色谱  2017, Vol. 35 Issue (3): 274-279   PDF    
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张宇平
施树云
陈林
陈晓青
张水寒
在线亲和固相萃取-高效液相色谱-二极管阵列检测-四极杆飞行时间质谱快速筛选中药中α-葡萄糖苷酶结合成分
张宇平1 , 施树云1 , 陈林2 , 陈晓青1 , 张水寒2     
1. 中南大学化学化工学院, 湖南 长沙 410083;
2. 湖南省中医药研究院中药研究所, 湖南 长沙 410013
收稿日期：2016-09-09
基金项目：国家自然科学基金项目（21275163）
通讯联系人： 施树云, E-mail:shishuyun@126.com
摘要：中药活性成分的快速分离分析一直是中药研究的重点和热点问题。该文建立了在线亲和固相萃取-高效液相色谱-二极管阵列检测-四极杆飞行时间质谱技术快速筛选中药中与α-葡萄糖苷酶有结合作用的活性成分的方法。四通阀和六通进样阀组成接口界面，收集亲和固相萃取柱中与α-葡萄糖苷酶有结合作用的活性成分，接着进入液相色谱系统进行分析鉴定。阳性对照品（（+）-儿茶素）和阴性对照品（水杨酸）混合物筛选确定了方法的特异性和准确性。接着，以玉竹为研究对象，筛选出9种主要的α-葡萄糖苷酶抑制活性化合物，包括5种苯乙基肉桂酰胺类化合物，4种双氢高异黄酮类化合物。结果表明建立的方法简便、快速、特异性强，可用于任何复杂体系中α-葡萄糖苷酶结合活性成分的筛选。
关键词： 亲和固相萃取     高效液相色谱     α -葡萄糖苷酶     苯乙基肉桂酰胺     双氢高异黄酮     中药    
Rapid screening and identification of α -glucosidase binding compounds in Chinese medicines by online affinity solid-phase extraction-high performance liquid chromatography-diode array detector-quadrupole time-of-flight mass spectrometry
ZHANG Yuping1, SHI Shuyun1, CHEN Lin2, CHEN Xiaoqing1, ZHANG Shuihan2     
1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China;
2. Institute of Chinese Materia Medica, Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410013, China
Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (No. 21275163)
Abstract: Screening and analysis of bioactive compounds from natural products is a challen-ging work due to their complexity. This paper reports the hyphenation of affinity solid-phase extraction column (ASEC) using immobilized α-glucosidase and high performance liquid chromatography-diode array detector-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-DAD-Q-TOF-MS) for screening and identification of α-glucosidase binding compounds from Chinese medicines. Affinity solid-phase extraction (ASE) system was hyphenated with HPLC system via a four-port switching valve and a six-port injection valve as an interface for transferring effluents from ASE column to HPLC. Positive control ((+)-catechin) and negative control (salicylic acid) were performed with the approach to verify its specificity and reproducibility. Subsequently, the developed system was applied to the screening and identification of α-glucosidase inhibitors from Polygonatum odoratum. Five phenethyl cinnamides (N-cis-feruloyloctopamine, N-trans-p-coumaroyloctopamine, N-trans-feruloyloctopamine, N-trans-p-coumaroyltyramine and N-trans-feruloyltyramine) and four homoisoflavanones ((3R)-5, 7-dihydroxyl-3-(2', 4'-dihydroxylbenzyl)-chroman-4-one, (3R)-5, 7-dihydroxyl-6-methyl-3-(4'-hydroxylbenzyl) -chroman-4-one, (3R)-5, 7-dihydroxyl-6-methyl-8-methoxyl-3-(4'-hydroxylbenzyl)-chroman-4-one and (3R)-5, 7-dihydroxyl-6, 8-dimethyl-3-(4'-hydroxylbenzyl)-chroman-4-one) with α-glucosidase inhibitory activities were identified. The results were in accordance with those of ultrafiltration screening. With the online system developed, here we present a feasible, selective and effective strategy for the rapid screening and identification of enzyme inhibitors from complex mixtures.
Key words: affinity solid-phase extraction (ASE)     high performance liquid chromatography (HPLC)     α-glucosidase     phenethyl cinnamide     homoisoflavanone     Chinese medicines    

中药在我国使用历史悠久且疗效显著, 其中活性成分的分离分析是发现和创制新药的重要途径, 是阐明中药作用奥秘的关键, 也是中药质量控制的基础与核心。但是, 中药成分复杂多样, 结构、含量、极性等差异明显, 常用的活性筛选为导向的分离分析模式虽已阐明多种中药活性成分, 但是存在研究周期长、结构不稳定及微量成分易于丢失的风险, 因此建立快速、灵敏筛选中药活性成分的方法意义显著。

大部分药物通过与疾病相关的酶、蛋白质、受体等生物大分子靶标特异性结合以发挥功效。因此, 基于生物亲和作用的中药活性化合物快速靶向筛选研究受到广泛青睐:大分子药物靶标与中药提取物孵育后, 活性成分与靶标特异性结合, 接着采用离心、超滤、平衡透析、微透析、分子排阻色谱等技术将靶标吸附的活性成分与非活性成分进行有效分离, 最后结合液相色谱-质谱技术分析鉴定(非) 活性成分[1-4], 该方法操作简单、流程短、成本低。药靶固定化可以提高其稳定性和重复使用性[5], 因此以磁性Fe3O4[5]、SiO2[6, 7]、芯片[8]等为载体负载药靶制备亲和材料, 通过靶向提取、活性成分解吸附、液相色谱分析等步骤快速、简便、高效地获取中药复杂体系中活性成分的信息。以固定化药靶为色谱填料的生物亲和色谱法进一步简化了操作步骤、提高了方法的稳定性和重现性[6]。为了解决一维生物色谱中峰重叠严重的现象, 将其与C18柱联用建立二维色谱提高峰容量[9, 10]。尽管二维色谱优势明显, 但是第一维和第二维色谱之间分析时间匹配问题、总分析时间长等也是不可忽视的存在。如果将第一维生物色谱缩小为固相萃取模式可解决以上问题, 本课题组[11]前期已成功将亲和固相萃取与液相色谱联用以快速分离分析中药中的环嘌呤氧化酶抑制剂, 该方法简便高效、特异性强、重现性好。

α -葡萄糖苷酶为Ⅱ型糖尿病药物研究比较活跃的靶标。目前, 识别中药复杂体系中α -葡萄糖苷酶抑制剂的方法主要为超过滤法[12, 13]和磁性固相萃取法[14], 而针对α -葡萄糖苷酶的生物亲和色谱法或在线亲和固相萃取法未见文献报道。因此, 本文以玉竹(Polygonatum odoratum) 为研究对象, 建立在线亲和固相萃取-高效液相色谱法方法, 快速分离分析α -葡萄糖苷酶抑制剂。本方法为中药复杂体系中α -葡萄糖苷酶抑制剂的快速筛选提供了新的手段。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

安捷伦1260液相色谱仪(配四元泵、在线脱气机、自动进样器、恒温柱箱和二极管阵列检测器), 6530 Accurate-Mass Q-TOF质谱系统(Agilent, 美国)。

甲醇、乙腈(色谱纯, Merck, 德国); 甲酸(色谱纯, Tedia, 美国); α -葡萄糖苷酶(来源于酵母, 上海卡迈舒生物科技有限公司); 4-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷(pNPG, 纯度98%)、(+)-儿茶素和水杨酸(纯度＞99%) 均购自上海源叶生物科技有限公司; 球形硅胶(5 μ m, 青岛海洋化工集团公司); 3-氨丙基三乙氧基硅烷和戊二醛(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司); 乙醇胺(分析纯, 武汉开元广成化工有限公司); Milli-Q去离子水(Millipore, 美国)。其他试剂均为国产分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司。

磷酸盐缓冲液浓度为0.1 mol/L, pH为6.86;醋酸铵缓冲液浓度为0.01 mol/L, pH为6.86。

玉竹的干燥根茎于2013年10月采自湖南省邵阳市, 由湖南省中医药研究院朱如采研究员鉴定。

1.2 玉竹提取物的制备

180 g粉碎的玉竹根茎, 用1 000 mL 75%(体积分数) 乙醇在85 ℃下回流提取3次, 每次3 h。合并提取液并减压浓缩, 得到10.23 g浸膏。称取10.00 g浸膏混悬于200 mL的热水中, 依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取, 得到石油醚萃取部位0.06 g、乙酸乙酯萃取部位0.28 g和正丁醇萃取部位0.32 g。

1.3 α -葡萄糖苷酶抑制活性测定

量取100 μ L不同浓度的样品、50 μ L 20 U/mL α -葡萄糖苷酶和650 μ L磷酸盐缓冲液, 混合均匀。37 ℃下预孵育10 min, 然后快速加入100 μ L 20 mmol/L pNPG, 再孵育30 min, 加入100 μ L 200 mmol/L碳酸钠终止反应, 于405 nm下测定吸光度。试验重复3次, 求平均值。α -葡萄糖苷酶的抑制率可通过以下公式计算[14]:抑制率=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%, 其中A1和A2是样品试验组和空白组的吸光度, A3和A4是缓冲液试验组和空白组的吸光度。计算抑制率为50%时所需样品的浓度IC50。

1.4 亲和固相萃取柱的制备

制备α -葡萄糖苷酶负载的硅胶材料:称取100 mg干燥的硅胶, 通过超声搅拌将其分散在200 mL乙醇溶液中并转移至500 mL圆底烧瓶中。在900 r/min机械搅拌下滴加2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷后继续反应6 h。反应结束后, 过滤得氨基化的硅胶, 并依次用乙醇和水洗涤3遍, 50 ℃下真空干燥。接着称取50 mg氨基化的硅胶分散于50 mL 5%(质量体积分数) 戊二醛溶液中, 在室温下震荡活化1 h, 获得醛基化硅胶。将过滤得到的醛基化硅胶用磷酸盐缓冲液洗涤3次后, 分散于100 mL 100 U/mL α -葡萄糖苷酶溶液中, 室温下搅拌2 h, 未反应的醛基与50 mL 0.2 mol/L乙醇胺溶液于室温下反应6 h。反应结束后, 过滤得到α -葡萄糖苷酶负载的硅胶, 经过磷酸盐缓冲液洗涤3次后, 用磷酸缓冲液将填料调成合适的浆液, 装入10 mm×4.6 mm不锈钢柱中, 即得亲和固相萃取柱(ASEC)。

1.5 色谱和质谱条件

色谱条件:SunFireTM C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m, Waters, 美国); 菲罗门C18预柱(4.0 mm×3.0 mm, Phenomenex, 美国)。分析(+)-儿茶素和水杨酸混合物时用等度洗脱, 流动相为0.4%(体积分数, 下同) 醋酸水溶液-甲醇(60 : 40, v/v), 流速为0.8 mL/min, 温度为25 ℃, 检测波长为280 nm。分析玉竹提取物时用梯度洗脱, 流动相A为0.4%醋酸水溶液, 流动相B为0.4%醋酸乙腈溶液。洗脱程序为:0~5 min, 5%B; 5~45 min, 5%B~65%B。流速为0.8 mL/min, 温度为25 ℃, 检测波长为290 nm。二极管阵列检测器(diode array detector, DAD) 后连接可调节高压分流器, 进入质谱检测的样品流速为0.2 mL/min。

四极杆飞行时间质谱条件:双喷射离子源; 正离子模式自动调谐; 扫描范围为m/z 100~2 000;干燥气温度为325 ℃, 流速为5.0 L/min; 鞘气温度为400 ℃, 流速为12 L/min; 雾化气压强为379.2 kPa; 毛细管电压为3 500 V; 锥孔电压为65 V; 射频电压为750 V; 毛细管出口电压为130 V; 二级质谱碰撞池能量为25 V。

1.6 在线亲和固相萃取-高效液相色谱体系

在线亲和固相萃取-高效液相色谱体系如图 1所示。聚醚醚酮(PEEK) 管(0.18 mm i.d., Agilent, 美国) 用于连接各仪器和部件。首先四通阀(V1) 和六通进样阀(V2) 均置于图 1a状态, 泵1以0.2 mL/min的流速泵入醋酸铵缓冲液, 平衡ASEC。进样20 μ L后, 与α -葡萄糖苷酶无结合作用的化合物在1.5 min之内流入废液中, 而与α -葡萄糖苷酶有结合作用的化合物停留在ASEC中。接着将V1和V2转至图 1b状态, 泵1以0.2 mL/min的流速泵入甲醇, 快速洗脱与α -葡萄糖苷酶有结合作用的化合物。根据DAD检测信号, 进样环(L1, 300 μ L) 收集与α -葡萄糖苷酶有结合作用的化合物。收集完成后, V1和V2均转回至图 1a状态。此时HPLC-DAD-Q-TOF-MS系统用于分析鉴定与α -葡萄糖苷酶有结合作用的化合物, 而泵1泵入醋酸铵缓冲液以平衡ASEC, 等待下一次进样。在线联用体系中V1和V2巧妙连接, 可以使用一个DAD检测器获得亲和固相萃取柱和C18柱的色谱图。

图 1 在线亲和固相萃取-高效液相色谱体系 Fig. 1 Online affinity solid-phase extraction-HPLC system ASEC: affinity solid-phase extraction column; DAD: diode array detector; L1: loop 1; V1: valve 1; V2: valve 2.
2 结果与讨论
2.1 在线亲和固相萃取-高效液相色谱体系的构建

亲和色谱一般使用缓冲液作为流动相, 活性化合物根据其与靶标结合程度依次被洗脱, 但是结合力相近的化合物存在峰重叠现象[9, 10]。使用较短的ASEC与液相色谱联用可解决此问题。首先考查了α -葡萄糖苷酶在硅胶上的负载量, 使用戊二醛反应2 h后, 负载量达到饱和, 为143 U/mg; 5批次合成产品中α -葡萄糖苷酶负载量的RSD为12.7%, 说明α -葡萄糖苷酶负载的批间重现性较好。本课题组[15]前期的研究表明α -葡萄糖苷酶-活性化合物复合物在甲醇溶液中可以快速解离, 因此试验中选择醋酸铵缓冲液吸附与α -葡萄糖苷酶结合的活性成分, 用甲醇洗脱。考查了固定化α -葡萄糖苷酶在醋酸铵缓冲液和甲醇溶液中交替浸泡1.5 min后的活性, 发现10个周期后固定化α -葡萄糖苷酶催化pNPG转化为对硝基苯酚的量活性仅减少4.8%, 因此使用醋酸铵缓冲液和甲醇洗脱液对固定化α -葡萄糖苷酶的活性影响不大, ASEC可重复使用。

使用水杨酸作为阴性对照测定进样器至V1流路的死时间为0.80 min (流速为0.2 mL/min), 因此与α -葡萄糖苷酶无结合作用的化合物在1.5 min之内可以被洗脱掉。用0.08 g/L阳性对照品(+)-儿茶素和0.2 g/L阴性对照品水杨酸的混合物测定方法的可行性。图 2a为(+)-儿茶素和水杨酸混合对照样品直接进样的色谱图(未经在线ASEC柱), 图 2b为(+)-儿茶素和水杨酸混合对照样品经过在线ASEC后用甲醇洗脱的色谱图, 图 2c为L1收集的与α -葡萄糖苷酶有结合作用的化合物的色谱图(插入的是该化合物的质谱图)。结果表明仅阳性对照(+)-儿茶素能与α -葡萄糖苷酶结合而被检测, 显示出该方法的特异性和准确性。

图 2 0.08 g/L (+)-儿茶素和0.2 g/L水杨酸混合样品(a) 直接进样、(b) 经过ASEC后甲醇洗脱和(c) 与α -葡萄糖苷酶有结合作用的化合物的色谱图(插入该化合物的质谱图) Fig. 2 Chromatograms of (+)-catechin and salicylic acid (a) by direct injection, (b) after ASEC by methanol elution and (c) the compounds binding with α -glucosidase (MS spectrum inserted)
2.2 玉竹中与α -葡萄糖苷酶结合的活性组分快速识别

将粗提物进行分级萃取可以得到不同极性萃取部位。玉竹乙酸乙酯萃取部位α -葡萄糖苷酶抑制活性IC50值为2.59 g/L, 石油醚和正丁醇萃取部位的IC50值均大于5 g/L, 表明乙酸乙酯萃取部位含有潜在的与α -葡萄糖苷酶结合的活性组分。

图 3a为玉竹乙酸乙酯萃取部位(2 g/L) 经过ASEC后的甲醇洗脱色谱图, 图 3b为与α -葡萄糖苷酶有结合作用的化合物的液相色谱图。从图中可以看出, 经过ASEC后可能存在9个化合物与α -葡萄糖苷酶有结合作用。

图 3 玉竹乙酸乙酯萃取部位(a) 经过ASEC后甲醇洗脱和(b) 与α -葡萄糖苷酶有结合作用的化合物的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of etheyl acetate extracting fraction of Polygonatum odoratum (a) after ASEC by methanol elution and (b) the compounds binding with α -glucosidase. Peaks.: 1. N-cis-feruloyloctopamine; 2. N-trans-p-coumaroyloctopamine; 3. N-trans-feruloyloctopamine; 4. N-trans-p-coumaroyltyramine; 5. N-trans-feruloyltyramine; 6. (3R)-5, 7-dihydroxyl-3-(2′, 4′-dihydroxylbenzyl)-chroman-4-one; 7. (3R)-5, 7-dihydroxyl-6-methyl-3-(4′-hydroxylbenzyl)-chroman-4-one; 8. (3R)-5, 7-dihydroxyl-6-methyl-8-methoxyl-3-(4′-hydroxylbenzyl)-chroman-4-one; 9. (3R)-5, 7-dihydroxyl-6, 8-dimethyl-3-(4′-hydroxylbenzyl)-chroman-4-one).

采用HPLC-DAD-Q-TOF-MS联用技术, 得到活性成分的保留时间、DAD谱图、准分子离子峰以及二级质谱碎片峰(见表 1)。本课题组[12]前期基于α -葡萄糖苷酶的超过滤筛选得到的活性成分的HPLC-DAD-MS色谱和质谱数据与在线筛选一致, 表明在线筛选方法的准确性和特异性。9个化合物通过逆流色谱、Sephadex LH-20柱色谱和重结晶等技术分离纯化, 并通过NMR (nuclear magnetic resonance) 得到确证[12, 16], 结果如下:1. N-cis-阿魏酰基去甲辛弗林，2. N-trans-p-香豆酰基去甲辛弗林，3. N-trans-阿魏酰基去甲辛弗林，4. N-trans-p-香豆酰基酪胺，5. N-trans-阿魏酰基酪胺，6.(3R)-5, 7-二羟基-3-(2′, 4′-羟基苄基)-4-色原烷酮，7.(3R)-5, 7-二羟基-6-甲基-3-(4′-羟基苄基)-4-色原烷酮，8.(3R)-5, 7-二羟基-6-甲基-8-甲氧基-3-(4′-羟基苄基)-4-色原烷酮，9.(3R)-5, 7-二羟基-6, 8-二甲基-3-(4′-羟基苄基)-4-色原烷酮。化合物1~5为苯乙基肉桂酰胺类化合物, 化合物6~9为双氢高异黄酮类化合物。与本课题组[12]前期研究结果一致。

表 1 HPLC-DAD-Q-TOF-MS鉴定玉竹乙酸乙酯萃取部位中与α -葡萄糖苷酶有结合作用的化合物 Table 1 Identification of compounds binding with α -glucosidasein in the ethyl acetate fraction of Polygonatum odoratum by HPLC-diode array detector-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (DAD-Q-TOF-MS)
3 结论

建立高通量、特异性、普适性筛选中药活性成分的方法是中药研究的重要发展方向。本实验建立了在线ASE-HPLC-DAD-Q-TOF-MS快速筛选中药中α -葡萄糖苷酶抑制剂的方法。通过阳性和阴性样品混合进样评估了方法的特异性和准确性, 同时确定了玉竹中9个抑制α -葡萄糖苷酶的活性成分。与传统的二维亲和色谱-液相色谱相比, 该方法操作简便、分析周期短, 可用于不同复杂体系中α -葡萄糖苷酶抑制剂的快速筛选。同时, 通过戊二醛交联法可将其他药物靶标固定在硅胶表面, 制备亲和固相萃取柱, 因此该方法可以直接转嫁到针对其他药靶的活性成分筛选中。

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