高效液相色谱-串联质谱法检测红葡萄酒中功效成分


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	冯峰

	程甲

	粟有志

	张峰

	赵丹

冯峰¹ , 程甲² , 粟有志³ , 张峰¹ , 赵丹¹

1. 中国检验检疫科学研究院, 食品安全研究所, 北京 100176;
2. 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心, 上海 200135;
3. 伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心, 新疆伊宁 835000

收稿日期：2016-09-02

基金项目：国家质检总局科技项目（2015IK311）

通讯联系人：张峰,E-mail:fengzhang@126.com

摘要：建立了高效液相色谱-串联质谱法快速测定葡萄酒中白藜芦醇、黄酮类、多酚类功效成分的分析方法。葡萄酒样品直接稀释后进样，用C18柱进行分离，以乙腈-0.1%（体积分数）甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，通过多反应监测（MRM）模式进行检测。13种功效成分在各自线性范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99。除表没食子儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、花旗松素的检出限为1.0、1.0、3.0、3.0 μg/L外，其他9种化合物的检出限均小于1.0 μg/L。回收率为80.9%~112.3%，相对标准偏差小于10%。该方法快速、准确、灵敏度高，适用于葡萄酒中功效成分的快速分析。对实际样品的检测表明，所测葡萄酒样品中均含有儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯/儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇、大豆黄素等功效成分，不同品种葡萄酒中这些功效成分含量差异显著。

关键词：高效液相色谱串联质谱功效成分红葡萄酒

Determination of functional components in red wines by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

FENG Feng¹, CHENG Jia², SU Youzhi³, ZHANG Feng¹, ZHAO Dan¹

1. Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China;
2. Technical Center for Animal Plant and Food of Shanghai Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China;
3. Comprehensive Technical Service Center of Yili Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yining 835000, China

Foundation Item: Science and Technology Project of Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine (AQSIQ) of China (No. 2015IK311)

Abstract: A method for the determination of functional components in red wines by high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry was developed. The wine samples were diluted 10 times directly and separated on a C18 column by gradient elution using acetonitrile-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution as mobile phases. Electrospray ionization was applied and the qualitative and quantitative analyses were operated under multiple reaction monitoring (MRM) mode using positive and negative ion modes simultaniously. The calibration curves of 13 functional components showed good linearities (r>0.99) in their detection ranges. The limits of detection were less than 1.0 μg/L except for epigallocatechin (1.0 μg/L), gallocatechin (1.0 μg/L), catechin gallate (3.0 μg/L) and taxifolin hydrate (3.0 μg/L). The average recoveries ranged from 80.9% to 112.3%. The relative standard deviations were less than 10%. The method is quick, accurate, sensitive and suitable for the quantification of functional components in red wines. When the method was applied to commercial red wine samples, it was found that all selected wine samples contained catechin, epicatechin, epigallocatechin, gallocatechin, epicatechin gallate/catechin gallate, resveratrol, taxifolin hydrate, etc. In addition, the mass concentrations of functional components were significantly different among the red wines made from different species of grape.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) tandem mass spectrometry functional components red wines

葡萄酒是新鲜葡萄或葡萄汁经发酵而成的酒精饮料,随着当前人民生活水平的不断提高,葡萄酒已成为国人普遍关注和经常饮用的食品^{[1, 2]}。近代科学研究^{[3, 4]}表明,葡萄酒中富含白藜芦醇(RES)、黄酮类、多酚类等功效成分,其中白藜芦醇具有保护心血管、抑制肿瘤、抗氧化、消除自由基、预防糖尿病、预防心肌病等功效;黄酮类化合物如儿茶素类衍生物具有抗氧化、抗脂肪肝、抗癌和维生素P样等作用。然而,这些成分在不同品种的葡萄酒及不同年份的葡萄酒中的含量是否有差异,目前仍不清楚。因此发展一种快速、准确、灵敏的方法对葡萄酒中的功效成分进行测定,对正确评价其保健作用及品质、科学饮酒具有重要的意义。

目前针对保健品中功效成分的研究已有一些报道,主要分析方法有分光光度法^[5]、液相色谱法^{[6, 7]}、液相色谱-质谱法等^[8]。季梅等^{[9, 10]}利用液相色谱-质谱法检测地虎杖以及山葡萄根中白藜芦醇的含量。蒋娅兰等^[8]利用高效液相色谱-串联质谱法对银杏保健茶中儿茶素(C)、木犀草素(LUT)、芹菜素(API)等黄酮类功效成分进行了检测。Svoboda等^[11]采用高效液相色谱-串联质谱法对茶叶中儿茶素及其衍生物进行了分析。张凌怡等^[12]使用超高效液相色谱-串联四极杆质谱测定了葡萄中单咖啡酰酒石酸酯等3种酚酸类多酚物质的含量。但对葡萄酒中多类功效成分同时分析的方法目前尚未见报道。本研究建立了一种使用高效液相色谱-串联质谱对葡萄酒中儿茶素、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素(GC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、白藜芦醇、花旗松素(TAX)、芹菜素、褪黑素(MEL)、木犀草素、大豆黄素(DAI)13种功效成分进行测定的方法。该方法快速、准确、无需复杂的前处理,已成功用于市售葡萄酒中功效成分的快速、准确检测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)配备自动进样器、柱温箱;串联API 5000三重四极杆质谱仪(美国Applied Biosystems公司)。ZORBAX Eclipse C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,3.5μm,美国Agilent公司);数据采集由Analyst 1.5.1软件完成(美国Applied Biosystems公司)。

儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸、白藜芦醇、花旗松素、芹菜素、褪黑素、木犀草素、大豆黄素(纯度均大于95%)购于美国Sigma公司。实验室用水由Millipore纯水仪(美国Millipore公司)制备。实测的25份葡萄酒样品购自北京超市。

1.2 标准溶液的配制

精密称取各标准品,用水溶解并定容,配制成1 000 mg/L的标准储备液。准确移取各标准储备液0.5mL,置于100 mL容量瓶中,用水稀释配制成5 mg/L的混合标准工作液。用水逐级稀释,制成质量浓度范围为0.1～1 000 μg/L的系列混合标准溶液。同时将各标准储备液分别取2 μL稀释至2 mL,获得最终质量浓度为1 000 μg/L的各标准溶液,进行质谱条件优化。

1.3 样品处理

准确吸取葡萄酒样品1 mL于10 mL容量瓶中,用水定容,经0.22μm滤膜过滤后直接进样分析。

1.4 色谱-质谱条件

色谱柱:ZORBAX Eclipse C18色谱柱。流动相A为乙腈,流动相B为0.1%(体积分数,下同)甲酸水溶液。流速为0.3mL/min,进样体积为5 μL,柱温为35 ℃。梯度洗脱程序:0～2.0 min,10%B; 2.0～12.0 min,10%B线性增加到90%B; 12.0～14.0 min,90%B。

电喷雾电离源,多反应监测(MRM)模式。所用气体均为高纯氮气,碰撞气(CAD)压力为41.4 kPa,气帘气(CUR)压力为138 kPa,雾化气(GS1)压力为448 kPa,辅助气(GS2)压力为414 kPa,去溶剂温度(TEM)为500 ℃。ESI^-模式下,电喷雾电压(IS)为-4.5 kV,预四极杆Q0入口电压(EP)为-10 V,碰撞室出口电压(CXP)为-22 V; ESI⁺模式下,IS为5.5 kV,Q0 EP为10 V,CXP为22 V。13种功效成分的定性/定量离子对、碰撞电压(CE)及去簇电压(DP)见表 1。

表 1 13种功效成分的最优质谱参数 Table 1 Optimum mass spectrometer parameters for the 13 functional components

2 结果与讨论

2.1 质谱检测条件的优化

为获得各功效成分化合物的最优质谱参数,本研究利用针泵直接进样,分别测定了各标准溶液在ESI⁺和ESI^-模式下的质谱信号强度。结果表明,对于黄酮类化合物(包括儿茶素类、花旗松素、芹菜素、大豆黄素、木犀草素等),由于其结构中既具有碱性O原子,又具有-OH基团,因此在正、负电离模式下,均具有较强的质谱信号。对比其在不同模式下的响应强度,儿茶素、表儿茶素、芹菜素、大豆黄素、木犀草素在正离子模式下的响应强度较强,因此选择ESI⁺电离模式;而表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、花旗松素、儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素在负离子模式下的响应强度较强,因此选择ESI^-电离模式。对于白藜芦醇等多酚类化合物,其在ESI^-电离模式下具有较好的响应强度,可能是其所带的酚羟基具有一定的酸性,H⁺容易离解所致。对于褪黑素等含N化合物,由于其易得到一个质子形成[M+H]⁺准离子分子峰,所以在ESI⁺电离模式下具有较好的响应强度。在各化合物最优的电离模式下,分别对母离子进行碰撞诱导解离,获得二次裂解碎片离子。对各碎片离子进行碰撞能的优化,选择各化合物离子丰度高、干扰小的两对离子进行定性定量分析。优化后的各化合物质谱参数见表 1。

2.2 流动相条件的优化

分别采用乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相对目标分析物的色谱条件进行了优化。结果表明,乙腈-水流动相体系较甲醇-水流动相体系的分离效果好,但部分待测物在甲醇-水和乙腈-水两种流动相中都有一定程度的拖尾;在乙腈-0.1%甲酸水流动相条件下,目标分析物不仅得到了很好的分离,拖尾现象也有明显改善。因此本研究最终采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相对分离条件进行优化。典型分析物表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素在不同色谱条件下的色谱图如图 1所示。

图 1 3种儿茶素类化合物在不同流动相中的色谱图 Fig. 1 Chromatograms of three catechins with different mobile phases a. acetonitrile-water; b. methanol-water; c. acetonitrile-0.1% (v/v) formic acid/water.

对于白藜芦醇和大豆黄素,尽管其保留时间接近(8.57和8.59min),但是二者的定性/定量离子对完全不同;此外,前者是在负离子模式下进行分析,后者是在正离子模式下进行分析,因此二者可以同时进行定量。对于儿茶素和表儿茶素、没食子儿茶素和表没食子儿茶素这2对对映异构体,由于其产物离子谱也基本相同(见图 2),导致无法通过定性/定量离子对对其进行识别,本研究通过优化色谱条件,使其保留时间存在一定的差异,最终通过单标准样品进样确认了各化合物。

图 2 3对儿茶素类对映异构体的产物离子谱 Fig. 2 Product ion mass spectra of three pairs of catechins enantiomers

在优化后的色谱条件下,13种功效成分定量离子对的MRM色谱图见图 3。从中可以看出,儿茶素和表儿茶素(5.42和6.40 min)、没食子儿茶素和表没食子儿茶素(2.51和4.49 min)的保留时间差别较大,可以实现准确定量;但表儿茶素没食子酸酯和儿茶素没食子酸酯保留时间相同(7.47 min),无法实现分离和定量检测。因此,对于表儿茶素没食子酸酯和儿茶素没食子酸酯的方法学考察,使用不同浓度单标准样品分别进样的方式进行测定。对于实际样品的检测,以将表儿茶素没食子酸酯和/或儿茶素没食子酸酯的累加面积代入表儿茶素没食子酸酯的标准曲线的方式进行测定。对于如何进一步优化色谱条件以实现表儿茶素没食子酸酯和儿茶素没食子酸酯的良好分离和准确定量,需要后续进一步的研究。

图 3 13种功效成分的MRM色谱图 Fig. 3 MRM chromatograms of 13 functional components

对实际样品的分析表明,有些功效成分在所有样品中均有检出,此外样品中各组分浓度差异较大。因此在进行添加回收试验时,根据各组分在实际样品中的含量高低,设计了两组添加水平进行考察。对于含量较高且在所有样品中均有检出的功效组分,分别添加100、500和1 000μg/L 3个水平的混合标准样品,其他含量较低或未检出的功效组分分别添加10、50和100 μg/L的混和标准样品。以加标样品测得的质量浓度减去空白基质测得的质量浓度的差除以添加质量浓度来计算回收率。结果表明,在添加范围内,各功效成分的添加回收率为80.9%～112.3%,相对标准偏差(RSD)小于10%。

2.3 方法学考察

在优化后的色谱条件下,考察了13种功效成分在0.1～1 000μg/L质量浓度范围内的线性关系,以信噪比为3时的进样质量浓度定义为检出限。结果见表 2。

表 2 13种功效成分的线性范围、线性方程、相关系数及检出限 Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (r) and limits of detection (LODs) of 13 functional components

2.4 实际样品分析

利用本方法对21种市售葡萄酒样品进行测定,检测结果见表 3。结果表明所有检测的葡萄酒样品中均含有白藜芦醇、大豆黄素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和/或儿茶素没食子酸酯这8种功效成分,部分样品中检出有花旗松素,其余4种功效成分包括芹菜素、木犀草素、褪黑素、表没食子儿茶素没食子酸酯等在葡萄酒中未检出。典型葡萄酒样品的色谱图见图 4。

表 3 实际红葡萄酒样品中9种功效成分的检测结果 Table 3 Detection results of nine functional components in real red wine samples

图 4 典型红葡萄酒样品的总离子色谱图 Fig. 4 Total ion chromatograms of typical red wine sample

有研究^{[13, 14]}表明,葡萄酒中的功效成分组成与葡萄品种有关,且功效成分会随着葡萄发酵过程进行而不断变化。本研究结果也表明,不同品种葡萄酿成的葡萄酒中的功效成分组成及含量差异悬殊。以白黎芦醇的含量为例,样品中最高含量为1 780 μg/L,最低含量仅为99 μg/L,相差约17倍。不同品种的葡萄所酿制红葡萄酒的功效成分分析结果初步表明,蛇龙珠(Cabernet Gernischt,CaG)和混合(多品种混合发酵)葡萄酒的总功效成分含量较高,赤霞珠(Cabernet Sauvignon,CS)和美乐(Merlot)葡萄酒的总功效成分含量较低。美乐葡萄酒的白黎芦醇含量高于赤霞珠葡萄酒。

3 结论

本文建立了一种快速、灵敏检测葡萄酒功效成分的高效液相色谱-串联质谱分析方法。对实际葡萄酒的分析结果表明,葡萄酒中含有包括白藜芦醇、儿茶素及其衍生物等多种功效成分,不同品种葡萄酒中的功效成分含量差异较大。该方法的建立为研究葡萄酒对人体的健康效应提供了技术支撑,也为葡萄酒真伪鉴定研究提供了一种手段。

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