四溴双酚A (tetrabromobisphenol A, TBBPA)是目前世界范围内产量最大、应用最广泛的溴代阻燃剂^[1]。约有18%的TBBPA用于生产TBBPA衍生物^[2]。工业化生产的TBBPA衍生物包括四溴双酚A双(2-羟乙基醚)(tetrabromobisphenol A bis (2-hydroxyethyl ether), TBBPA-BHEE)、四溴双酚A双(2-缩水甘油醚)(tetrabromobisphenol A bis (glycidyl ether), TBBPA-BGE)、四溴双酚A双(2-烯丙基醚)(tetrabromobisphenol A bis (allylether), TBBPA-BAE)及四溴双酚A双(2-二溴丙基醚)(tetrabromobisphenol A bis (dibromopropyl ether), TBBPA-BDBPE)。TBBPA衍生物作为反应型或添加型溴代阻燃剂大量应用于泡沫塑料、高聚物、环氧树脂、热塑性聚酯、聚氨酯、层合板及聚酯纤维中^[3]。其广泛使用引发了日益增加的环境负荷及人体暴露风险。研究显示, TBBPA衍生物在水体、底泥、土壤、鸟类、鸟蛋等多种环境或生物介质中频繁检出^[4-6]。

TBBPA已被证实具有潜在的神经毒性、肝毒性、免疫毒性和内分泌干扰效应^[7-9]。与TBBPA相比, TBBPA衍生物的毒理学资料非常匮乏。为准确评价TBBPA衍生物对人体健康的影响, 其毒理学研究亟待进行。作者实验室^[10]基于大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)的研究发现, TBBPA-BHEE (结构式见图 1)对细胞活力的抑制能力大于TBBPA及其他3种衍生物。以TBBPA-BHEE作为模式化合物的研究发现, TBBPA-BHEE诱导PC12细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成是导致细胞死亡的重要原因^[10]。线粒体呼吸链的氧化磷酸化过程是胞内ROS的主要来源, 生成的ROS主要为超氧化物(O₂^-·)^[11], 而呼吸链中CoQH₂-细胞色素c还原酶复合物(复合物Ⅲ)产生的泛半醌自由基中间体(QH·)是超氧化物的主要来源^{[12, 13]}。QH·的有效浓度和生成速率成为调控ROS生成的关键因素。当线粒体氧化磷酸化过程被阻滞时, QH·的有效浓度上升, 诱导生成过量的ROS; 当氧化磷酸化加速进行时, QH·的生成速率上升, 也会导致过量ROS的生成^[11]。因此, PC12线粒体功能受到TBBPA-BHEE的刺激或抑制均可导致过量ROS的生成。TBBPA-BHEE诱导PC12细胞ROS生成的分子机制, 及TBBPA-BHEE对PC12线粒体呼吸链氧化磷酸化过程的干扰机制值得进一步探究。此外, 线粒体是细胞能量代谢的核心, 进入线粒体的丙酮酸经过三羧酸循环(TCA)和呼吸链氧化磷酸化最终生成ATP^[14]。ATP水解产物ADP、AMP及转化产物cAMP (cyclic AMP)也都是能量代谢调节中的关键因子。TBBPA-BHEE是否通过干扰线粒体功能对细胞能量代谢产生影响也为了本研究的核心问题。

图 1

Fig. 1

图 1 TBBPA-BHEE的结构式 Fig. 1 Chemical structure of TBBPA-BHEE TBBPA-BHEE: tetrabromobisphenol A bis (2-hydroxyethyl ether).

研究ATP及其相关代谢产物ADP、AMP、cAMP等含量的变化是评价外源因素对细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化过程及能量代谢影响的有效手段。周洁^[15]利用ATP含量测定评价新生隐球菌荚膜多糖毒力因子对小鼠小胶质细胞氧化磷酸化及能量代谢过程的影响; ATP、ADP、AMP的浓度变化也用于评价胡桃醌对大鼠肝脏氧化磷酸化及能量代谢的影响^[16]; 拟南芥中cAMP含量的变化导致其能量代谢过程的改变^[17]。

化学发光试剂盒检测是生物学实验中最常用的ATP检测方法。该检测方法波动大, 无法同时测定ATP、ADP、AMP和cAMP^[18]，且复杂细胞基质对化学发光检测存在强烈的背景干扰, 腺嘌呤核苷酸在细胞中的含量仅为亚微摩尔级等问题也困扰着ATP及其代谢产物的准确定量^{[18, 19]}。HPLC-MS/MS以分离效率高、检测灵敏度高、特异性好而被认为是直接检测ATP及其相关代谢产物的有力工具^{[20, 21]}。ATP及其相关代谢产物中磷酸基团的存在导致该类物质极性较强, ESI的应用较好地克服了这一问题^[19]。

本研究利用HPLC-ESI-MS/MS检测TBBPA-BHEE暴露后PC12细胞内ATP、ADP、AMP、cAMP的含量及相对变化, 进而评价TBBPA-BHEE对PC12线粒体呼吸链氧化磷酸化过程及能量代谢的影响。同时, 结合细胞形态的改变进一步阐述了TBBPA-BHEE的毒性机制。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Thermo Fisher 3111型CO₂细胞培养箱，Thermo Fisher HERAEUS FRESCO 21型离心机(美国Thermo Fisher公司)。OLYMPUS Ix73型倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)。JY92-ⅡN型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。Waters alliance 2695高效液相色谱仪，Waters Quattro Premier XE质谱仪(美国Waters公司)。

PC12细胞(未分化型)购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。RPMI-1640细胞培养基(美国Hyclone公司), 胎牛血清、青霉素和链霉素(美国Gibco公司)，多聚-L-赖氨酸、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、TBBPA-BHEE (CAS No. 4162-45-2, 98%)、ATP、ADP、AMP、cAMP (美国Sigma公司)。苯酚、EDTA (分析纯, 国药集团化学药剂有限公司)。甲醇(色谱级, 美国J. T. Baker公司), 乙酸铵、甲酸(色谱级, 德国Merck公司)。

100 mm细胞培养皿、细胞刮(美国Corning公司), 2 mL聚乙烯离心管(美国Axygen公司), 0.22 μm聚偏氟乙烯滤器(美国Millipore公司)。

1.2 PC12细胞的培养及TBBPA-BHEE暴露

100 mm细胞培养皿用10 μg/mL的多聚-L-赖氨酸包被过夜, 弃掉多聚-L-赖氨酸溶液, 用无菌水清洗培养皿, 于生物安全柜中吹干。RPMI-1640细胞培养基中加入10%(v/v)胎牛血清, 100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素作为完全培养基用于细胞培养。PC12细胞以4×10⁶个/皿密度接种于多聚-L-赖氨酸包被的100 mm细胞培养皿中, 在37 ℃、5%(体积分数) CO₂细胞培养箱中培养。接种24 h后, 完全培养基换为含2%(v/v)胎牛血清的饥饿培养基, 用于细胞暴露实验。本实验室之前的研究^[10]表明, PC12细胞暴露于25 μmol/L的TBBPA-BHEE 6 h后, 细胞活力在60%以上。其对细胞活力无影响或亚细胞毒性的浓度适合线粒体干扰效应的研究。本研究将PC12细胞暴露于25 μmol/L的TBBPA-BHEE中, 暴露时间分别为1、3、6和24 h, 0.5%(v/v) DMSO作为溶剂对照组。使用倒置荧光显微镜对对照组及24 h暴露组的细胞形态进行观察, 其他实验组用于ATP、ADP、AMP和cAMP的测定。鉴于溶剂对实验结果无显著影响, 在实验数据展示时采用溶剂对照组结果, 而不再给出空白对照组。

1.3 ATP、ADP、AMP和cAMP的提取

暴露实验结束后, 弃掉培养皿中的细胞培养基, 用4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液清洗细胞2次。向每个培养皿中加入500 μL 4 ℃预冷的提取缓冲液(10 mmol/L乙酸铵, 4 mmol/L EDTA, 苯酚饱和溶液, pH 7.5), 用细胞刮将PC12细胞刮下, 收集于2 mL聚乙烯离心管中, 整个操作在冰上进行。将上述细胞提取液超声(工作时间:5 s; 间歇时间:15 s; 总时间:60 s; 超声功率:65 W)。将超声后的细胞提取液溶液于15 000 r/min、4 ℃离心30 min, 取上清液并经0.22 μm滤器过滤得到待测溶液。另外, 每个实验组均设置一个平行处理组, 用于暴露实验结束后的细胞计数。

1.4 ATP、ADP、AMP和cAMP的测定

1.4.1 色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX 300SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国Agilent公司); 流动相:含0.1%(v/v)甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液(A)和含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液(B)。梯度洗脱程序:0~5.0 min, 5%B; 5.0~16.0 min, 5%B~100%B; 16.0~21.0 min, 5%B。流速:0.8 mL/min; 柱温:35 ℃; 进样量:10 μL。

1.4.2 质谱条件

离子源:ESI源; 检测模式:负离子模式; 扫描模式:多反应监测模式(MRM mode); 源温度:120 ℃; 脱溶剂气温度:450 ℃; 脱溶剂气流量:800 L/h; 锥孔气流量:50 L/min。各化合物的特征离子对设定如下:ATP m/z 506.6/159.2(锥孔电压:30 V; 碰撞电压:36 V); ADP m/z 426.4/134.1(锥孔电压:30 V; 碰撞电压:36 V); AMP m/z 345.7/79.0(锥孔电压:30 V; 碰撞电压:30 V); cAMP m/z 328.5/134.1(锥孔电压:30 V; 碰撞电压:36 V)。

2 结果与讨论

2.1 HPLC-ESI-MS/MS同时定量测定细胞线粒体呼吸链产物

本研究利用已建立的HPLC-ESI-MS/MS方法对PC12细胞中ATP、ADP、AMP和cAMP的浓度进行了测定。图 2为ATP (10 μg/mL)、ADP (10 μg/mL)、AMP (1 μg/mL)和cAMP (1 μg/mL)标准物质的典型色谱图, 图 3为PC12细胞提取液中相应物质的典型色谱图。ATP、ADP、AMP和cAMP的保留时间分别为5.5、5.8、6.4和13.9 min, 标准曲线的线性回归方程分别为y=3 223x-6 360、y=5 617x-3 659、y=29 698x+1 865和y=43 527x, 线性相关系数r²分别为0.98、1.00、1.00和1.00。4种化合物检测6次的相对标准偏差分别为10.8%、12.1%、7.9%和7.0%。与文献[21, 22]报道相比较, 4种待测化合物的仪器响应良好, 受待测样品基质干扰较小, 标准曲线线性可满足定量要求。传统的ATP定量方法为化学发光法, 该方法难以实现ATP、ADP、AMP和cAMP多种物质的同时测定, 存在检测波动大(相对标准偏差 < 20%)、易受多种阴离子干扰、测试所需荧光素-荧光素酶试剂容易失活、耗时长、操作繁琐等不足^[18]。与传统定量方法相比, HPLC-ESI-MS/MS方法可实现ATP、ADP、AMP和cAMP的同时在线检测, 稳定性好, 分离效率高, 检测灵敏度高, 特异性好。因此, HPLC-ESI-MS/MS是研究细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化及能量代谢过程的有力工具。

图 2

Fig. 2

图 2 ATP、ADP、AMP和cAMP标准物质的提取离子色谱图 Fig. 2 Extracted ion chromatograms of ATP, ADP, AMP and cAMP (cyclic AMP) standard substances a. 10 μg/mL ATP; b. 10 μg/mL ADP; c. 1 μg/mL AMP; d. 1 μg/mL cAMP; e. total.

图 3

Fig. 3

图 3 经TBBPA-BHEE (25 μmol/L, 6 h)处理的PC12细胞中ATP、ADP、AMP和cAMP的提取离子色谱图 Fig. 3 Extracted ion chromatograms of ATP, ADP, AMP and cAMP in PC12 cells treated with TBBPA-BHEE (25 μmol/L, 6 h) a. ATP; b. ADP; c. AMP; d. cAMP; e. total.

2.2 TBBPA-BHEE加速PC12线粒体呼吸链氧化磷酸化过程

为探究TBBPA-BHEE对PC12细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化过程的影响, 本研究利用HPLC-ESI-MS/MS对TBBPA-BHEE (25 μmol/L)暴露后PC12细胞内ATP、ADP浓度及二者之比(ADP/ATP)的变化进行了评价。如图 4a所示, 对照组、1 h暴露组、3 h暴露组、6 h暴露组的PC12细胞内ATP浓度分别为2.6×10^-15、2.6×10^-15、3.2×10^-15、3.7×10^-15 mol/cell。PC12细胞内ATP浓度随暴露时间的延长而上升。葡萄糖进入细胞后, 先在细胞质中通过糖酵解生成丙酮酸, 丙酮酸在有氧存在的条件下进入线粒体基质, 经过三羧酸循环和线粒体呼吸链氧化磷酸化过程最终生成ATP和水^[14]。ATP作为线粒体呼吸链氧化磷酸化过程最重要的产物, 常被用于评价呼吸链的运转速率。PC12细胞中ATP含量的升高暗示着TBBPA-BHEE暴露加快了线粒体呼吸链氧化磷酸化。图 4c中对照组、1 h暴露组、3 h暴露组、6 h暴露组中PC12细胞胞内ADP的浓度分别为2.3×10^-16、2.5×10^-16、2.8×10^-16、3.0×10^-16 mol/cell; 相应的ADP与ATP的浓度比值分别为9.1×10^-2、9.5×10^-2、8.8×10^-2、8.2×10^-2(见图 5a)。ATP合成酶利用电子传递产生的能量将ADP磷酸化为高能ATP, ATP中远离腺苷的高能磷酸键又可以水解释放能量, 同时生成ADP^[14]。ADP作为合成ATP的原料及ATP水解的直接产物, 其浓度及与ATP浓度的比值(ADP/ATP)可作为评价线粒体呼吸链氧化磷酸化速率的辅助参数。暴露于TBBPA-BHEE后, PC12细胞中ADP的浓度上升反映了细胞ATP代谢加速。而ADP/ATP整体上随暴露时间的延长而降低, 即ATP含量相对于ADP不断升高, 进一步暗示了ATP合成增加, 即线粒体呼吸链氧化磷酸化过程的加速进行。综上所述, TBBPA-BHEE暴露刺激了PC12细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化。线粒体呼吸链氧化磷酸化加速进行可能导致QH·的生成速率上升, 超氧化物自由基浓度升高, 过量生成的ROS最终导致细胞的氧化应激和凋亡。

图 4

Fig. 4

图 4 PC12细胞中(a) ATP、(b) ADP、(c) AMP、(d) cAMP浓度随TBBPA-BHEE (25 μmol/L)暴露时间的变化(n=3) Fig. 4 Time courses for (a) ATP, (b) ADP, (c) AMP and (d) cAMP concentrations in PC12 cells treated with TBBPA-BHEE (25 μmol/L) (n=3)

图 5

Fig. 5

图 5 PC12细胞中(a) ADP/ATP、(b) AMP/ATP和(c) cAMP/ATP的浓度比值随TBBPA-BHEE (25 μmol/L)暴露时间的变化(n=3) Fig. 5 Time courses for concentration ratios of (a) ADP/ATP, (b) AMP/ATP and (c) cAMP/ATP in PC12 cells treated with TBBPA-BHEE (25 μmol/L) (n=3)

2.3 TBBPA-BHEE干扰PC12线粒体功能导致细胞能量代谢稳态破坏

为探究TBBPA-BHEE对PC12细胞能量代谢过程的影响, 本研究利用HPLC-ESI-MS/MS对TBBPA-BHEE (25 μmol/L)暴露后PC12细胞内AMP、ATP及cAMP浓度变化进行了测定。如图 5b所示, 对照组、1 h暴露组、3 h暴露组、6 h暴露组中PC12胞内AMP/ATP分别为2.8×10^-3、3.3×10^-3、2.7×10^-3、1.9×10^-3。AMP/ATP总体上随暴露时间的延长而降低。AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是细胞能量稳态调节的关键分子, 该激酶响应细胞内ATP耗竭的压力而激活。当细胞内ATP浓度下降或AMP/ATP上升时, AMPK将被激活^[23]。活化的AMPK促进细胞对葡萄糖的吸收, 刺激脂肪酸氧化和糖酵解作用, 并抑制糖异生及糖原、脂质、蛋白质的合成^{[24, 25]}。TBBPA-BHEE暴露导致PC12细胞内ATP浓度上升, AMP/ATP下降, 这一上游信号抑制了AMPK的活化, 减缓了PC12细胞对葡萄糖的吸收, 抑制了糖酵解过程, 同时加速细胞内葡萄糖合成糖原。一方面, TBBPA-BHEE促进了线粒体呼吸链氧化磷酸化过程使得葡萄糖的消耗量增加; 另一方面, TBBPA-BHEE对AMPK的抑制降低了细胞对葡萄糖的摄取, 促使游离的葡萄糖合成不能被直接利用的糖原, 这将导致细胞内糖代谢平衡破坏, 能量代谢稳态破坏。此外, 图 4d中对照组、1 h暴露组、3 h暴露组、6 h暴露组中PC12细胞内cAMP的浓度分别为7.1×10^-19、5.4×10^-19、4.7×10^-19、7.8×10^-19 mol/cell。TBBPA-BHEE暴露组细胞cAMP浓度与对照组相比呈下降趋势。除AMPK外, 蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)信号通路也是细胞内调节能量代谢、决定细胞命运的关键通路。PKA又被称为cAMP依赖的蛋白激酶。cAMP由腺苷酸环化酶水解细胞质中的ATP产生, 并作为第二信使激活蛋白激酶A^[14]。在细胞质中, 活化的PKA通过将特定底物的丝、苏氨酸残基磷酸化达到促进糖原分解为葡萄糖的效果; 在细胞核中, 活化的PKA通过磷酸化特定的转录因子对cAMP的作用进行应答^[14]。TBBPA-BHEE暴露降低了PC12细胞中cAMP的浓度, 抑制了PKA的活性, 导致糖原分解减少, 游离葡萄糖减少, 能量代谢稳态破坏。综上所述, TBBPA-BHEE干扰了PC12线粒体正常功能并对能量代谢产生干扰。PC12细胞能量代谢的崩溃最终会导致细胞凋亡。

如图 6所示, 暴露于TBBPA-BHEE (25 μmol/L, 24 h)后, PC12细胞形态改变, 细胞大量死亡。TBBPA-BHEE加速PC12细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化过程, 线粒体功能紊乱导致胞内生成过量ROS, 细胞能量代谢平衡破坏, 最终导致细胞凋亡。

图 6

Fig. 6

图 6 PC12细胞经TBBPA-BHEE处理24 h后的形态学比较 Fig. 6 Morphological changes in PC12 cells treated by TBBPA-BHEE for 24 h a: vehicle control (0.5% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO)); b. 25 μmol/L TBBPA-BHEE.

3 结论

本研究基于HPLC-ESI-MS/MS的分析, 发现TBBPA-BHEE可加速PC12线粒体呼吸链氧化磷酸化过程; TBBPA-BHEE暴露干扰PC12线粒体功能, 引起细胞能量代谢稳态破坏。以上研究结果证明了四溴双酚A衍生物对细胞线粒体的干扰效应, 为新型溴代阻燃剂的使用和管理提供了毒理学数据支持。在细胞生物标志物的分析方面, HPLC-ESI-MS/MS与传统的化学发光法相比具有诸多优势, 有望成为研究细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化及能量代谢过程的有力工具。鉴于细胞内cAMP含量较低, 在后续研究中仍需优化方法以提高该物质的检测灵敏度。

参考文献

[1]	Covaci A, Voorspoels S, Abdallah M A-E, et al. J Chromatogr A, 2009, 1216 : 346. Doi: 10.1016/j.chroma.2008.08.035
[2]	Liu A F, Qu G B, Zhang C L, et al. J Chromatogr A, 2015, 1377 : 92. Doi: 10.1016/j.chroma.2014.12.038
[3]	Tian Y, Liu A F, Qu G B, et al. RSC Adv, 2015, 5 (23): 17474. Doi: 10.1039/C4RA16166A
[4]	Tian Y, Chen J, Ouyang Y Z, et al. Anal Chim Acta, 2014, 814 : 49. Doi: 10.1016/j.aca.2014.01.035
[5]	Qu G B, Liu A F, Thanh W, et al. Environ Sci Technol, 2013, 47 (9): 4760. Doi: 10.1021/es3049916
[6]	Letcher R J, Chu S. Environ Sci Technol, 2010, 44 (22): 8615. Doi: 10.1021/es102135n
[7]	Birnbaum L S, Staskal D F. Environ Health Perspect, 2004, 112 (1): 9.
[8]	Ding J, Zhang S H, Liu J N, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32 (5): 529. 丁洁, 张圣虎, 刘济宁, 等. 色谱, 2014, 32 (5) : 529. Doi: 10.3724/SP.J.1123.2013.12043
[9]	Kou L J, Liang R N. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32 (8): 817. 寇立娟, 梁荣宁. 色谱, 2014, 32 (8) : 817. Doi: 10.3724/SP.J.1123.2014.03045
[10]	Liu Q, Ren X M, Long Y M, et al. Chemosphere, 2016, 154 : 194. Doi: 10.1016/j.chemosphere.2016.03.117
[11]	Brookes P S, Yoon Y, Robotham J L, et al. Am J Physiol Cell Physiol, 2004, 287 (4): C817. Doi: 10.1152/ajpcell.00139.2004
[12]	Muller F L, Roberts A G, Bowman M K, et al. Biochemistry, 2003, 42 (21): 6493. Doi: 10.1021/bi0342160
[13]	St-Pierre J, Buckingham J A, Roebuck S J, et al. J Biol Chem, 2002, 277 (47): 44784. Doi: 10.1074/jbc.M207217200
[14]	Wang J F, Cell Biology[M]. Beijing: Science Press, 2003 王金发. 细胞生物学[M]. 北京: 科学出版社, 2003
[15]	Zhou J.[PhD Dissertation]. Shanghai: The Second Military Medical University, 2013 周洁.[博士学位论文].上海:第二军医大学, 2013
[16]	Saling S C, Comar J F, Mito M S, et al. Toxicol Appl Pharmacol, 2011, 257 (3): 319. Doi: 10.1016/j.taap.2011.09.004
[17]	Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C. Int J Mol Sci, 2016, 17 (6): 852. Doi: 10.3390/ijms17060852
[18]	Kumaresan R, Sankaranarayanan T K, Madhavendra S S. Ind J Sci Technol, 2008, 1 : 4.
[19]	Wang J, Lin T, Lai J, et al. J Chromatogr B, 2009, 877 (22): 2019. Doi: 10.1016/j.jchromb.2009.05.027
[20]	Ren Y P, Zhang J S, Song X D, et al. J Chromatogr Sci, 2011, 49 : 332. Doi: 10.1093/chrsci/49.4.332
[21]	Jiang Y, Sun C, Ding X, et al. J Pharm Biomed Anal, 2012, 66 : 258. Doi: 10.1016/j.jpba.2012.03.027
[22]	Goutier W, Spaans P A, van der Neut M A, et al. J Neurosci Methods, 2010, 188 (1): 24. Doi: 10.1016/j.jneumeth.2010.01.027
[23]	Witters L A, Kemp B E, Means A R. Trends Biochem Sci, 2006, 31 (1): 13. Doi: 10.1016/j.tibs.2005.11.009
[24]	Towler M C, Hardie D G. Circ Res, 2007, 100 (3): 328. Doi: 10.1161/01.RES.0000256090.42690.05
[25]	Hardie D G. FEBS Lett, 2008, 582 (1): 81. Doi: 10.1016/j.febslet.2007.11.018