正辛醇/水分配系数(K_ow)是表征物质疏水性的重要参数,log K_ow常用于研究药物在生物体内的吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADMET),在药物设计、环境污染物毒性和定量结构-活性关系(QSAR)的研究中具有重要作用^{[1, 2]}。现有log K_ow的获取途径主要有理论计算法^[3]和实验测定法^[4-6]。理论计算法更加方便,但准确度较低,随着化合物复杂性的增加,其可靠性逐渐降低,所以在条件允许的情况下应尽量采用实验测定法。经济合作与发展组织(OECD)推荐了3种经典的log K_ow实验测定方法:摇瓶法(SFM)^[4]、慢搅法(SSM)^[5]和反相高效液相色谱(RP-HPLC)法^[6]。SFM和SSM属于直接测定法,这类方法耗时长,样品用量大且对样品纯度要求高,只适于测定-2＜log K_ow＜4的物质,存在一定的局限性;RP-HPLC法属于间接测定法,因其分析时间短、通量大、实验所需样品量少、对样品纯度要求不高而引起了广泛关注。近年来,科研工作者通过建立化合物等度洗脱的保留因子(k)与log K_ow间的关系,对经典RP-HPLC法进行了理论发展和实验方法改良^[7],节约了实验时间并提高了准确度。

一些课题组开发了多种梯度洗脱测定log K_ow的方法^[8-12],但这些方法的准确度较低,且与等度洗脱法间缺乏系统的比较。等度洗脱法的研究目前主要围绕实验中流动相的选择和新型固定相的应用。流动相方面:在测定离解化合物时,高氯酸、乙酸、氨水等简单酸/碱化合物可代替缓冲盐作为离子抑制剂,大部分基于简单酸/碱化合物的流动相与质谱检测仪兼容,使无紫外吸收化合物的log K_ow的测定成为可能^[13-16];由于硅胶基质色谱柱上残留的硅羟基会影响离解化合物，尤其是碱性离解化合物的保留行为,因此将三乙胺、正癸胺、正辛醇等物质作为硅羟基“掩蔽剂”加入流动相中,“掩蔽剂”的加入对离解化合物的log K_ow的测定有一定改善^[17]。固定相方面:一些不含硅羟基的新型聚合物色谱柱用来测定离解化合物的log K_ow^[7];一些烷基上嵌有氨基(-NH₂)和苯基(-Ph)的非单纯烷基键合相色谱柱也可用来预测log K_ow,这类色谱柱由于存在π-π、氢键等非疏水作用力,预测log K_ow时往往需要在保留模型中引入修正项以改善模型的相关性,而修正项的加入又会带来新的误差^[18]。

将胆固醇基(cholesteryl)与硅胶进行化学结合(见图 1)，制备具有高性能的反相Cholester色谱固定相，其主要作用力及使用的流动相和C₁₈柱相同,但因胆固醇基存在立体刚性结构而与C₁₈柱的保留行为不同。Cholester柱已成功用于番茄红素^[19]和类固醇激素^[20]等具有立体结构的化合物的分离。但目前关于Cholester柱保留行为的研究很少，有文献^[21]指出,用Cholester柱可以直接建立任意有机调节剂比例(φ)下log K_ow-log k_φ的关系来预测log K_ow,从而节约实验时间,但未给出log K_ow-log k_φ和log K_ow-log k_w关系的比较。目前只有硅胶基质的商品化Cholester柱,其pH适用范围为2～8,不适于碱性化合物的分析。Janicka等^[22]用Cholester柱测定log K_ow时选择乙腈为有机调节剂,建立log k-φ线性模型来获取log k_w,但其仅测定了φ在0.40～0.60范围内的log k,并不能反映全乙腈比例范围下log k-φ的真实趋势。本实验分别以甲醇和乙腈为有机调节剂,磷酸缓冲盐为离子抑制剂,系统地研究了采用胆固醇基键合相-RP-HPLC法时,29种中性化合物和28种弱酸性化合物的保留行为,并比较了log K_ow-log k_φ和log K_ow-log k_w的线性关系。

图 1

Fig. 1

图 1 胆固醇键合相的化学结构 Fig. 1 Chemical structure of cholesteryl-bonded phase

1 理论部分

RP-HPLC法利用色谱系统模拟正辛醇/水分配体系,求得化合物的log K_ow值^[7]:

$log{\rm{ }}{K_{ow}} = \alpha \log k + b$

(1)

其中,a和b为拟合系数。此方程称为Collander方程,是RP-HPLC法测定化合物K_ow的基础。研究表明,通过线性溶剂强度模型^[23]外推得到100%水相中k的对数值(log k_w)与log K_ow有更好的相关性^[7]:

$\log k = \log {k_w} + - {S_\varphi }$

(2)

$log{\rm{ }}{K_{ow}} = m\log {k_w} + n$

(3)

其中,S、m和n为拟合系数。建立方程(2)通常需要测定化合物在4个以上不同φ下的等度保留时间(t_R)。在测定酸/碱化合物的log K_ow时,需加入离子抑制剂使物质保持中性状态,或利用流动相pH和物质的pK_a修正log K_ow为表观正辛醇/水分配系数(log K_ow″)。log K_ow″考虑了物质的离解状态对疏水性的贡献。由于强酸碱化合物难以通过控制pH而抑制其离解,疏水性低、保留弱的离子态强酸/碱化合物的log K_ow″很难由实验测定。Zou等^[24]提出用离子对反相液相色谱(IP-RPLC)法测定磺酸类化合物的log K_ow″,但其所用log K_ow″值来自计算法。磺酸化合物的log K_ow″很难通过实验获得,因此实验测定log K_ow的研究对象仍为中性和弱酸/碱性化合物。

表 1 (Table 1)

表 1 实验所用化合物的log Kow、pKa和log Kow″值 Table 1 log Kow,pKa and log Kow″ values of investigated compounds Neutral compound Acidic compound No. Compound log Kow pKa log Kow″ No. Compound log Kow pH 2.50 pH 4.00 Model compound (Training set) N1 p-benzoquinone 0.20 A1 1,4-benzenediol 0.59 10.33 0.59 0.59 N2 benzyl alcohol 1.10 A2 1,3-benzenediol 0.80 9.27 0.80 0.80 N3 benzaldehyde 1.47 A3 1,2-benzenediol 0.88 12.08 0.88 0.88 N4 anisole 2.11 A4 4-hydroxybenzaldehyde 1.35 7.66 1.35 1.35 N5 benzene 2.13 A5 phenylacetic acid 1.41 4.31 1.40 1.24 N6 benzyl chloride 2.30 A6 benzoic acid 1.87 4.20 1.86 1.66 N7 benzhydrol 2.67 A7 2-methylphenol 1.95 10.28 1.95 1.95 N8 chlorobenzene 2.89 A8 3-methylphenol 1.96 10.09 1.96 1.96 N9 bromobenzene 2.99 A9 2-chlorobenzoic acid 2.05 2.94 1.92 0.95 N10 1,2-dimethylbenzene 3.12 A10 2-chlorophenol 2.15 8.35 2.15 2.15 N11 1,4-dimethylbenzene 3.15 A11 2-bromobenzoic acid 2.20 2.85 2.04 1.02 N12 ethylbenzene 3.15 A12 4-bromophenylacetic acid 2.31 4.19 2.30 2.09 N13 1,3-dimethylbenzene 3.20 A13 3-methylbenzoic acid 2.37 4.27 2.36 2.18 N14 naphthalene 3.30 A14 4-bromophenol 2.59 9.31 2.59 2.59 N15 2-chlorotoluene 3.42 A15 4-chlorobenzoic acid 2.65 3.98 2.64 2.34 N16 1,3-dichlorobenzene 3.53 A16 2,4-dibromophenol 3.06 7.85 3.06 3.06 N17 2-methylnaphthalene 3.86 A17 2-naphthoic acid 3.28 4.17 3.27 3.05 N18 biphenyl 4.01 A18 2,6-dibromophenol 3.36 6.80 3.36 3.36 N19 fluorene 4.18 A19 4-isopropylbenzoic acid 3.40 4.36 3.39 3.24 N20 1,3,5-trichlorobenzene 4.19 A20 2,4,6-trichlorophenol 3.69 6.21 3.69 3.69 N21 diphenyl oxide 4.21 A21 pentachlorophenol 4.69 5.12 4.69 4.66 N22 anthracene 4.45 N23 1,3,5-tribromobenzene 4.51 N24 hexamethylbenzene 4.61 N25 hexabromobenzene 6.80 Verification compound (Validation set) N26 toluene 2.73 A22 phenol 1.46 9.80 1.46 1.46 N27 pentachlorobenzene 5.18 A23 3-bromobenzoic acid 2.87 3.81 2.85 2.46 Sample compound (Determination set) N28 1-naphthylacetonitrile NA A24 2-methylphenylacetic acid NA 4.35 / / N29 2,3,4,5,6-pentabromotoluene NA A25 2-chlorophenylacetic acid NA 4.07 / / A26 1-naphthalene acetic acid NA 4.24 / / A27 3,5-dimethylbenzoic acid NA 4.30 / / A28 2,4,6-tribromophenol NA 5.95 / / log Kow and pKa values were literature values obtained from the database module of ACD/Labs software; log Kow″ values were calculated with log Kow and pKa ; NA: no literature log Kow value available; /: not applicable.

表 1 实验所用化合物的log Kow、pKa和log Kow″值 Table 1 log Kow,pKa and log Kow″ values of investigated compounds

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

Alliance 2695高效液相色谱仪,配有真空脱气机、数码四元泵和120位自动进样器、996紫外-可见二极管阵列(PDA)检测器(美国Waters公司); SevenMulti型pH/电导率/离子综合测试仪,配有Mettler Toledo Inlab^®413 pH电极、参比溶液为pH 2.00和pH 7.01的缓冲溶液(瑞士Mettler-Toledo公司)。流动相pH值为加入有机调节剂前水相缓冲液的pH值。

甲醇和乙腈(HPLC级,美国Honeywell公司);磷酸(纯度≥85.0%,国药集团化学试剂有限公司);磷酸二氢钾(KH₂PO₄，纯度≥99.5%,南京化学试剂有限公司)。实验用水均为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团)。实验所用29种中性化合物(苯系物)和28种酸性化合物(苯甲酸、苯酚类)的具体信息见表 1，其纯度均大于98%,分别购自美国AccuStandard公司、美国Acros公司、美国Sigma-Aldrich公司、日本TCI公司、国药集团化学试剂有限公司和北京百灵威公司,用甲醇分别配制质量浓度为1 g/L的标准工作溶液,于4 ℃冰箱中储存,待用。实验中,将目标分析物分为3组:模型化合物组(training set)、验证化合物组(validation set)及待测化合物组(determination set)。

2.2 色谱条件

色谱柱:Cosmosil Cholester柱(150 mm×2.0 mm,5 μm,日本Nacalai Tesque公司);柱温:30 ℃;等度洗脱;流速:0.2 mL/min;进样体积:1 μL;进样浓度:50 mg/L。流动相:①甲醇-水;②甲醇-20 mmol/LKH₂PO₄缓冲液(以下简称缓冲液A,pH 2.5); ③甲醇-缓冲液A(pH 4.0); ④乙腈-水;⑤乙腈-缓冲液A(pH 2.5); ⑥乙腈-缓冲液A(pH 4.0)。水相为100%水时测定中性化合物;水相为缓冲液A时测定酸性化合物。检测波长为各物质的最大吸收波长,所有样品的t_R均为至少3次独立进样的平均值。

图 2

Fig. 2

图 2 化合物在(a)甲醇和(b)乙腈为有机调节剂时的log k-φ关系(pH 2.5) Fig. 2 Relationships between log k and φ of compounds with (a) methanol and (b) acetonitrile as organic modifiers (pH 2.5)

2.3 实验方法

在不同流动相条件下,根据样品的疏水性,每个样品至少在4个不同φ(0.95～0.05,每隔0.05取一个比例)下测定t_R。t_R使用双点校正法(DP-RTC)^[25]进行校正。保留因子按公式k=(t_R-t₀)/t₀计算,其中t₀为死时间,用尿嘧啶测定。建立各物质的log k-φ关系,并外推至100%水相，得到log k_w。

采用Origin 9.0 (美国Origin Lab公司)对拟合模型进行统计分析。

3 结果与讨论

3.1 建立log k-φ模型外推log k_w

建立log k-φ模型外推log k_w是经典RP-HPLC法测定log K_ow的基础。目前鲜有文献报道采用Cholester柱时化合物log k-φ的关系,因此需大量实验获取数据点，以推断log k-φ关系。甲醇和乙腈为有机调节剂时,6种不同疏水性的中性和弱酸性化合物的log k-φ关系见图 2,其中弱酸性化合物为pH 2.5条件下的数据。甲醇为有机调节剂时,log k-φ在较宽的φ范围(0.05～0.95)内线性关系良好;当乙腈为有机调节剂时,log k-φ在较宽φ范围内呈曲线关系。Shoenmakers提出一种描述log k-φ关系的非线性模型^[26]：

$\log k = A\varphi + B{\varphi ^2} + E\sqrt \varphi + \log {k_w}$

(4)

其中,A、B和E为拟合系数,log k_w为截距,Bφ²和Eφ分别为高有机相和高水相时的曲率。方程(4)可以较好地描述乙腈为有机调节剂时化合物log k-φ的关系。各化合物在不同流动相条件下的log k-φ拟合相关系数和log k_w值见表S1和表S2(详见http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/1609002-SI.pdf)。当甲醇为有机调节剂时,常用色谱柱上获取的log k-φ模型一般在0＜log k＜1范围内线性最好^[27],而由图 2可知,Cholester柱上log k-φ线性关系在-0.5＜log k＜1.5范围内成立。实际实验中,当log k＜-0.5时,t_R与t₀的差距较小(0.5 min);当log k＞1.5时,t_R＞60 min,这两种情况下较难获得准确可靠的t_R。因此在使用Cholester柱时,若流动相为甲醇,可用log k-φ线性关系预测化合物在不同φ条件下的t_R。

由图 2可知,同一个化合物在甲醇和乙腈两种有机调节剂下外推获得的log k_w存在较大差异。理论上,100%水相条件的log k_w与有机调节剂无关,两种有机相体系外推log k_w值的不同主要来自于拟合模型的不同。在100%水相条件下,样品的t_R较长且不稳定,因此log k_w无法通过实验获得。

图 4

Fig. 4

图 4 中性化合物和酸性化合物在甲醇或乙腈体系中的log Kow (log Kow″)-log kφ关系 Fig. 4 Relationships of log Kow (log Kow″)-log kφ for neutral compounds and acidic compounds with methanol or acetonitrile as organic modifier MeOH: methanol; ACN: acetonitrile.

甲醇为有机调节剂时,化合物的log k-φ存在良好的线性关系,根据方程(2)预测的log k_w可能更接近实际值;乙腈为有机调节剂时,log k-φ若用方程(2)进行直线拟合,得到的log k_w小于实际值,用方程(4)进行非线性拟合时,相关性得到较大提高,但获得的log k_w却大于实际值。进一步考察了乙腈条件下的log k-φ非线性模型,以苯甲醇(N2)为例,分别用3种乙腈范围(0.05～0.95,0.40～0.95和0.05～0.40)的数据建立log k-φ非线性模型(见图 3),得到的结果并不相同。用高比例(0.40～0.95)/低比例(0.05～0.40)条件下得到的非线性模型预测低/高比例的log k均与实验值有差距。因此,在使用Cholester柱时,不适合用非线性模型预测log k_w。

图 3

Fig. 3

图 3 苯甲醇在不同乙腈范围的log k-φ非线性模型 Fig. 3 Nonlinear models of log k-φ from different acetonitrile ranges for benzyl alcohol a. 0.05-0.95; b. 0.40-0.95; c. 0.05-0.40; nonlinear models were fitted with black spots.

3.2 log K_ow(log K_ow″)-log k_φ模型的建立

根据以下公式计算酸性化合物的log K_ow″:

$log{K_{ow}} = log{K_{ow}} - log{\rm{ }}\left( {1 + {{10}^{pH - p{K_a}}}} \right)$

(5)

部分log K_ow(log K_ow″)-log k_φ的线性关系见图 4。不同流动相下中性和酸性化合物的log K_ow(log K_ow″)-log k_φ关系见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 不同流动相条件下中性和酸性化合物log Kow (log Kow″)-log kφ的线性关系 Table 2 Relationships between log Kow (log Kow″) and log kφ of neutral and acidic compounds with different mobile phases Training set Mobile phases log Kow(log Kow″)-log Kφ log Kφ N Intercept Slope Adj. R2 SD F Value S.E. Value S.E. Neutral compound methanol-water log K0.8 25 2.78 0.07 2.26 0.11 0.9456 0.31 418.32 log K0.7 24 2.08 0.08 2 0.1 0.9406 0.28 365.05 log K0.6 21 1.49 0.08 1.89 0.09 0.9554 0.22 429.73 log K0.5 16 1.05 0.1 1.63 0.09 0.9555 0.2 323.38 log Kw 25 -0.22 0.11 1.08 0.03 0.9798 0.19 1162.82 acetonitrile-water log K0.8 25 3.51 0.07 2.96 0.15 0.9383 0.33 365.8 log K0.7 25 2.83 0.07 2.79 0.14 0.9443 0.31 408.2 log K0.6 24 2.22 0.08 2.56 0.14 0.9344 0.29 328.54 log K0.6 24 1.67 0.09 2.27 0.11 0.9479 0.26 419.25 log Kw* 25 -0.56 0.17 1.76 0.07 0.9598 0.27 573.24 log Kw# 25 1.26 0.15 0.25 0.02 0.9074 0.4 236.23 Acidic compound methanol-20 mmol/L log K0.6 21 2.05 0.05 1.56 0.08 0.9548 0.22 423.14 KH2PO4(pH 2.5) log K0.5 20 1.61 0.05 1.48 0.07 0.955 0.19 404.23 log K0.4 20 1.25 0.05 1.33 0.06 0.9684 0.16 582.45 log K0.3 18 0.95 0.06 1.21 0.06 0.9613 0.16 423.14 log Kw 21 0.36 0.07 0.94 0.03 0.9792 0.15 943.84 methanol-20 mmol/L log K0.6 21 2.09 0.07 1.72 0.11 0.9189 0.31 227.72 KH2PO4(pH 4.0) log K0.5 20 1.63 0.07 1.63 0.11 0.9154 0.27 206.47 log K0.4 20 1.21 0.07 1.47 0.09 0.9315 0.25 259.36 log K0.3 19 0.88 0.09 1.33 0.08 0.9343 0.24 257.12 log Kw 21 0.3 0.07 0.95 0.03 0.9793 0.16 948.4 acetonitrile-20 mmol/L log K0.6 21 2.99 0.07 2.57 0.15 0.9338 0.27 283.16 KH2PO4(pH 2.5) log K0.5 21 2.42 0.06 2.28 0.13 0.94 0.25 314.5 log K0.4 21 1.87 0.05 1.98 0.1 0.9503 0.23 383.27 log K0.3 20 1.39 0.06 1.73 0.09 0.9527 0.19 383.86 log Kw* 21 0.19 0.12 1.45 0.08 0.9458 0.24 349.79 log Kw# 21 0.65 0.18 0.51 0.05 0.8437 0.41 108.99 acetonitrile-20 mmol/L log K0.6 21 2.99 0.07 2.68 0.14 0.9499 0.24 379.92 KH2PO4(pH 4.0) log K0.5 21 2.4 0.05 2.34 0.11 0.9563 0.23 438.21 log K0.4 21 1.83 0.05 2.05 0.09 0.9606 0.22 488.46 log K0.3 21 1.36 0.05 1.75 0.08 0.9615 0.18 475.6 log Kw* 21 0.21 0.11 1.46 0.07 0.9504 0.24 384.48 log Kw# 21 1.03 0.2 0.36 0.05 0.7024 0.59 48.21 Neutral and acidic compound methanol-20 mmol/L KH2PO4(pH 2.5) log Kw 46 0.18 0.07 0.99 0.02 0.9726 0.21 1595.15 methanol-20 mmol/L KH2PO4(pH 4.0) log Kw 46 0.15 0.07 0.99 0.02 0.9759 0.21 1825.36 * log Kw obtained from equation (2); # log Kw obtained from equation (4); N: the number of compounds investigated; S.E.: the standard error; adj. R2: the adjusted squared correlation coefficient; SD: standard deviation; F: the Fisher’s test value.

表 2 不同流动相条件下中性和酸性化合物log Kow (log Kow″)-log kφ的线性关系 Table 2 Relationships between log Kow (log Kow″) and log kφ of neutral and acidic compounds with different mobile phases

当甲醇为有机调节剂时,中性化合物和酸性化合物外推所得的log k_w与log K_ow(log K_ow″)建立的log K_ow(log K_ow″)-log k_w线性关系良好(R²约为0.98),而在任意甲醇比例下建立的log K_ow(log K_ow″)-log k_φ线性关系均不如log K_ow(log K_ow″)-log k_w。在pH 4.0时,部分酸性化合物建立的log K_ow(log K_ow″)-log k_φ中的R²为0.91～0.93。对中性化合物及pH 2.5条件下离解已基本被抑制的弱酸性化合物,log K_ow(log K_ow″)-log k_φ线性关系尚可(R²＞0.94)。疏水性不同的物质适用φ的范围不同,所以只有疏水性差异不大的化合物可以建立某一甲醇比例下的log K_ow(log K_ow″)-log k_φ模型。本课题组曾证明结构类似的中性和酸/碱化合物可以一起作为模型化合物建立log K_ow″-log k_w模型^{[28, 29]}。甲醇条件下中性和酸性混合化合物组的log K_ow″-log k_w线性关系中斜率接近1、截距为常数,与使用C₁₈柱时的结果一致^{[28, 29]}。

当乙腈为有机调节剂时,无论通过线性模型还是非线性模型获取的log k_w,其误差均比甲醇体系大,因而log K_ow(log K_ow″)-log k_w线性关系比甲醇体系差。而在任意乙腈比例下建立的log K_ow(log K_ow″)-log k_φ线性关系总体上优于log K_ow(log K_ow″)-log k_w,因此如果选择乙腈为有机调节剂,则不需外推获取log k_w。

表 3 (Table 3)

表 3 log Kow (log Kow″)-log kφ模型的验证 Table 3 Validation of log Kow (log Kow″) -log kφ models Sample log Kow* log Kow calculated in this work Mobile phases log kφ log Kow Error Toluene 2.73 methanol-water log k0.8 2.75 +0.02 log k0.7 2.73 0 log k0.6 2.71 -0.02 log kw 2.60 -0.13 acetonitrile-water log k0.8 2.83 +0.10 log k0.7 2.81 +0.08 log k0.6 2.80 +0.07 log k0.5 2.79 +0.06 Pentachlorobenzene 5.18 methanol-water log k0.8 5.20 +0.02 log k0.7 5.22 +0.04 log kw 5.23 +0.05 acetonitrile-water log k0.8 5.24 +0.06 log k0.7 5.22 +0.04 log k0.6 5.21 +0.03 log k0.5 5.16 -0.02 Phenol 1.46 methanol-20 mmol/L KH2PO4(pH 2.5) log k0.5 1.62 +0.16 log k0.4 1.57 +0.11 log kw 1.46 0 methanol-20 mmol/L KH2PO4(pH 4.0) log k0.5 1.62 +0.16 log k0.4 1.54 +0.08 log kw 1.40 -0.06 acetonitrile-20 mmol/L KH2PO4(pH 2.5) log k0.5 1.83 +0.37 log k0.4 1.76 +0.30 acetonitrile-20 mmol/L KH2PO4(pH 4.0) log k0.5 1.78 +0.32 log k0.4 1.72 +0.26 3-Bromobenzoic acid 2.87 methanol-20 mmol/L KH2PO4(pH 2.5) log k0.5 2.85 -0.02 log k0.4 2.89 +0.02 log kw 2.87 0 methanol-20 mmol/L KH2PO4(pH 4.0) log k0.5 2.94 +0.07 log k0.4 2.94 +0.07 log kw 2.81 -0.06 acetonitrile-20 mmol/L KH2PO4(pH 2.5) log k0.5 2.59 -0.28 log k0.4 2.60 -0.27 acetonitrile-20 mmol/L KH2PO4(pH 4.0) log k0.5 2.65 -0.22 log k0.4 2.60 -0.27 * log Kow values were literature values obtained from the database module of ACD/Labs software; Error=log Kow calculated in this work-log Kow*.

表 3 log Kow (log Kow″)-log kφ模型的验证 Table 3 Validation of log Kow (log Kow″) -log kφ models

3.3 log K_ow(log K_ow″)-log k_φ模型的验证

为测试3.2节所建立模型的可靠性,分别选择了2种中性化合物(甲苯(N26)、五氯苯(N27))和2种酸性化合物(苯酚(A22)、间溴苯甲酸(A23))进行验证。采用甲醇-水、乙腈-水体系建立的中性化合物log K_ow-log k_φ模型计算N26和N27的log K_ow;采用甲醇/乙腈-缓冲液A(pH 2.5和4.0)为流动相下建立的弱酸性化合物log K_ow″-log k_φ模型计算A22和A23的log K_ow″,根据方程(5)反推得到log K_ow。通过本实验模型得到的log K_ow与文献报道进行比较,结果见表 3。对中性化合物,无论甲醇还是乙腈做有机调节剂,任意比例下建立的log K_ow-log k_φ模型均可得到较为准确的log K_ow,无需外推log k_w;对酸性化合物,利用在甲醇体系中的log K_ow″-log k_φ模型计算得到log K_ow比乙腈体系更准确。

3.4 log K_ow的测定

用甲醇-水流动相体系建立的log K_ow-log k_φ模型测定1-萘乙腈和五溴甲苯的log K_ow,用甲醇-缓冲液A(pH 2.5和4.0)流动相体系建立的log K_ow″-log k_φ模型测定邻甲基苯乙酸、邻氯苯乙酸、1-萘乙酸、3,5-二甲基苯甲酸和2,4,6-三溴酚的log K_ow(见表 4)。本实验得到的log K_ow与计算值接近,但化合物越复杂,计算值的误差越大,如五溴甲苯和2,4,6-三溴酚。

表 4 (Table 4)

表 4 样品化合物log Kow的测定 Table 4 Determination of log Kow for sample compounds Compound log Kow determined in this work log Kow* 1-Naphthylacetonitrile 2.34 2.43±0.20 2,3,4,5,6-Pentabromotoluene 6.54 6.26±0.62 2-Methylphenylacetic acid 2.09 1.80±0.22 2-Chlorophenylacetic acid 2.17 1.98±0.23 1-Naphthalene acetic acid 2.57 2.53±0.21 3,5-Dimethylbenzoic acid 2.91 2.96±0.22 2,4,6-Tribromophenol 4.05 4.40±0.48 * log Kow was calculated by Advanced Chemistry Development (ACD/Labs) Software V11.02 (1994-2012 ACD/Labs).

表 4 样品化合物log Kow的测定 Table 4 Determination of log Kow for sample compounds

表 5 (Table 5)

表 5 不同色谱柱上中性和酸性化合物log Kow (log Kow″)-log kφ线性关系比较 Table 5 Comparison of relationships between log Kow (log Kow″) and log kφ for neutral and acidic compounds on different chromatographic columns Sample Reference Column Mobile phases log Kow (log Kow″) -log kφ log kφ N Intercept Slope Adj. R2 SD F Value S.E. Value S.E. Neutral compound Benzene this Cosmosil Cholester methanol-water log k0.8 25 2.78 0.07 2.26 0.11 0.9456 0.31 418.32 work (150 mm×2.1 mm, log k0.7 24 2.08 0.08 2.00 0.10 0.9406 0.28 365.05 5 μm) log k0.6 21 1.49 0.08 1.89 0.09 0.9554 0.22 429.73 log kw 25 -0.22 0.11 1.08 0.03 0.9798 0.19 1162.82 Benzene [29] Phenomenex Gemini methanol-20 mmol/L log k0.8 12 2.74 0.13 2.69 0.26 0.9045 0.32 105.20 C18 (150 mm× NH4Cl (pH 7.4) log k0.7 11 1.99 0.21 2.32 0.28 0.8715 0.31 68.84 4.6 mm,5 μm) log k0.6 10 1.28 0.26 2.19 0.25 0.8912 0.27 74.70 log kw 12 -0.35 0.22 1.11 0.06 0.9710 0.18 369.30 Benzene [30] Venusil XBP C8 methanol-water log k0.8 37 3.76 0.18 3.98 0.35 0.7835 0.60 131.30 PCBs (150 mm×2.1 mm, log k0.7 36 2.76 0.20 3.09 0.21 0.8595 0.46 215.19 PBDEs 5 μm) log k0.6 29 1.42 0.18 3.04 0.14 0.9474 0.27 504.79 PCDDs log kw 37 0.36 0.11 1.18 0.02 0.9845 0.16 2290.56 Acidic compound Phenol this Cosmosil Cholester methanol-20 mmol/L log k0.6 21 2.05 0.05 1.56 0.08 0.9548 0.22 423.14 work (150 mm×2.1 mm, KH2PO4(pH 2.5) log k0.5 20 1.61 0.05 1.48 0.07 0.9550 0.19 404.23 5 μm) log k0.4 20 1.25 0.05 1.33 0.06 0.9684 0.16 582.45 log k0.3 18 0.95 0.06 1.21 0.06 0.9613 0.16 423.14 log kw 21 0.36 0.07 0.94 0.03 0.9792 0.15 943.84 Benzoic this methanol-20 mmol/L log k0.6 21 2.09 0.07 1.72 0.11 0.9189 0.31 227.72 acid work KH2PO4(pH 4.0) log k0.5 20 1.63 0.07 1.63 0.11 0.9154 0.27 206.47 log k0.4 20 1.21 0.07 1.47 0.09 0.9315 0.25 259.36 log k0.3 19 0.88 0.09 1.33 0.08 0.9343 0.24 257.12 log kw 21 0.30 0.07 0.95 0.03 0.9793 0.16 948.40 Benzoic [17] Venusil XBP C18 methanol-20 mmol/L log k0.7 12 2.96 0.06 1.95 0.15 0.9411 0.11 176.70 acid (150 mm×2.1 mm, KH2PO4(pH 2.8) log k0.6 12 2.33 0.03 1.70 0.11 0.9572 0.10 246.80 5 μm) log k0.5 12 1.81 0.04 1.48 0.08 0.9655 0.09 308.43 log k0.4 12 1.50 0.05 1.25 0.07 0.9702 0.08 358.52 log kw 12 0.65 0.09 0.84 0.04 0.9747 0.08 423.98 methanol-20 mmol/L log k0.7 12 3.02 0.08 1.91 0.15 0.9381 0.14 167.73 KH2PO4(pH 3.6) log k0.6 12 2.39 0.04 1.72 0.11 0.9552 0.12 235.42 log k0.5 12 1.83 0.04 1.51 0.08 0.9663 0.11 316.23 log k0.4 12 1.38 0.05 1.34 0.07 0.9693 0.10 348.03 log kw 12 0.33 0.10 0.94 0.05 0.9710 0.10 369.29 PCBs: polychlorinated biphenyls; PBDEs: polybrominated diphenyl ethers; PCDDs: polychlorinated dibenzodioxins; N,S.E.,adj. R2,SD and F are the same as in Table 2.

表 5 不同色谱柱上中性和酸性化合物log Kow (log Kow″)-log kφ线性关系比较 Table 5 Comparison of relationships between log Kow (log Kow″) and log kφ for neutral and acidic compounds on different chromatographic columns

3.5 Cholester柱、C₁₈柱、C₈柱log K_ow(log K_ow″)-log k_φ模型的对比

OECD标准方法规定，将甲醇作为测定log K_ow的有机调节剂,因此比较本实验甲醇体系中使用Cholester柱和前期工作中使用C₁₈柱和C₈柱时获取的log K_ow(log K_ow″)-log k_φ模型^{[17, 29, 30]}(见表 5)。由表 5可知,在3种色谱柱上,无论是中性化合物还是酸性化合物外推至100%水相的log k_w总是比任意φ下的log k_φ与log K_ow(log K_ow″)的相关性好。使用log k_w预测log K_ow时,Cholester柱和C₁₈柱、C₈柱基本没有区别(R²＞0.97)。 而使用log k_φ预测log K_ow时,Cholester柱与C₁₈柱、C₈柱的结果不同,对中性化合物,Cholester柱获得的log k_φ与log K_ow的相关性明显优于C₁₈柱和C₈柱;对酸性化合物,Cholester柱与C₁₈柱获得的log k_φ与log K_ow″的相关性差距不大,但当酸性化合物存在部分离解时,C₁₈柱的log K_ow″-log k_φ相关性优于Cholester柱。说明化合物与胆固醇基和C₁₈、C₈的作用存在差异,值得后续进一步研究。

4 结论

本文系统地考察了新型Cholester柱用于RP-HPLC法测定log K_ow的可行性。用Cholester柱测定log K_ow时,甲醇比乙腈更适合作为有机调节剂。对中性化合物和中性状态的酸性化合物,可以直接用任意甲醇比例下获取的log k_φ预测log K_ow;而对存在离解的酸性化合物,为获得更加可靠的log K_ow数据,依然推荐用外推方式获取的log k_w预测log K_ow。作为一种新型键合相柱,化合物在Cholester柱上展现出与C₁₈柱不同的保留行为,仍值得后续进一步研究。

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