全二维液相色谱自1978年由Erni等^[11]建立以来, 在多肽等混合物样品分析中得到了广泛应用。邹汉法研究员课题组首先于2004年将构建的全二维液相色谱系统用于中药川芎的多成分分析^[12]。第一维采用氰基(CN)柱(200 mm×2.0 mm, 5 μm), 以甲醇-水系统为流动相, 在0.04 mL/min的流速下梯度洗脱215 min, loop环的体积为200 μL, 收集5 min; 第二维采用ODS柱(200 mm×2.0 mm, 5 μm)，以乙腈-0.1%(v/v)乙酸水系统为流动相, 在0.7 mL/min的流速下等度洗脱, 完成一次分析需5 min, 共分析43次, 分析过程中随着第一维色谱柱洗脱梯度的变化改变第二维色谱的起始梯度, 但在一次分析中仍保持等度洗脱。该反相×反相(RP×RP)的全二维色谱系统可较好地兼顾中药化学成分中大极性和小极性的化合物。应用该方法并结合质谱检测器, 从川芎提取物中检测到了52种化合物。该课题组根据范氏方程进一步优化了第一维CN柱的流速(0.13 mL/min), 并将第二维色谱柱更换为更耐压的ODS整体柱, 以3.0 mL/min的流速洗脱, 完成一次分析需1.5 min, 提高了色谱的分辨率, 并通过改进色谱峰处理软件算法来区分相对丰度较低的峰, 使改进的全二维LC×LC法的峰容量提高到2 440 peak/130 min, 并从川芎的提取物中检测到120种化合物^[13]。在此基础上, 邹汉法研究员课题组先后建立了脂质体柱-ODS柱系统用于银杏提取物、龙胆泻肝汤等中药成分的分析^{[14, 15]}, 为全二维液相色谱用于中药复杂成分的分析奠定了基础。

本文对近10年报道的用于中药分析的全二维液相色谱法进行了总结(见表 1)。可以看出, 随着色谱柱填料类型的多样化、商品化, 以及高压/超高压液相色谱系统的出现和数据处理软件的完善和普及, 建立的全二维液相色谱方法更加简便, 且应用范围更广。例如银杏叶提取物中的黄酮类成分较多, 且几乎都是以山柰酚、槲皮素和异鼠李素作为苷原的结构类似物, 采用一维色谱分析较困难，而采用二维色谱分析时, 从银杏叶提取物中检测出了61种黄酮类化合物, 其中25种化合物具有较好的活性^[26], 与一维色谱方法相比, 分析能力大大提高。值得注意的是, 由于流动相兼容性和大多数天然产物分离机制的限制, 用于中药多成分分析的全二维液相色谱多为RP×RP模式。Tian等^[19]和Wei等^[20]构建了用于中药分析的正相×反相(NP×RP)全二维液相色谱模式, 虽然通过控制流动相温度或改进接口可以克服流动相兼容问题, 但在分析过程中, 第一维色谱需暂停分析, 等第二维分析结束后再继续进行, 即第一维和第二维之间难以实现快速切换, 分析时间较长。

表 1 (Table 1)

表 1 全二维液相色谱法在中药分析中的应用 Table 1 Comprehensive LC×LC applications in traditional Chinese medicine analysis Ref. 1D column (length×i.d., dp); flow rate; analysis time Switching valve Loop volume; modulation time 2D column (length×i.d., dp); flow rate Detection Application (type of compounds) [16] Hypersil-CN (150 mm×4.6 mm, 5 μm); 100 μL/min; 220 min 2-position10-port 200 μL; 2 min Merck Chromolith Flash RP (50 mm×4.6 mm, -); 3 mL/min UV; APCI-IT MS Adinandra nitida(flavonoids) [17] Kromasil-SAX (200 mm×2.0 mm, 5 μm); 40 μL/min; 80 min 2-position8-port 200 μL; 5 min Kromasil-ODS (100 mm×4.6 mm, 5 μm); 2.0 mL/min DAD; APCI-MS Lonicera japonica(phenolic acid, flavonoids) [18] Waters Atlantis C18 (150 mm×2.1 mm, 3 μm); 100 μL/min; 60 min 2-position10-port 130 μL; 35 s Ultrasphere CN (75 mm×4.6 mm, 3 μm); 1.9 mL/min UV; ESI-TOF MS Ocimum basilicum., Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Salvia officinalis, Mentha spicata, Thyme vulgaris(phenolic acid) [19]* Macherey-Nagel CN (160 mm×0.53 mm, 5 μm); 8 μL/min; 26 min 2-position10-port 12 μL; 1.5 min Merck monolithic RP-18e (50 mm×4.6 mm, -); 4 mL/min UV Salviae miltiorrhiza(diterpenoids) [20]* Hypersil SiO2(50 mm×4.6 mm, 5 μm); 100 μL/min; 40 min 2-position10-port 200 μL; 2 min Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm); 1 mL/min UV Zhengtian pills [21] Phenomenex Luna CN (150 mm×2.0 mm, 3 μm); 25 μL/min; 160 min dual2-position 4-port 26 μL; 1 min Kinetex C18 (3.0 mm×50 mm, 2.6 μm); 2 mL/min UV Hedyotis diffusa, Scutellaria barbata [22] Phenomenex Luna CN (50 mm×3.0 mm, 3 μm); 90 μL/min; 300 min 2-position10-port 100 μL; 1 min Kinetex XB-C18 (3.0 mm×50 mm, 2.6 μm); 2 mL/min DAD Hedyotis diffusa, Scutellaria barbata [23] Nucleodur Sphinx Phenyl-C18 (100 mm×1.0 mm, 5 μm); 17 μL/min; 47 min / 50 μL; 3 min Supelco Discovery HS RP-18 (75 mm×2.1 mm, 3 μm); 2.3 mL/min DAD; ESI-MS Trigonella foenum-graecum(flavonoids) [24] Phenomenex Luna CN (150 mm×2.0 mm, 3.0 μm); 25 μL/min; 150 min dual2-position 4-port 26 μL; 0.7 min Phenomenex Kinetex C18 (50 mm×3.0 mm, 2.6 μm); 2 mL/min DAD; ESI-TOF MS Hedyotis diffusa(flavonol glycosides, iridoid glycosides) [25] Agilent Polaris 3 C8-ether (100 mm×3.0 mm, 3 μm); 80 μL/min; 75 min / 50 μL; 33 s Agilent Poroshell 120 SB-C18 (50 mm×3.0 mm, 2.7 μm); 2 mL/min DAD; ESI-QTOF MS tripterygium glycosides tablets (diterpenoid, triterpenoid and alkaloid) [26] Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (150 mm×2.1 mm, 5 μm); 100 μL/min; 150 min dual2-position 4-port 50 μL; 0.5 min Agilent Zorbax Eclipse Plus Phenyl (50 mm×3.0 mm, 1.8 μm); 2 mL/min DAD; ESI-QTOF MS extraction of Ginkgo biloba(flavonoids) [27] Waters Acquity CSH (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 100 μL/min; 40 min 2-position8-port 80 μL; 0.5 min Agilent Poroshell 120 Phenyl-Hexyl (50 mm×3.0 mm, 2.7 μm); 2 mL/min DAD; ESI-IT MS Glycyrrhiza uralensis(saponins, flavonoids) [28] Merck SeQuant ZIC-HILIC (150 mm×1.0 mm, 3.5 μm); 15 μL/min; 80 min 2-position8-port 30 μL; 1.3 min Supelco Ascentis Express C18 (50 mm×4.6 mm, 2.7 μm); 3 mL/min DAD; ESI-IT MS Glycyrrhiza glabra(saponins, flavonoids) [29] Thermo Hypersil Gold CN (150 mm×1 mm, 3 μm); 80 μL/min; 120 min 2-position8-port 200 μL; 2 min Thermo Accucore C18 (50 mm×4.6 mm, 2.6 μm); 2 mL/min DAD; ESI-LTQ-Orbitrap MS Salvia miltiorrhiza(phenolic acid) [30] Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (150 mm×2.1 mm, 1.8 μm); 100 μL/min; 52 min 2-position8-port 80 μL; 0.5 min Agilent Poroshell 120 phenyl-hexyl (50 mm×3.0 mm, 2.7 μm); 1.5 mL/min DAD; ESI-IT MS Gleditsia sinensis(saponins, diterpenoids) * The developed comprehensive LC×LC methods are based on NP×RP model; /: unknown; -: the monolithic column; ref.: reference; i.d.: internal diameter; dp: diameter of particles; APCI: atmospheric-pressure chemical ionization; IT: ion trap; TOF: time-of-flight; QTOF: quadrupole time-of-flight; DAD: diode array detector; LTQ: linear ion trap.

表 1 全二维液相色谱法在中药分析中的应用 Table 1 Comprehensive LC×LC applications in traditional Chinese medicine analysis

相比于全二维的整体模式, 中心切割技术只是将第一维分离的部分组分引入第二维, 具有较高的针对性, 对于中药某些难于分离的成分具有重要意义。例如, 由于人参皂苷类化合物的结构极为相似, 只用一维色谱无法完全分离, Yao等^[31]采用多次中心切割二维色谱实现了中成药中8种人参皂苷类化合物的基线分离与准确定量。由于中药成分中各化合物的含量不同且基质复杂, 常将全二维和中心切割技术联用。Qiao等^[32]将中心切割和全二维液相色谱技术联用，对葛根中的微量成分进行分析，将中药主成分进行切割移除后, 用质谱对相对丰度低的峰进行解析, 最终发现了9种新化合物。在后续实验中, 该课题组^[33]以全二维液相色谱模式在42 min内分离了125种化合物, 以中心切割模式针对性地分离了其中13种成分, 从而实现了葛根芩连汤的全面物质基础表征。

2.2 中药活性成分筛选

中药是一个复杂的整体, 其药效物质基础的阐明离不开相关化学成分的活性评价。传统方法采用先化学分离后活性测试的模式, 所需样品量多且耗时、耗力, 限制了中药药效物质基础的研究。随着分析技术的发展, 基于高灵敏度、高通量分析方法的在线筛选/评价方法大大提高了中药活性成分的发现效率。

将多维色谱技术与中药活性成分快速筛选技术结合, 可以更好地适应中药多变的复杂体系, 也可以明显提高分析和筛选效率。

2.2.1 在线二维色谱与涡流色谱联用

涡流色谱(turbulent flow chromatography, TFC)是一种利用大粒径( > 25 μm)填料, 使流动相在高流速下产生涡流状态的色谱技术, 具有保留小分子而不保留生物大分子的特性, 可以实现生物样品中待测药物小分子的净化和富集。其作为生物样品分析的前处理技术而得到广泛应用^[34]。基于TFC建立的样品在线预处理模式是典型的中心切割二维液相色谱模式, 其基本过程为:将大分子和小分子化合物混合后上样至TFC柱, 首先，大分子化合物被洗脱而小分子化合物被保留; 待小分子化合物被洗脱时切入第二维液相色谱柱进行分析。TFC柱和液相分析柱之间主要以六通阀连接, 从而完成涡流色谱在线净化样品的二维液相分析。Xin等^[35]在建立的涡流色谱在线预处理液相分析系统的基础上, 通过加入1%(质量分数)的亲水-β-环糊精(HP-β-CD), 提高载体微透析的提取效率, 实现了微透析-涡流色谱在线预处理-高速液相色谱分析的二维色谱药物代谢研究模式, 具有在线采样、分析速度快、稳定性高等特点, 并将其应用于贝母生物碱的药代动力学的研究中。

活性生物大分子(酶、受体、载体蛋白等)是小分子药物在体内产生药效的重要生物结合靶标之一。基于与药理靶标结合的化合物具有潜在的活性这一理论, 笔者所在课题组通过采用两根TFC柱, 建立了以2D-TFC-HPLC-MS为手段的中药活性分子快速筛选技术, 其主要原理见图 3。由图 3可知, 将生物活性大分子(如靶蛋白)与中药提取物进行孵育, 潜在的活性化合物与靶蛋白结合形成复合物, 通过第一维涡流色谱柱, 可以将靶蛋白-小分子复合物与游离小分子化合物分离; 富集到的靶蛋白-小分子复合物在解离线圈内进行解离, 游离靶蛋白和游离小分子进入第二维涡流色谱柱实现分离; 获得的潜在活性小分子经过二维液相色谱-质谱系统进行分析, 从而快速地从中药复杂成分中筛选出具有目标活性的化合物。将建立的2D-TFC-HPLC-MS法应用于贝母类生物碱中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制剂的筛选, 第一维TFC柱为亲水亲脂平衡(HLB)柱, 第二维色谱柱为复合阳离子交换(MAX)柱, 通过方法优化和验证, 筛选出了8种和11种分别能和乙酰胆碱酯酶(AChE)、丁酰胆碱酯酶(BChE)高效结合的贝母类甾体生物碱, 并通过半抑制浓度(IC₅₀)的测定, 验证其抗胆碱酯酶的活性^[36]。为扩大2D-TFC-HPLC-MS法的应用范围, 改变了TFC的保留机制, 第一维采用MAX柱, 第二维采用HLB柱, 通过方法优化, 可对强极性和弱酸性成分进行分析。利用此系统, 对丹参水提物中的黄嘌呤氧化酶抑制剂进行筛选, 得到3种活性较高的酚酸类化合物, 分别为丹酚酸A、丹酚酸C和异丹酚酸C, 其中丹酚酸C为首次报道的黄嘌呤氧化酶抑制剂, 其活性与阳性药别嘌醇的活性相当^[37]。所建立的2D-TFC-HPLC-MS系统可使用不同类型的TFC柱实现多种类型成分的分析, 并具有较好的普适性; 在该系统中, ¹D TFC柱收集大分子化合物, ²D TFC柱收集小分子化合物, 为TFC分析方法在中药活性成分筛选的应用提供了新思路。

图 3

Fig. 3

图 3 2D-TFC-HPLC-MS法筛选活性成分的示意图 Fig. 3 Schematic diagrams of the 2D-TFC-HPLC-MS method for bioactive components screening a. The valve 1 was in position A. The complexes were eluted from 1D column and collected in the loop. b. The valve was switched to the position B. The unbound nature products were eluted from 1D column, and the pre-collected complexes in loop were disrupted, then the affinity targets were removed. c. The valve was switched to the position B. The potential bioactive components were analyzed by HPLC-MS. TFC: turbulent flow chromatography.

2.2.2 在线二维色谱与细胞膜色谱联用

细胞膜色谱(cell membrane chromatography, CMC)是生物色谱技术中的一种, 其原理是将人或动物的活性组织细胞膜固定在色谱载体的表面, 制备成细胞膜固定相。药物随流动相进入色谱柱时与细胞膜固定相上的受体发生相互作用, 如果与特定的细胞膜受体有特异性结合, 就可在细胞膜色谱模型中反映出来。CMC技术是将药物分子在体内与细胞膜受体相互作用过程转换为体外的色谱过程, 具有受体亲和色谱分离的双重特性, 是研究药物与活细胞相互作用的理想技术^[38]。CMC从建立之初就因其在中药活性筛选方面体现出的较好优势而受到广泛关注。目前CMC已形成较为完善的技术方法和模型体系, 并被广泛应用于多种功效的中药活性成分筛选^[39]。

CMC作为一种生物色谱技术, 其色谱分离效率较低, 在某种程度上会影响活性成分的检测和辨识。因此构建细胞膜色谱-二维高效液相色谱分析系统, 可提高筛选效率。细胞膜二维液相分析系统的原理类似于heart-cutting技术, 即第一维CMC筛选出的有效组分流出色谱柱后(紫外检测识别), 通过切换阀切换流入第二维色谱柱进行分离分析, 用于提高目标活性成分的分辨率和鉴定效率。如第一维色谱柱采用人皮肤鳞癌细胞A₄₃₁/CMC柱, 第二维用ODS分析柱, 中间用二位十通阀并联两个预柱。第一维洗脱的第一组目标成分先进入预柱1进行富集, 然后转入ODS柱进行分析, 同时第二组成分可以在预柱2进行富集后, 再转入ODS柱。采用该系统, 从苦参^[40]和红毛七^[41]中筛选得到了具有表皮细胞生长因子受体拮抗剂活性的生物碱类化合物。第一维采用血管内皮生长因子受体VEGFR-2/CMC柱, 从附子中筛选出有血管表皮生长因子受体活性的生物碱^[42]。采用乳腺癌细胞MDA-MB-231/CMC柱, 从厚朴中筛选出抗乳腺癌的活性化合物^[43]。采用大鼠嗜碱性细胞白血病细胞RBL-2H3/CMC柱, 从双黄连注射液中筛选出可能引起过敏反应的物质^[44]。第一维采用α_1A-肾上腺素受体/CMC柱, 并用两个loop环代替富集柱用于筛选红毛七中的α_1A-肾上腺素受体拮抗剂^[45]。二维CMC-液相筛选方法比一维方法的筛选效率高, 但CMC馏分的收集/切换依赖于第一维色谱后的检测器信号(通常为紫外信号), 存在成分丢失的风险。

Chen等^[46]建立了基于CMC的全二维液相色谱分析方法, 通过两个loop环分别往复收集第一维色谱中的馏分, 经切换阀往复切换到第二维分析柱上进行分析, 从而达到全二维分析模式。如采用人肝癌细胞HepG2/CMC柱(流速0.2 mL/min，500 μL loop环，每2.5 min切换一次)和RP 18e硅胶整体柱(流速3.5 mL/min)-TOF MS系统, 从黄柏^[46]、苦参^[46]和鸦胆子^[47]中筛选出具有抗肝癌活性的成分; 第一维采用人慢性髓原白血病细胞K562/CMC柱, 从青黛中筛选得到活性较好的抗白血病化合物^[48]。通过改进, 将正常心肌细胞/CMC柱和DOX (多柔比星)诱导心衰细胞/CMC柱联用, 并依次作为第一维色谱柱, 从附子中特征地筛选得到对DOX-诱导心力衰竭有效的4种附子生物碱类化合物^[49]。为从口服黄芩的大鼠血浆中筛选出潜在的抗肝癌活性物质, 在第一维采用HepG2/CMC柱的基础上, 将loop环换为XDB-C18柱(12.5 mm×4.6 mm, 5 μm)，对口服黄芩大鼠的血浆样品进行在线预处理和富集^[50], 从而建立筛选中药在生物体内有效物质的CMC-全二维液相分析方法。

3 结论与展望

在线二维液相色谱因峰容量高、分离效率好而受到众多研究者的青睐。近年来, 在线二维液相色谱被广泛地应用于多个研究领域中复杂样品的分析。在线二维液相法在中药中的应用显著地提高了中药化学成分分析和识别的效率, 为后续药效物质基础、作用机制和质量评价研究奠定了良好基础。

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