色谱  2017, Vol. 35 Issue (2): 169-177   PDF    
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郑姝宁
张延国
吕军
徐东辉
超高效液相色谱-飞行时间-串联质谱法用于大白菜叶片中的脂质成分分析
郑姝宁 , 张延国 , 吕军 , 徐东辉     
中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 农业部蔬菜产品质量安全风险评估实验室(北京), 农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室, 北京 100081
收稿日期：2016-09-16
基金项目：国家蔬菜产品质量安全风险评估项目（GJFP201601401）；食用农产品特征性营养组成识别与验证评估项目（GJFP2016015）；蔬菜产品未知危害因子识别与已知危害因子安全性评估项目（GJFP2016002）
通讯联系人： 徐东辉,Tel:(010)82106963,E-mail:xudonghui@caas.cn
摘要：建立了超高效液相色谱-飞行时间-串联质谱（UPLC-TOF-MS/MS）分析大白菜叶片中脂质的种类、结构、脂肪酸组成并检测其相对含量的方法。以Acquity UPLCTM BEH C8色谱柱为固定相，采用飞行时间质谱全扫描-信息关联采集-子离子扫描（TOF-MS scan-IDA-product ion scan）复合模式实现一次进样分析，同时获得脂质的一级和二级质谱信息。在大白菜叶片中共鉴定得到232种脂质，包含104种磷脂、63种糖脂和65种甘油酯。其中，磷脂、糖脂和甘油酯中的主要成分分别为磷脂酰胆碱、单半乳糖二酰甘油和甘油二酯、甘油三酯。结果表明，该方法具有灵敏度高、准确度高和高通量等优点，为植物脂质的代谢研究提供了可靠的分析技术平台，并为进一步的脂质生物学功能研究奠定了基础。
关键词： 超高效液相色谱-飞行时间-串联质谱     脂质     大白菜     叶片    
Lipid analysis of Chinese cabbage leaves by ultra performance liquid chromatography-time of flight-tandem mass spectrometry
ZHENG Shuning, ZHANG Yanguo, LÜ Jun, XU Donghui     
Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Risk Assessment Laboratory for Vegetable Product Quality and Safety of Ministry of Agriculture(Beijing), Key Laboratory of Horticultural Crop Biology and Germplasm Creation of Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China
Foundation Item: National Risk Assessment Project for Vegetable Product Quality and Safety (No. GJFP201601401); Identification and Verification of Characteristic Nutrient Composition of Edible Agricultural Products (No. GJFP2016015); Identification of Unknown Hazardous Factors and Safety Assessment Project for Known Hazard Factors from Vegetable Products (No. GJFP2016002)
Abstract: A method for the lipid analysis of Chinese cabbage leaves was developed by ultra performance liquid chromatography-time of flight-tandem mass spectrometry (UPLC-TOF-MS/MS). The lipid species, structures, fatty acid compositions and relative contents in Chinese cabbage leaves were elucidated. Acquity UPLCTM BEH C8 column was selected as the stationary phase. A fast and efficient chromatographic separation was accomplished within 22 min. TOF-MS scan-information dependent acquisition-product ion scan was performed in ESI positive and negative ion modes to acquire high resolution MS and MS/MS spectra in one injection. Finally, 232 lipids in Chinese cabbage leaves were identified, including 104 phospholipids, 63 glycolipids and 65 glycerides. Among them, phosphatidylcholines and monogalactosyldiacylglycerols were chiefly phospholipids and glycolipids, respectively. Meanwhile, glycerides mainly contained diacylglycerols and triacylglycerols. The results demonstrated that the method for lipid analysis has high sensitivity, good accuracy and high throughput. It provides a reliable analysis platform for lipid metabolism in plants and lay a foundation for further study on biological functions of lipids.
Key words: ultra performance liquid chromatography-time of flight-tandem mass spectrometry (UPLC-TOF-MS/MS)     lipid     Chinese cabbage     leaves    

脂质是细胞中各种生物膜的主要组成成分,包括脂肪酰基、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂、固醇脂、异戊烯醇脂质、糖脂和聚酮化合物8大类[1]。脂质参与物质运输、能量储存和代谢、信号传导、代谢调控及蛋白质膜锚定等多种生命过程,具有重要的生物学功能[2-6]。目前对植物的研究中发现脂质参与光合作用、气孔运动、细胞分泌、信号转导、细胞骨架重组和小泡运输等细胞过程,在植物生长发育和胁迫反应中具有重要作用[7-13]。因此,对植物中脂质进行系统完整的分析,对研究脂质的代谢调控与生物学功能具有重要意义。

由于脂质种类繁多、结构复杂且含量差异大,至今仍没有一种很好的分析手段能够同时完成植物样品中所有脂质的分析。液相色谱-质谱联用技术的发展为脂质的定性、定量提供了强有力的技术支持[14-18]。首先通过色谱技术对样品中的脂质进行分离,再利用质谱技术对脂质分子进行检测,提高脂质分析的选择性和灵敏度。其中,ESI-MS/MS技术可获得丰富的化合物结构碎片信息,目前已广泛应用于脂质分析[19]，而飞行时间质谱(TOF-MS)具有扫描速度快、离子传输率快、灵敏度高等优点,二者的结合将大大提高复杂样品中脂质结构鉴定的准确性[20-23]。Li等[24]利用UPLC-ESI-TOF-MS技术对不同地域烟草叶片中的脂质组和代谢组进行了全面的分析,发现脂质对气候变化更为敏感；Malitsky等[25]利用UPLC-ESI-TOF-MS/MS技术对在病毒感染前后的赫氏颗石藻中的甘油三酯进行研究,鉴定出病毒感染的生物标记物。

白菜是我国的主要蔬菜作物之一,但目前尚无有关白菜中脂质的文献报道,而白菜脂质组分是影响其生长发育和抗性功能的重要因素。因此,本文采用1.7 μm粒径填料填充的C8色谱柱,利用UPLC-TOF-MS/MS技术建立分析大白菜叶片中脂质的方法,同时研究其脂质的种类、分子结构以及脂肪酸组成,从脂质代谢的角度推动白菜生长发育和抗逆机理的研究,为选育具有更好品质和抗性的白菜类蔬菜作物提供新技术。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂和材料

LC-30A超高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司); AB SCIEX 6600飞行时间串联质谱仪(TOF-MS/MS,美国应用生物系统公司),配有Analyst TF1.7.1数据采集软件和PeakView2.1、MasterView1.0数据处理软件。

乙腈、2-丙醇(HPLC级,美国JT Baker公司);乙酸铵、乙酸(HPLC级,美国Fluka公司); Milli-Q纯净水(美国Millipore公司)。

大白菜叶片样品来自中国农业科学院蔬菜花卉研究所生物技术研究室。收集成熟、大小一致、完整且无病虫害的大白菜叶片,冷冻干燥后碾成粉末,于4 ℃低温干燥保存。

1.2 样品前处理

采用甲基叔丁基醚(MTBE)-甲醇法提取样品中的脂质[25, 26]。精密称取40.0 mg大白菜叶片干粉,加入1.0 mL MTBE-甲醇(3:1,v/v)提取液,涡旋1 min,于4 ℃静置10 min,室温下超声提取20 min,加入500 μL甲醇-水溶液(1:3,v/v),涡旋1 min,以13 000 r/min高速离心5 min,移取600 μL上层清液至干净的玻璃试管中。在剩余样品中加入0.5 mL MTBE进行提取,合并上清液,用氮气吹干,残渣经300 μL流动相B复溶,过0.22 μm滤膜,滤液进样分析。

1.3 仪器条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C8 (100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱温:40 ℃;流动相:A相为含0.1%(v/v)乙酸和1%(v/v) 1 mol/L乙酸铵的水溶液,B相为含0.1%(v/v)乙酸和1%(v/v) 1 mol/L乙酸铵的乙腈-2-丙醇(7:3,v/v)溶液;流速:0.4 mL/min;进样量:3 μL。梯度洗脱条件见表 1。

离子源:Turbo VTM电喷雾离子(ESI)源;离子源温度:550 ℃;正、负离子扫描模式;喷雾电压:+5 500 V和-4 500 V;去簇电压:+80 V和-80 V;雾化气(氮气)压力:0.34 MPa;气帘气(氮气)压力:0.24 MPa;辅助雾化气(氮气)压力:0.34 MPa;飞行时间质谱全扫描-信息关联采集-子离子扫描(TOF-MS scan-information dependent acquisition (IDA)-product ion scan)复合扫描模式;IDA触发15个子离子扫描,碰撞电压:+35 eV和-35 eV;碰撞电压差均为15 eV。

表 1 液相色谱梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program of liquid chromatography
1.4 数据分析

采用Analyst TF 1.7.1 软件进行原始数据采集,PeakView 2.1和MasterView 1.0软件进行数据处理。根据一级质谱的精确相对分子质量、同位素比例、不饱和度等信息,结合PeakView 2.1软件中的FormularFinder功能,遵循化学逻辑推测脂质可能的分子式。脂质分子在ESI源形成的准分子离子或加和离子经碰撞诱导解离(CID),在不同的结构位点发生化学键断裂,形成不同的碎裂模式,产生特异的碎片离子或中性质量丢失。利用PeakView 2.1软件中的特异性碎片离子过滤和中性丢失过滤功能,对脂质进行准确快速的筛查和提取。依据所获取的脂质分子的精确相对分子质量、二级质谱碎片信息,结合相关数据库和文献,完成大白菜叶片中脂质分子的结构鉴定。最后利用MasterView 1.0软件中的Fragment Pane功能对脂质的分子结构进行解析和验证。

2 结果与讨论
2.1 UPLC条件的优化及脂质的色谱保留行为

根据脂质的种类和脂肪碳链的取代,反相UPLC BEH C8色谱柱可以实现不同种类的脂质和相同种类脂质中不同脂质分子的色谱分离,适用于复杂样品中脂质的全面分析。本实验考察了在流动相中添加不同种类和浓度的改性添加剂,(如0.1%～0.5%(v/v)的甲酸、0.1%～1%(v/v)1 mol/L的甲酸铵系统和0.1%～0.5%(v/v)的乙酸、0.1%～1%(v/v) 1 mol/L的乙酸铵系统)对脂质色谱分离度、色谱峰峰形和离子化效率的影响。结果表明,与甲酸-甲酸铵系统相比,在流动相中添加乙酸和乙酸铵后，其总离子流色谱图中各色谱峰的分离度和峰形更好,质谱响应(0.1×108～2.2×108)高于甲酸-甲酸铵系统(0.7×107～3.5×107)。进一步考察了不同浓度的乙酸和乙酸铵脂质对分离度和色谱峰峰形的影响,发现乙酸的浓度对脂质的色谱和质谱行为影响不大,但乙酸铵的浓度显著影响脂质的色谱行为和质谱响应。结果表明,采用1%(v/v) 1 mol/L乙酸铵时,各色谱峰的分离度和峰形均较好且质谱响应较高,考虑到乙酸铵在流动相B中的浓度和溶解度以及ESI源对挥发性缓冲盐的耐受性,最终选择在流动相中加入0.1%(v/v)乙酸和1%(v/v) 1 mol/L乙酸铵作为改性添加剂,实现脂质的高灵敏度检测。大白菜叶片中脂质在正、负离子模式下的总离子流色谱图见图 1。

图 1 大白菜叶片中的脂质在(a)正、(b)负离子模式下的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion chromatograms of lipids in the leaves of Chinese cabbage under (a) positive and (b) negative ion modes

在UPLC BEH C8色谱柱上,相同种类脂质的洗脱顺序主要受脂肪酸链的长度和不饱和度的影响。一般而言,脂肪酸链的碳数越多,洗脱越慢,保留时间越长;而脂肪酸链的不饱和度越大,洗脱越快,保留时间越短。以磷脂酰胆碱(PC)为例,大白菜叶片中PC 36:X(含36个碳原子，X代表双键数,分别为0～6)的选择离子色谱图见图 2。可见这些PC分子均含有36个碳原子,其保留时间仅与脂肪酸链的不饱和度有关,并符合上述规律。

图 2 大白菜叶片中PC 36: X的SIM色谱图 Fig. 2 SIM chromatogram of phosphatidyl choline PC 36:X in the leaves of Chinese cabbage PC: phosphatidyl choline; 36: the number of carbons; X: the number of double bonds (0-6).
2.2 脂质的质谱鉴定过程

将大白菜叶片的脂质提取物进行UPLC-TOF-MS/MS分析,共鉴定了磷脂、糖脂和甘油酯3大类脂质。其中磷脂在正、负离子模式下均具有较好的质谱响应,而糖脂和甘油酯主要在正离子模式下具有良好的质谱响应。在碰撞诱导解离条件下,脂质分子中相对薄弱的化学键发生断裂,不同的化学键断裂位点将产生特异性产物离子或中性丢失碎片离子,根据质谱裂解规律完成脂质组分的鉴定。以磷脂酰甘油(PG)中的PG 34:4和单半乳糖甘油二酯(MGDG)中的MGDG 36:6为例,详细解析其质谱行为和裂解规律,并描述其质谱鉴定过程。

PG 34:4在正离子模式下的一级质谱图见图 3a,其主要的质谱峰为[M+NH4]+(m/z 760.509 8),同时存在[M+Na]+(m/z 765.464 1)质谱峰,其二级质谱图见图 3b。PG的二级质谱裂解模式主要为中性丢失甘油磷酸基团,并进一步断裂脂肪酸酯键生成其他的碎片离子。由图 3b可见,PG 34:4的二级质谱主要产生m/z571.472 5碎片离子,来自中性丢失磷脂酰甘油基团(Mr 172.013 7);进一步断裂脂肪酸酯键,分别失去脂肪酸C16:1和C18:3,生成相应的m/z 335.257 7和m/z 311.257 1碎片离子;此外,断裂的脂肪酸脱水分别产生m/z 237.220 8和m/z 261.220 2碎片离子。因此该脂质被鉴定为PG 34:4,其脂肪酸组成为C16:1和C18:3。

图 3 PG 34: 4在正离子模式下的(a)一级和(b)二级质谱图 Fig. 3 (a) MS and (b) MS/MS spectra of phosphatidyl glycerol (PG) 34:4 in positive ion mode

PG 34:4在负离子模式下的一级质谱图见图 4a,其准分子离子峰为[M-H]-(m/z 741.472 6)。PG 34:4在负离子模式下的二级质谱图见图 4b,可见其主要产生m/z 505.256 6碎片离子,该碎片来自酯键断裂后丢失的脂肪酸C16:1,而m/z 253.217 4和m/z 277.216 5碎片离子则分别来自断裂的脂肪酸C16:1和C18:3。PG还可产生来自磷脂骨架的特征碎片离子(m/z 152.995 0)以及极性头部基团断裂后产生的特异性碎片(m/z 227.032 3、m/z 171.005 9),但这两个碎片离子的相对丰度较小,在图 4b中未显示。因此,该脂质被鉴定为PG (16:1,18:3),与在正离子模式下得到的结果一致。

图 4 PG 34: 4在负离子模式下的(a)一级和(b)二级质谱图 Fig. 4 (a) MS and (b) MS/MS spectra of PG 34: 4 in negative ion mode

糖脂在正离子模式下具有较好的质谱响应,可与流动相中的NH4+和Na+结合,形成[M+NH4]+和[M+Na]+。在CID下，糖脂分子将发生糖苷键的断裂,丢失含糖基团,生成特征性碎片离子,并进一步断裂连接脂肪酸的酯键,丢失脂肪酸生成相应的碎片离子,结合一级和二级质谱完成糖脂分子种类和脂肪酸组成的鉴定。以MGDG 36:6为例,其一级质谱图见图 5a,m/z 792.560 4和m/z 797.515 9碎片离子分别为[M+NH4]+和[M+Na]+离子。MGDG 36:6的二级质谱图见图 5b,其中m/z 613.482 2和m/z 595.471 4碎片离子分别来自丢失一分子半乳糖基团(Mr180.063 4)和一分子脱水半乳糖基团(Mr 162.052 8)的碎片离子,是MGDG的特征性碎片离子。在此基础上，进一步断裂脂肪酸酯键,m/z 335.257 6碎片离子为丢失脂肪酸C18:3的碎片离子,因此可知MGDG 36:6的脂肪酸组成中含有2个C18:3。此外,还可见m/z 333.241 7和m/z 337.273 3碎片离子分别为丢失半乳糖基团后失去脂肪酸C18:2和C18:4的碎片离子,可见该MGDG 36: 6的脂肪酸组成还包含C18: 2和C18:4。由于m/z 335.257 6碎片离子的相对丰度远大于m/z 333.241 7和m/z 337.273 3碎片离子,因此,该糖脂MGDG 36:6主要为MGDG (18:3，18:3),同时还有少量的MGDG (18:2，18:4)。

图 5 MGDG 36: 6在正离子模式下的(a)一级和(b)二级质谱图 Fig. 5 (a) MS and (b) MS/MS spectra of mono-galactosyldiaclyglycerol (MGDG) 36: 6 in positive ion mode
2.3 大白菜叶片中脂质的分析鉴定

利用已建立的UPLC-TOF-MS法对大白菜叶片中的脂质进行分析。采用复合扫描模式同时获得脂质精确相对分子质量的信息,设定质量误差范围小于5×10-6 (5 ppm),同时结合同位素分布,推测其分子式,依据二级质谱裂解碎片、相关文献和脂质数据库LipidMaps(http://www.lipidmaps.org/)和LipidBank(http://www.lipidbank.jp/),完成大白菜叶片中脂质的鉴定。如表 2所示，在大白菜叶片中共鉴定出232种脂质分子,其中,共检测到104种磷脂,包括31种PC、21种磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)、8种磷脂酰肌醇(phosphatidyl inositol,PI)、15种PG、15种磷脂酸(phosphatidic acid,PA)及8种溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,Lyso-PC)、6种血磷脂乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine,Lyso-PE); 63种糖脂,包括19种MGDG、17种双半乳糖甘油二酯(digalactosyldiacylglycerol,DGDG)、18种硫代异鼠李糖甘油二酯(sulfoquinovosyldiacylglycerol,SQDG)及4种溶血单半乳糖甘油二酯(lysomonogalactosyldiacylglycerol,Lyso-MGDG)、5种溶血双半乳糖甘油二酯(lysodigalactosyldiacylglycerol,Lyso-DGDG);65种甘油酯,包括14种甘油二酯(diacylglycerol,DAG)和51种甘油三酯(triacylglycerol,TAG)。

表 2 大白菜叶片中232种脂质的组成 Table 2 Compositions of the 232 lipids in the leaves of Chinese cabbage

由表 2可知,大白菜叶片中的脂质,除了溶血脂质的碳原子数为16和18,双键数为0～3外,其他脂质含有的碳原子数为32～60,双键数为0～9。此外,大白菜脂质的脂肪酸组成为长链脂肪酸,包括7种饱和脂肪酸(分别为脂肪酸C14:0、C16:0、C18:0、C20:0、C22:0、C24:0和C26:0)和(17种不饱和脂肪酸,分别为脂肪酸C14:1、C16:1、C16:2、C16:3、C16:4、C18:1、C18:2、C18:3、C18:4、C20:1、C20:2、C20:3、C20:4、C22:1、C22:2、C24:1和C24:2脂肪酸)，其中相对含量较高的脂肪酸的碳数多为16和18,双键数为0～3。

2.4 大白菜叶片中脂质的相对含量

虽然不同种类脂质具有不同的质谱响应,但相同种类脂质的质谱响应具有相似性和可比性。因此,对于相同种类脂质的相对含量用其一级质谱中提取离子色谱峰的峰面积代表。大白菜叶片中磷脂、糖脂和甘油酯中不同种类脂质及其相对含量见图 6。由此可见,PC是大白菜磷脂的主要成分,MGDG和DGDG是糖脂的主要成分,而DAG和TAG则是甘油酯的主要组成。进一步对大白菜磷脂组分进行详细分析,发现PC占总磷脂的89.0%,PG、PE和PA分别占总磷脂的3.8%、2.7%和2.4%,相对含量最少的是PI,仅占总磷脂的0.1%,还有少量的Lyso-PC和Lyso-PE(总相对含量约占总磷脂的2.0%)。可见大白菜叶片中磷脂种类丰富、含量高,可作为植物磷脂较好的来源。此外,大白菜叶片中还含有丰富的糖脂,主要糖脂组分为MGDG(占总糖脂的66.7%),其次为DGDG(占总糖脂的21.8%),SQDG的相对含量较少(占总糖脂8.3%),还有少量的Lyso-MGDG和Lyso-DGDG(总相对含量约占总磷脂的3.10%)。其中,MGDG和DGDG是植物重要的半乳糖脂,二者总量占叶绿体膜脂的80%以上,对质体膜的完整性和光合能力的维持都起着至关重要的作用[27, 28]。大白菜叶片中甘油酯组分主要为DAG和TAG,其中DAG的含量略高于TAG,分别占总甘油酯的55%和45%。

图 6 大白菜叶片中(a)磷脂、(b)糖脂和(c)甘油酯中不同种类脂质的相对含量 Fig. 6 Relative contents of (a) phospholipids,(b) glycolipids and (c) glycerides for the different species in the leaves of Chinese cabbage PC,PE,PI,PG,PA,Lyso-PC,Lyso-PE,MGDG,DGDG,SQDG,Lyso-MGDG,Lyso-DGDG,DAG and TAG are the same as in Table 2.
3 结论

本文建立了UPLC-TOF-MS/MS检测大白菜植物样品中脂质的分析方法，并对脂质的种类、分子结构、脂肪酸组成和相对含量进行了全面系统的研究。在大白菜叶片中共鉴定出232种脂质分子,包括104种磷脂、63种糖脂和65种甘油酯。本文所建立的分析方法将为植物脂质组学提供可靠的分析平台,为关于大白菜脂质的基因功能和作用机制的研究奠定基础,并为进一步选育品质和抗性优良的大白菜新品种提供了理论依据。

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