高通量测序技术的发展,转录组测序(RNA-Seq)分析已经逐渐成为一种常用的单细胞分析手段。然而,在过去的20多年中,人们对转录组的认识仍然局限在细胞群体水平,但是,这种常规的转录组分析方法忽视了生物系统和生物组织最普遍的特征——细胞异质性。为了剖析细胞异质性,就有必要在单细胞水平进行基因表达分析。单细胞RNA-Seq技术能获得单个细胞内近万个基因的表达信息,为辨别生物组织中各种细胞类型的转录特征和全面揭示细胞之间的基因表达差异提供了有力的工具。从1990年Brady等[105]报道了单细胞cDNA扩增方法开始,对单个细胞进行转录分析已有20多年历史。2009年Tang等[106]首次报道了基于高通量测序的单细胞RNA-Seq技术。随着高通量测序的推广和发展,单细胞RNA-Seq技术近几年发展迅速。2015年,微流控芯片液滴编码技术的发展真正实现了高通量单细胞分析[107]。
激光诱导荧光[108, 109]和表面增强拉曼散射[110, 111]等光谱技术能提供单分子水平的检测灵敏度,这为单细胞内低拷贝数生物分子的检测提供了强有力的检测手段。Xie等[112, 113]利用单分子荧光检测手段系统分析了单个细胞中蛋白质表达的随机性以及单个细胞中低拷贝数生物分子(蛋白质、信使RNA)的表达水平差异。Nie等[114, 115]利用表面增强拉曼散射光谱技术,实现了对单个罗丹明分子的实时检测,还将该技术用于单个活细胞内的单分子检测。本课题组[116]提出了基于活体微萃取和表面等离激元光学检测相结合的称为“表面等离激元免疫夹心法(PISA)”的新颖方法,可以检测单个活细胞和活体动物中低拷贝数蛋白质的表达水平。该方法的原理为,将表面修饰了单克隆抗体或分子印迹聚合物的金基微萃取探针在显微操作平台的辅助下插入到单细胞中,在很短的时间内将特定的目标蛋白质专一高效地萃取到探针表面,微萃取探针拔出并经清洗后用修饰了能识别目标蛋白质的抗体或硼亲和配基的银基纳米拉曼探针标记,从而形成萃取探针-目标蛋白质-拉曼标签三明治型复合物结构,当用激光束照射以上三明治型复合物表面时发生表面等离激元光学效应,银基拉曼标签产生表面增强拉曼散射,金基微萃取探针产生表面等离子波,进一步增强银基拉曼标签的表面增强拉曼散射信号,从而大大增强了检测灵敏度,检测限可达单分子水平。本课题组制备的一系列分子印迹聚合物已经成功用于多种复杂体系中痕量目标化合物的分析[117-121],充分体现了分子印迹聚合物具有超高的专一性识别性能。除此之外,本课题组还将该分析技术赋予了中国文化元素,利用针灸针制备出微萃取探针,用于活体动物组织内的低拷贝数蛋白质的测定。该单细胞分析技术在癌症诊断与预后、细胞质量控制、发育生物学、干细胞研究及脑科学等多个领域中具有重要的应用前景。
单细胞分析已经成为21世纪分析化学前沿热点之一。近年来,微流控芯片、光学成像、质谱、流式细胞术以及单细胞测序技术的迅速增长,使单细胞分析技术的应用领域也越来越广,如神经科学、发育生物学等。而一些新的领域也将为单细胞技术的发展提出更多的挑战,例如在人工授精、干细胞移植等医学领域,如何对细胞进行质量分析并且保证分析后的细胞仍然存活且最大程度保持原有内部化学组成至关重要。然而,绝大部分现有技术对单细胞进行分析后,细胞要么已经死亡,要么细胞内化学组成因引入某些检测试剂而发生改变,因此,微创并且能够活体检测的单细胞分析技术是未来单细胞分析领域的一项巨大挑战。此外,基于光谱分析的超灵敏检测技术的使用也将为单细胞分析技术的研究提供更多新颖的平台,因此基于多种光谱技术联用的新型超灵敏检测手段的发展是未来单细胞分析领域应该努力的目标之一。近年来,癌症和干细胞领域的重大突破揭示了群体细胞中某些个体细胞在功能上表现出的异质性,对今后各种“组学”研究向单细胞水平延伸提出了更高的要求,例如,为了满足单细胞基因组学、转录组学的深入研究,高效、新颖的单细胞分离技术有待开发,只有结合细胞生态学信息,在保持细胞原有活性的前提下,实现单个细胞的捕获、操控和回收,这样获得的单细胞才可以继续培养或者应用于表达谱、测序、拷贝数变异等分析工作。同时,为了实现真正意义上的蛋白质组学、代谢组学分析,高通量的单细胞分析技术也是未来的一项重大挑战。
2016,
Vol. 34 Issue (12): 1154-1160
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