米那普仑(milnacipran) 是一种新型抗抑郁药物, 能同时抑制5-羟色胺和去甲肾上腺素的再摄取, 临床疗效与传统三环类抗抑郁剂相似, 但无三环类的不良反应[1]。米那普仑[(±)-1]化学名为2-(氨甲基)-N, N-二乙基-1-苯基环丙烷甲酰胺盐酸盐, 其分子中含有两个手性碳原子, 上市的米那普仑为(±)-Z式外消旋体结构(见图 1)[2]。2013年7月25日, 美国国家食品药物监督管理局(FDA)[3, 4]批准5-羟色胺与去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRIs) 类药物Fetzima (左旋米那普仑缓释胶囊) 用于成人重性抑郁障碍的治疗。Auclair等[5]通过研究证实米那普仑对映体中左旋米那普仑的药理学活性更高。Chen等[6]的研究结果显示左旋米那普仑具有很好的安全性和人体耐受性, 抑郁伴有轻度、中度或重度肝损伤的患者单剂量服用40 mg左旋米那普仑缓释胶囊可不作剂量调整。手性药物对映体在体内常呈现不同的药理药效学特性, 并且相对于外消旋体, 单一对映异构体与受体结合有更好的特异性、更少的变化因素和副作用[7]。因此有必要对米那普仑外消旋体进行拆分, 建立单个对映体的定量分析方法。
已有文献[8, 9]报道采用毛细管电泳(CE) 方法拆分米那普仑外消旋体, 如Grard等[8]在CE中采用环糊精(cyclodextrin, CD) 双添加(S-β -CD/HP-γ -CD) 法成功分离米那普仑。近年来HPLC方法也被用于米那普仑的手性拆分。Patti等[2]考察了4种纤维素手性固定相(Chiralcel OD、OD-H、OJ、IB) 对米那普仑的分离情况, 发现米那普仑在Chiralcel OJ手性柱上能够获得良好拆分, 而进行9-芴甲氧基羰酰氯(Fmoc-Cl) 柱前衍生化则可大大改善在所有手性柱上的分离结果。Lecoeur-Lorin等[10]采用非手性固定相HPLC法和圆二色检测器对米那普仑进行手性分析, 通过测定圆二色信号(Δε) 和紫外信号(ε) 来计算各向异性因子(anisotropy factor, g=Δ ε/ε), 根据该因子g与对映体过量(enantiomeric excess, e. e.) 的线性关系得出e. e.值, 整个实验避免了使用昂贵的手性柱。文献中多采用手性合成的方法获得单一对映异构体, 刘啸等[11]采用组合拆分的方法, 选用D-(+)-二对甲氧苯甲酰酒石酸和D-(+)-二对甲苯甲酰酒石酸为组合拆分试剂, 选用丙酮-水(98 : 2, v/v) 为拆分溶剂, 在Chiral-AGP酸性糖蛋白手性柱上分离制备米那普仑(1S, 2R) 对映体, e. e.值大于98.0%。
环糊精是自然存在的环状低聚糖分子, 结构形似手电筒, 中间构成一个空腔, 通常由6、7、8个葡萄糖单元通过α -1, 4-糖苷键连接而成, 分别称为α、β、γ -环糊精, 具有与多种化合物形成包合复合物的能力, 因此环糊精作为流动相添加剂或者固定相被大量应用在外消旋化合物的手性拆分中[12-15]。环糊精键合固定相应用于HPLC时可在不同的分离模式下使用, 如正相、反相和亲水相互作用色谱[16, 17]。目前未见采用β -环糊精类手性固定相拆分米那普仑对映体的报道。
本文采用HPLC手性固定相法分离米那普仑对映体, 考察其在β -环糊精类固定相上的拆分情况, 并结合分子模拟方法探讨拆分机理, 为米那普仑对映体的质量控制和体内动态变化研究提供可靠的分析方法及依据。
Waters 2695高效液相色谱系统(包括Waters 2695分离单元和Waters 2487双波长紫外检测器, 美国Waters公司)。环糊精类色谱柱:Astec CYCLOBONDTM I 2000(25 cm×4.6 mm, 5 μ m, Cyclobond I 2000手性柱)、Astec CYCLOBONDTM I 2000 DM (25 cm×4.6 mm, 5 μ m, DM-β -CD手性柱)、Astec CYCLOBONDTM I 2000 AC (25 cm×4.6 mm, 5 μ m, AC-β -CD手性柱) 和Astec CYCLOBONDTM I 2000 DMP (25 cm×4.6 mm, 5 μ m, DMP-β -CD手性柱) 均购自美国Sigma-Aldrich公司。优特CyberScan510台式pH计(美国Eutech公司), HPLC用溶剂过滤器(天津津腾实验设备有限公司), 隔膜真空泵(天津津腾实验设备有限公司), 水相过滤膜SCBB-207(50 mm×0.2 μ m, 上海安谱科学仪器有限公司)。
盐酸米那普仑对照品购自美国Aladdin公司, 纯度不小于99%;左旋米那普仑对照品购自美国Target Molecule公司, 纯度为98%。乙腈(ACN)、异丙醇均为色谱纯(美国Dikma公司), 三乙胺为色谱纯(美国Tedia公司), 冰醋酸为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司), 水为超纯水。
色谱柱:Astec CYCLOBONDTM I 2000 AC (25 cm×4.6 mm, 5 μ m); 流动相为体积比为5 : 95的乙腈-0.1%(体积分数) 醋酸三乙胺溶液(TEAA, pH 5.0);进样量为10 μ L; 流速为0.4 mL/min; 柱温为25 ℃; 检测波长为220 nm。流动相使用前经0.22 μ m微孔滤膜过滤。
称取盐酸米那普仑对照品10.0 mg, 置于10 mL量瓶中, 用甲醇溶解、定容, 配制成1.00 g/L的储备液, 于4 ℃冰箱保存。取1 mL盐酸米那普仑储备液, 用甲醇稀释10倍, 得到100 mg/L的标准溶液, 用于后续分析。精密称取左旋米那普仑5.0 mg, 置于5 mL量瓶中, 用甲醇溶解定容, 配制成1.00 g/L的储备液, 于4 ℃冰箱保存。取100 μ L左旋米那普仑储备液, 用甲醇稀释10倍, 得到100 mg/L的标准溶液, 用于后续分析。
在相同条件下取米那普仑标准溶液, 加入等量的左旋米那普仑标准溶液进样分析, 对比出峰情况。如果其中一个峰的峰面积或峰高相对另一峰明显增加, 则可确认米那普仑消旋体色谱图中左旋体和右旋体的峰归属。
米那普仑对映体的分子构建采用Sybyl 7.0商业软件中Sketch Molecule完成。环糊精的分子构建为从蛋白质晶体结构库PDB代码为3M3R[18]的晶体结构中提取β -环糊精构建AC-β -CD三维分子结构, 具体方法可参考文献[19]。在Discovery Studio 2.5软件平台上采用GOLD version 3.0.1商用软件进行分子对接研究[20]。将处理好的米那普仑对映体分子对接到预先构建好的AC-β -CD疏水空腔内。构象选择依据GoldScore分数, 并参考相同构象出现的次数以及构象的合理性选取。采用Discovery Studio 2.5软件受体-配体相互作用(receptor-ligand interactions) 中的计算结合能(calculate binding energies) 功能进行结合能计算。构象熵(ligand conformational entropy) 选择为True, 其他选项为默认。依据软件中的结合能公式计算主客体包合物结合能[21]:
其中Ecomp为主客体包合物的能量, Eguest为客体分子的能量, Ehost为主体环糊精的能量。主客体包合物的能量变化Δ Ecomp数值越小, 表示包合物越稳定[22, 23]。
分别考查了反相HPLC模式下未衍生化的β -环糊精(Cyclobond I 2000)、AC-β -CD、2, 3-二甲基-β -环糊精(DM-β -CD)、3, 5-二甲基苯基氨基甲酸酯-β -环糊精(DMP-β -CD)4种手性固定相对米那普仑的拆分能力。结果显示, 米那普仑在Cyclobond I 2000、DM-β -CD和DMP-β -CD手性柱上只显示单峰, 对映体未能得到拆分; 而AC-β -CD手性柱对米那普仑有良好的拆分能力, 在初始条件下(水相为pH 4.4的醋酸三乙胺溶液, 有机相为体积分数为5%的ACN, 流速为0.8 mL/min) 有明显双峰出现(Rs=1.16), 因此选择AC-β -CD手性柱进行后续的条件优化。
由于米那普仑的紫外吸收度随着波长增加而减少[24], 在210~220 nm处有个缓坡, 所以检测波长设定为220 nm。为了分离米那普仑对映体, 考察了乙腈-0.1%(体积分数) 醋酸三乙胺溶液的比例, 发现增加乙腈的体积比可使保留时间减少, 同时也减少了对映体与固定相的作用时间, 导致溶质洗脱过快, 相应地降低了分离度。在AC-β -CD手性柱上, 乙腈体积比保持在5%时分离度较好。所以选择乙腈的体积比为5%。
环糊精手性柱适用pH范围为3.0~6.5, 因此水相pH设定为:4.4、5.0、5.5、6.0、6.5。米那普仑分子中含有伯胺基, 理论上在中性偏碱性条件下保持分子形态, 与固定相有较好的相互作用；而在偏酸性条件下呈水合离子状态, 与固定相作用较弱。试验发现, 随着pH增加, 米那普仑对映体的分离度Rs呈增大趋势, 但在pH 5.5以上连续重复进样时, 米那普仑的保留时间一直在缩短, 可能在此pH条件下其分子处于一种不稳定的状态, 导致固定相对米那普仑保留能力不断降低。因此最后选定pH 5.0作为本实验的分析条件。
随着流速的增加, 米那普仑与固定相间的作用时间变短, 因而分离度Rs降低(见图 2)。但是流速较小时, 保留时间增大, 为了获得合适的保留时间, 所以选择流速为0.4 mL/min。
在pH 5.0和流速为0.4 mL/min时考察柱温对拆分的影响。通过比较柱温在20、25、30、35 ℃时的分析结果发现, 柱温对分离度有较明显的影响。随着柱温的升高, 分离度Rs先升高再降低, 在25 ℃时有一个最大值(见图 3), 所以确定柱温为25 ℃。
图 4为在优化后的实验条件下米那普仑对映体的分离色谱图。可以看出两个峰的峰高有差异, 峰面积比为1 : 1, Rs为1.74, 理论塔板数达到10 125。经过与左旋米那普仑对照, 确定右旋体[(+)-1]先出峰, 保留时间为7.652 min, 左旋体[(-)-1]后出峰, 保留时间为8.067 min。
在优化的条件下连续进样, 米那普仑对映体(+)-1和(-)-1保留时间的RSD分别为0.033%和0.021%, 峰面积的RSD分别为1.1%和2.5%(n=4)。结果表明本文所建立的米那普仑拆分方法具有较好的重现性。
从4种环糊精手性色谱柱对米那普仑的拆分结果可以看出, 环糊精的衍生化基团导致了手性拆分结果的差异。AC-β -CD手性柱(即Astec CYCLOBONDTM I 2000 AC柱) 的拆分效果最好, 达到基线分离, 其他3种环糊精手性色谱柱没有分离能力。4种手性色谱柱的β -环糊精通过6~10个碳原子的间隔键合到微粒硅胶上。反相色谱模式下环糊精手性色谱柱的手性识别能力主要是环糊精的包合作用。因此尝试利用分子模拟技术研究AC-β -CD与米那普仑的手性识别机理。图 5是米那普仑对映体与AC-β -CD的分子对接图, 从图中可知, 米那普仑的(+) 构型与(-) 构型均从AC-β -CD的大口端进入环糊精疏水空腔, 苯环进入最深, 苯环在疏水空腔中有助于增强疏水作用, 进而提高主客体包结的稳定性。手性碳相连的氨甲基和甲酰胺基团朝环糊精大口端向上, 两者对接图中主要差异在于氢键作用。(+) 构型氨甲基上的氨基与AC-β -CD大口端边缘的乙酰基上的羰基形成氢键(绿色虚线), 而(-) 构型没有类似的氢键作用。氢键上的差异也间接证明为何AC-β -CD对米那普仑的手性识别能力最好, 而其他3种环糊精手性色谱柱对米那普仑没有手性识别能力, 主要差别在环糊精的衍生化基团。
通过结合能计算(+)-米那普仑和(-)-米那普仑与AC-β -CD的包合物的结合能(E) 值, (+)-米那普仑为-61.41 kcal/mol, 而(-)-米那普仑为-65.54 kcal/mol。结合能都为负值说明包合物在热力学上都是稳定的。米那普仑的(-) 构型结合能小于(+) 构型, 说明(-) 构型比(+) 构型更稳定, 与AC-β -CD结合能力更强, 这与色谱图中的(-) 构型后出峰一致。结合能的差异可能与两者的氢键作用有关, (-) 构型没有AC-β -CD大口端上的氢键作用, 能更深入环糊精的疏水空腔, 从而结合能力更强。可见这些手性识别过程中的差异会导致结合能的差异, 进而导致在给定分析条件下米那普仑的手性拆分。虽然分子模拟计算通常是在真空条件下, 不考虑实际分离条件中溶剂效应的影响, 有时候分子模拟结果与实际HPLC实验的结果有差异, 但分子模拟技术仍能为分析环糊精与客体分子包结过程中分子间相互作用、解释手性拆分机理提供帮助。
本文研究了米那普仑在不同环糊精类手性固定相上的拆分, 考察了固定相种类、流动相比例、pH值、流速和柱温对拆分的影响。最终采用Astec CYCLOBONDTM I 2000 AC手性色谱柱, 在反相色谱条件下成功拆分了米那普仑对映体, 并结合分子模拟结果探讨了可能的手性分离机制。相比于文献中的CE[8, 9]和组合拆分[11]等方法, 本文所建立的拆分方法准确可靠、简便快速, 在较短的时间内获得良好的分离效果, 为米那普仑对映体的体内外研究提供了技术支持。
2017,
Vol. 35 Issue (3): 286-290
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Vol. 35 Issue (3): 286-290
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