基于气相色谱-质谱联用技术的高通量细胞表型分析方法


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	王希越

	高鹏

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	许国旺

王希越^1,2 , 高鹏^2,3 , 连丽丽¹ , 娄大伟¹ , 许国旺²

1. 吉林化工学院, 吉林吉林 132022;
2. 中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁大连 116023;
3. 大连医科大学附属大连市第六人民医院, 辽宁大连 116021

收稿日期：2016-10-08

基金项目：国家自然科学基金项目（21375046，201605056）；吉林省科技发展计划项目（20140203013GX）

通讯联系人：高鹏, E-mail:gaop@dicp.ac.cn; 娄大伟, E-mail:dwlou@hotmail.com

摘要：研究开发了一种基于96孔板培养和气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术的高通量细胞表型分析方法。该方法分别以48种物质作为唯一能源对大肠杆菌进行培养，利用GC-MS研究野生型和yfcC基因改造大肠杆菌对各物质的分解代谢情况，实现高通量的细胞表型分析。结果显示，野生型和yfcC基因过表达大肠杆菌对14种物质的代谢能力有显著差异，yfcC基因过表达大肠杆菌对甘氨酸和柠檬酸的代谢能力明显强于野生型大肠杆菌，而对其他物质的代谢能力较弱，我们推测可能是由于yfcC基因促进乙醛酸代谢，导致yfcC过表达菌株对甘氨酸的代谢能力较强；野生型和yfcC基因敲除大肠杆菌间分解有显著差异的共16种物质，其中yfcC基因敲除大肠杆菌对丙氨酸、乳糖、肌醇和柠檬酸的代谢能力较强。该方法简单、高效，可以为未知基因功能研究提供更多代谢功能相关的参考数据。

关键词：气相色谱-质谱高通量表型基因功能

High-throughput method for cell phenotype analysis by gas chromatography coupled with mass spectrometry

WANG Xiyue^1,2, GAO Peng^2,3, LIAN Lili¹, LOU Dawei¹, XU Guowang²

1. Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China;
2. Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China;
3. Dalian Sixth Peoples Hospital Affiliated of Dalian Medical University, Dalian 116021, China

Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21375046, 201605056); Science and Technology Development of Jilin Province (No. 20140203013GX)

Abstract: A high-throughput method for cell phenotype analysis was developed based on 96-well plate culture and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS). Forty-eight metabolites were selected as the sole energy for wild-type and its yfcC mutation E. coli (yfcC over-expression and yfcC deletion mutants) culture. The high-throughput phenotype analysis was achieved by investigating the catabolism difference of these metabolites among the three strains by GC-MS. The results showed that there were 14 metabolites changed significantly between wild-type and yfcC over-expression mutant E. coli. The metabolism ability of yfcC over-expression mutant E. coli for glycine and citric acid was much stronger than wild-type E. coli. For other metabolites, the wild-type strain showed stronger capabilities in metabolism. Among the 16 metabolites metabolized differentially between wild-type E. coli and its yfcC deletion mutant, metabolism ability of alanine, lactose, myo-inositol and citric acid in yfcC deletion mutant was much stronger. Other metabolites displayed the opposite results. Among the results acquired, we speculated that the faster metabolism of glycine in yfcC over-expression mutant E. coli might be caused by its promoted glyoxylate shunt. This high-throughput method for cell phenotype analysis was simple and efficient. It could provide more useful information about metabolism for gene study with unknown function.

Key words: gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) high-throughput phenotype gene function

在过去十几年里, 随着基因测序技术的不断发展和完善, 人们已经完成了150多种生物全基因组测序, 这些基因数据的获得无疑加深了人们对生命科学的认识, 但是测序完整的生物, 即使是简单的细菌生物, 目前仍有30%~40%的基因功能是未知的或仅分配了一个假设的功能^[1]。随着后基因组时代的到来, 人们期望获得更多基因的功能以深入探索生命科学的奥秘。表型是细胞在不同遗传及环境条件下所表现出来的性状, 包括行为、个体形态、生长、生理功能差异等等。表型是基因型与环境交互作用的最终表现形式, 通常一个基因型的改变可能会使相应个体中一个或多个表型发生变化, 因此对基因型与表型之间关系的研究, 是揭示未知基因功能的有效方法^[2-5]。

生物体内复杂的调控关系需要一种“全局”分析技术。从细胞整体水平上了解其生理功能, 能帮助我们更好地预测一些有意义的生物学结果, 获得基因功能相关的信息。利用DNA芯片和二维凝胶电泳分析方法可以获得细胞转录组(transcriptomics)和蛋白质组(proteomics)的全局信息, 近年提出利用转录组学和蛋白质组学方法研究未知基因功能^{[6, 7]}, 但是某些沉默基因或蛋白质翻译后修饰问题使转录组和蛋白质组水平上基因功能的研究仍存在一定局限性。表型反映了基因与环境共同作用的结果, 所以基于细胞表型的全局分析方法在功能基因组学研究中变得越来越重要^{[8, 9]}。1989年, Bochner^[10]首次提出一种利用微孔板技术实现高通量的全局细胞表型分析的方法。2001年, 该研究团队在此基础上进行改进, 发明了表型微阵列(phenotype microarrays, PMs)方法来高通量地研究细胞表型^[11]。这个方法利用细胞分解代谢各种碳源、氮源、磷、硫等营养物质时产生自由电子, 电子与四唑盐染料发生还原反应改变染料颜色, 通过OmniLog仪器自动监测记录颜色变化情况来研究不同菌株的表型差异。该方法简单、快速, 已实现自动化分析, 在研究不同菌株的细胞表型差异中得到广泛应用^[12-16]。但是该法不能定量分析细胞对各物质的利用程度差异, 仅能得到有限的细胞代谢功能信息。

基因组中, yfcC基因在磷酸乙酰转移酶(pta)基因之后, 编码一功能未知的内膜蛋白, 我们前期研究发现yfcC可能促进乙醛酸代谢^[17]。本文利用气相色谱-质谱联用技术发展了一种高通量细胞表型分析方法, 并对yfcC基因改造过的大肠杆菌代谢表型差异进行研究。该方法不仅可以实现PMs技术中的高通量分析, 而且可以定量评价细胞对各物质的代谢能力, 获得更多反映细胞分解代谢能力的数据, 为基因功能研究提供新的参考信息。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Shimadzu GC/MS-QP2010气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司); Labconco低温真空离心浓缩仪(美国Labconco公司); 高速冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司); ZHWY-211C恒温摇床培养箱、ZHJH-1112超净工作台(上海智城分析仪器公司); LRH-150生化培养箱(上海一恒仪器公司)。

吡啶、N, O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)、香草酸购自Sigma-Aldrich公司; 48种标准品(见表 1)包括糖类、糖醇、氨基酸、有机酸等, 购自Sigma-Aldrich公司、Alfa Aesar公司和百灵威公司; 氯化钠购自天津科密欧化学试剂公司; LB培养基购自北京路桥技术公司; 氯霉素、琼脂粉购自北京索莱宝科技公司。实验用水为超纯水, 由Milli-Q系统(Millipore Co., US)净化。

表 1 用于大肠杆菌培养的48种能源物质 Table 1 Forty-eight metabolites for E. coli culture

1.2 实验部分

1.2.1 菌株及培养

AS 1.1566购自中国普通微生物菌种宝藏中心, 对其进行基因重组后构建细菌AS 1.1566/pBCTE (野生型菌, W)、AS 1.1566 ΔyfcC::chl (yfcC基因敲除菌, Y-)、AS 1.1566/pBCTE-yfcC(yfcC基因过表达菌, Y+)。将甘油冻存的3株大肠杆菌放在LB培养基中, 160 r/min、37 ℃条件下活化培养12 h, 然后用含2%(质量分数)琼脂粉的固体LB培养基进行单菌落纯化培养, 挑取单菌落于装有已灭菌的10 mL生理盐水的玻璃管中, 通过麦氏比浊管对比, 其含量为6×10⁸细菌/mL。

将准备好的菌液向96孔板的各孔中依次加入90 μL, 因本研究中共有48种营养物质, 为方便操作, 将对比菌株W和Y+、W与Y-成排交错加在同一板内。48种标准物质用高纯水配制成5 mg/mL的贮存液, 用0.22 μm滤膜过滤除菌后, 依次加入96孔板的各孔内, 每孔加10 μL, 不加任何其他营养液, 将96孔板置于37 ℃LRH-150生化培养箱中过夜培养12 h。每株菌平行制作3个孔板。为防止重组菌质粒丢失, 各菌株在每种培养条件下均加入终浓度30 μg/mL的氯霉素。

1.2.2 样品前处理

在培养12 h的同株菌中每孔各定量取出20 μL菌液于1.5 mL离心管中, 涡旋10 s混匀, 15 000 r/min 4 ℃离心10 min, 上清液再经0.22 μm滤膜过滤除残留菌体, 定量取出25%上清液于新的1.5 mL离心管中, 同时加入5 μL 2 mg/mL香草酸作为内标, 放入低温冷冻干燥机内冻干。冻干样品加50 μL吡啶溶解, 涡旋10 s, 加BSTFA 65 μL, 超声15 min使样品充分溶解, 75 ℃水浴条件下衍生45 min, 12 000 r/min 4 ℃条件下离心15 min, 取上清液进行气相色谱-质谱分析, 每个样品平行分析3次。

1.2.3 色谱条件

DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(J&W, USA), 载气流量1.19 mL/min (氦气, 纯度为99.999 6%), 进样口温度280 ℃, 分流比10:1, 进样量1 μL, 色谱柱升温程序:70 ℃保持5 min, 5 ℃/min上升至280 ℃, 保持5 min; 质谱条件:电子轰击电离源, 离子源温度200 ℃, 接口温度280 ℃, 检测电压1.1 kV, 扫描范围m/z 33~600, 扫描间隔0.5 s, 溶剂切割时间7 min。

1.2.4 数据分析

数据处理:将采集得到的原始数据在GC-MS solution工作站中导成cdf格式, 然后导入XCMS程序进行滤噪、保留时间对齐、色谱峰匹配等处理^[18]。XCMS主要参数设置如下:半峰宽(fwhm) 4 s, 每个提取离子流中最大峰个数(max) 100, 信噪比阈值(snthresh) 10, 步长(step) m/z 0.1, 色谱峰在样品中占有的最小比例(minfrac) 0.25。

统计分析:XCMS得到的代谢物特征用内标进行归一化, 再用80%规则去除零值^[19], 偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)和S-Plot分析在SIMCA-P 11.0 (Umetrics, Umea, Sweden)软件中完成; 在PASW Statistics 18 (SPSS, Chicago, IL, USA)软件中进行非参数t检验; PLS-DA模型中，VIP (the variable importance in the project) > 1且t < 0.05被认为是显著变化的物质; 另外, 为了减少差异物质的假阳性结果, 用伪发现率(false discovery rate, FDR)对结果进行校正^{[20, 21]}。筛选到的差异物质柱状图在Graphpad软件中绘制。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS高通量分析结果

本工作中, 96孔板各孔内分别加一种营养物质对细菌进行培养, 培养结束后将各孔内物质混合制备分析样品, 利用气相色谱-质谱技术对各物质进行检测, 实现高通量的细胞代谢表型分析。GC-MS分析得到的总离子流图见图 1, 从总离子流图中可得到大肠杆菌对48种物质分解代谢能力的信息。如果GC-MS分析结果显示物质的含量没有明显的变化, 说明细菌对该物质分解代谢能力低或没有代谢能力; 如果物质含量明显降低, 表明细菌对该物质有很强的分解代谢能力。若扩大能源物质数量, 利用GC-MS高通量技术进行相对定量分析细菌对这些物质的代谢能力, 即可同时得到几百种甚至更多代谢表型。相比于PMs分析方法, 该方法可以更准确地从物质的量上反映细胞代谢表型特征。

图 1 GC-MS分析得到的野生型大肠杆菌(W菌)对48种物质代谢的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion chromatogram of the 48 metabolites achieved by GC-MS in wild-type E. coli (W strain) The labeled peaks were metabolites changed significantly. 1. Ala; 2. Gly; 3. oxalic acid; 4. Val; 5. Ile; 6. succinic acid; 7. itaconic acid; 8. fumaric acid; 9. 2, 3-methysuccinic acid; 10. Thr; 11. 3-methylglutaric acid; 12. malic acid; 13. 4-AB; 14. xylitol; 15. homovanillic acid; 16. citric acid; 17. isocitric acid; 18. myo-inositol; 19. lactose.

2.2 表型差异分析

将原始数据导成cdf格式后, 经XCMS进行峰过滤、鉴定、匹配等处理导成峰表, 再经初步处理后, 导入SIMCA-P进行PLS-DA模型分析, 结果如图 2a、2c所示, 模型参数分别为R²Y=0.995, Q²=0.98; R²Y=0.974, Q²=0.933, 999次随机排列组合测试对模型进行验证, 结果显示模型没有过拟合, 说明模型是可靠的。从图 2a、2c可以看出野生型(W)与yfcC基因过表达菌株(Y+)及yfcC基因敲除菌株(Y-)均能得到很好的区分, 由此说明遗传改造后大肠杆菌的代谢表型发生了明显的变化。为了找出对表型区分有显著作用的物质, 综合S-plot和非参数显著性分析来筛选潜在的差异物质。S-plot图(图 2b、2d)中红色方框标注的VIP > 1的变量经非参数检验和伪错误率校正后, p值小于0.05的被认为是潜在的差异物质, 经NIST库检索及标准样品验证, 最终发现W与Y+间14种物质的代谢能力有明显的不同; W与Y-间分解代谢有显著差异的有16种物质, 结果见图 3。

图 2 W与yfcC基因敲除菌(Y-)的(a) PLS-DA得分图及(b)相应的S-plot图和W与yfcC基因过表达菌(Y+)的(c) PLS-DA得分图及(d)相应的S-plot图 Fig. 2 (a) PLS-DA score plot and (b) S-plot between W and yfcC deletion mutant E. coli (Y-) strains, (c) PLS-DA score plot and (d) S-plot between W and yfcC over-expression mutant E. coli (Y+) strains

图 3 W与(a) Y+和(b) Y-间有显著差异的物质 Fig. 3 Metabolites changed significantly between W and (a) Y+ or (b) Y-strains Data were shown as mean±SEM (standard error of mean) (n=9).

从图 3a可以看出Y+对甘氨酸的代谢能力强于W, 而对其他氨基酸的代谢能力较弱; 甘氨酸通过脱氨可转化成乙醛酸(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html), 可能是Y+中乙醛酸途径的加强促进了甘氨酸的分解利用^[17]。图 3a显示Y+对柠檬酸的分解利用能力强于W, 而对其他有机酸的分解能力均弱于W。同样图 3b显示Y-对丙氨酸、乳糖、肌醇和柠檬酸的代谢能力强于W, 而对其他物质的分解能力较弱。通过该方法同时检测细胞对各物质的分解代谢情况, 实现高通量的代谢表型分析, 可以为基因功能的研究提供新的考证资料, 促进未知基因功能的探索研究。

3 结论

本文建立了一种利用GC-MS技术高通量研究细胞代谢表型的分析方法, 通过该方法高通量表征菌株对各类能源物质分解利用能力的差异, 获得各菌株的表型特征, 为未知基因功能的探索提供新的研究资料。该方法也可用于研究不同菌株对环境中污染物的降解能力, 帮助筛选出高性能的菌株。相对于传统的利用理化性质或培养基的研究方法, 该方法更加简单、快速、高效。但是由于GC-MS检测技术的局限性, 该方法仅能用于易挥发、热稳定好的物质的分析, 对此, 今后的研究中可发展液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术来表征各物质的分解代谢差异, 结合GC-MS, 扩大物质的检测范围, 获得更多的细胞代谢表型, 进而促进该方法的应用。

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