快速检测复杂生物样品中具有生理功能的相对丰度较低的蛋白质, 可以节约时间、降低成本、提高效率, 对临床诊断、生物医学应用及蛋白质组学研究具有重要意义[1]。目前关于蛋白质的检测方法包括酶联免疫吸附法[2]、高效液相色谱-质谱联用法[3]、表面等离子共振法[4]、化学发光免疫分析法[5]、石英晶体微天平法[6]和共振瑞林散射法[7]等。然而, 这些技术存在样品前处理复杂、成本高、选择性低和耗时长等缺点。因此, 亟须开发一种准确可靠、选择性高、成本低的蛋白质检测技术, 以满足复杂生物样品的检测需求。
本研究制备了一种新型量子点嵌入的分子印迹膜(QDs@MIM), 并将其作为荧光人工受体用于蛋白质的快速检测和识别。QDs@MIM以L-半胱氨酸修饰的锰(Mn2+) 掺杂硫化锌(ZnS) 的量子点(QDs) 为辅助单体、溶菌酶(LYZ) 为模板分子、丙烯酰胺(AAM) 为功能单体、N, N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAM) 为交联剂, 在水相中通过分子印迹聚合而成。制备的QDs@MIM不仅保留了传统分子印迹聚合物的优点, 如机械物理稳定性好、选择性高、成本低、操作适应性广泛等, 还展现了包括吸附平衡时间短、去除模板分子简单及灵敏度高等优异的新性能, 具有作为荧光生物仿生传感器识别和分离蛋白质的潜力[8, 9]。QDs@MIM可以选择性地绑定目标蛋白质LYZ, 当电子在量子点和目标蛋白质间传递时, 印迹膜中的量子点荧光猝灭[10-13]。根据QDs@MIM的猝灭程度与目标蛋白质浓度的线性关系, 建立了一种具有高选择性和高灵敏度的快速检测目标蛋白质的分析方法。
RF-5301荧光分光光度计、UV-1800紫外分光光度计(日本岛津公司); BX FT-IR傅里叶红外光谱仪(美国铂金埃尔默公司); DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)。
七水合硫酸锌(ZnSO4\57H2O)、九水合硫化钠(Na2S\59H2O)、四水合氯化锰(MnCl2\54H2O)、十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4\512H2O) 和二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4\52H2O) 均购自北京化工厂; 十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、AAM、MBAAM购自天津精细化工研究所; L-半胱氨酸(≥98.5%)、LYZ (＞99%) 均购自百灵威中国有限公司; 聚对苯二甲酸乙二酯板片膜(PET薄膜) 购自广州钰新材料有限公司。以上试剂均为分析纯。所有实验用水为二次蒸馏水。
在文献方法[14, 15]的基础上, 对合成L-半胱氨酸修饰的硫化锌量子点的方法做了一定改进。称取1.8 g ZnSO4\57H2O、0.1 g MnCl2\54H2O、0.45 g L-半胱氨酸和25 mL去离子水，置于50 mL三口烧瓶中, 在氮气保护下室温搅拌90 min, 逐滴加入1.5 g Na2S\59H2O水溶液, 于室温下搅拌12 h, 离心后收集沉淀, 真空干燥后保存, 备用。
QDs@MIM是将L-半胱氨酸修饰的锰掺杂的硫化锌量子点包埋到丙烯酰胺聚合物网络中, 通过分子印迹过程在硅烷化的玻片上制备而成。具体过程如下:称取0.4 g AAM、30 mg LYZ置于10 mL离心管中, 加入2 mL 0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.2) 溶解, 超声分散20 min; 在上述溶液中加入3 mg QDs和8 mg MBAAM, 在冰浴条件下超声分散30 min后, 依次加入40 μ L质量分数为10%的过硫酸铵溶液(催化剂) 和5 μ L TEMED; 反应5 min后, 吸取15 μ L预聚合物溶液(前驱体溶液) 滴加到硅烷化的玻片上, 使聚合物溶液均匀铺开, 用PET薄膜覆盖到溶液表面, 于室温下聚合20 h; 最后, 用清水润洗、浸泡玻片, 除去覆盖的薄膜, 即得到QDs@MIM, 将QDs@MIM浸泡在磷酸盐溶液中保存。非量子点嵌入的分子印迹膜(QDs@NIM) 与QDs@MIM制备方法相同, 只在制备过程中不使用LYZ作为模板分子。将制备的QDs@MIM浸泡在10%(质量分数) SDS-10%(v/v) 醋酸混合溶液中反复清洗, 以去除模板分子, 并用荧光分光光度计测定荧光强度的变化, 直到QDs@MIM与QDs@NIM的荧光值接近。
当QDs@MIM未与LYZ结合时, 膜内包埋的量子点被光激发时会产生橘黄色荧光; 当QDs@MIM浸入样品溶液时, 由于膜表面存在特异性结合位点, 模板分子被印迹层捕获, 与印迹位点结合, 膜上量子点的电子传递到模板分子上, 导致荧光发射减弱, 发生QDs@MIM的荧光猝灭现象。理论上，体系中LYZ对QDs@MIM的荧光猝灭遵循Stern-Volmer方程, 具体公式如下[14, 15]:
其中, F0为初始荧光强度; F为加入LYZ后的荧光强度; Ksv为Stern-Volmer常数; Q为LYZ的浓度。
用磷酸盐缓冲液配制1 μ mol/L的LYZ标准溶液, 并稀释成浓度为0.1~1.0 μ mol/L的标准工作液。将QDs@MIM和QDs@NIM分别置于不同浓度的LYZ标准工作液中, 于室温下摇床孵育10 min, 各样品在最大荧光激发波长下测定，并记录QDs@MIM和QDs@NIM的发射光谱。根据公式(2) 计算各物质的选择性因子(IF)[14], 计算公式如下:
Ksv, MIM和Ksv, NIM分别为QDs@MIM和QDs@NIM在不同溶液中的Stern-Volmer常数。
本实验考察了QDs@MIM与LYZ相互作用达到吸附平衡时的时间。如图 1所示，在最初加入LYZ时(0~2 min), 大量LYZ分子与QDs@MIM上的量子点作用, 导致其荧光强度明显下降; 加入LYZ 2~4 min后, QDs@MIM的荧光强度的降低程度逐渐减弱; 而在相互吸附4 min后, QDs@MIM的荧光强度基本趋于稳定, 此时标志着QDs@MIM对LYZ达到吸附平衡。由实验结果可知, QDs@MIM对LYZ的吸附平衡时间为4 min。
QDs@MIM在不同浓度LYZ下的荧光光谱图见图 2。在LYZ浓度为0.1~1.0 μ mol/L范围内, 随着LYZ浓度的升高, QDs@MIM的荧光强度逐渐降低, 表明根据印迹膜的荧光猝灭程度来计算溶液中LYZ的浓度是可行、有效的。
在LYZ浓度为0.1~1.0 μ mol/L的范围内, QDs@MIM的荧光强度(F0/F) 对LYZ浓度(Q) 的线性关系良好, 相关系数为0.988 1, 检测方程实际为F0/F=1.13Q+1.03。通过公式(2), 计算得到IF为6.2, 说明制备的QDs@MIM选择性高，为生物样品中LYZ的快速分析定量提供理论和实验基础。
本文制备了L-半胱氨酸包覆的Mn2+掺杂ZnS的量子点。采用L-半胱氨酸对量子点表面进行修饰, 不仅提高了量子点在水中的分散性, 还可作为生物载体与蛋白质结合, 用于制备生物传感器。以LYZ分子为模板、AAM为单体、L-半胱氨酸修饰的量子点为辅助单体、MBAAM为交联剂, 利用分子印迹技术制备了一种灵敏度高、选择性好的QDs@MIM, 作为LYZ的荧光人工受体。这种新型蛋白质荧光人工受体可以对样品中的目标蛋白质进行检测分析, 方法准确可靠, 具备作为生物传感器检测生物样品中目标分析物的潜力。
2017,
Vol. 35 Issue (3): 252-254
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Vol. 35 Issue (3): 252-254
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