数字核酸定量技术的迅速发展在精准定量方面已经展现出绝对的优势, 将被广泛应用于医疗卫生领域和基础研究中, 例如癌症早期诊断[1-4]、产前诊断[5]、单细胞分析[6]、病原菌检测[7]、食品安全[8]、高通量测序[9]、单核苷酸多态性[10]等领域。目前, 已经商品化的数字核酸定量技术为数字PCR芯片系统, 主要是液滴型和孔板型两种。孔板型以Life-Tech QuantStudioTM 3D数字PCR系统为代表, 液滴型以Bio-Red QX200微液滴数字PCR系统为代表。这些商业化的数字PCR反应系统均需特定仪器辅助进样或产生液滴，以及进行结果判读。仪器成本高, 且操作复杂, 不适用于普通实验室常规应用, 更难用于灾害现场即时诊断和条件落后的偏远地区。这两种商业化芯片的微反应个数都在20 000左右, 微反应的体积为纳升级。对于数字PCR来说, 随着微反应数量的增加, 其灵敏度、精确度和动态范围都会得到提高[11]。降低微反应的体积可以提高单拷贝检测效率, 降低污染, 增加通量, 降低试剂消耗[12]。
等温扩增技术作为另外一种核酸检测技术, 与PCR相比有简单快速、特异性强、灵敏度高、无需温度循环的优点[13], 终点检测可以利用浊度[14]和离子指示剂[15]颜色变化进行可视化检测, 也可通过核酸嵌入染料SG (SYBR GreenⅠ) 进行实时荧光检测。本研究组开发了一种等温多底物自配引发扩增技术(isothermal multiple self-matching-initiated amplification, IMSA)[16]。IMSA共有3对引物, 分别是一对外引物DsF/DsR, 一对内引物FIT/RIT和一对茎引物SteF/SteR, 其中外引物和内引物均是混合式引物。IMSA扩增可分为两个阶段:一是原始自我配对结构(self-matching structure, SMS) 的生成; 二是基于SMS的自我循环扩增(cycling amplification)。IMSA和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 均具有同样的优点:(1) 特异性强; (2) 灵敏度高; (3) 扩增效率高; (4) 结果易判读; (5) 可摆脱仪器, 适合现场检测; (6) 检测时间短。由于IMSA和LAMP的引物设计和扩增原理不同, IMSA的灵敏度比LAMP更高[16]。同时, IMSA体系中羟基萘酚蓝(hydroxynaphtholblue, HNB) 和SG的双荧光指示系统已被证明可用于微流控芯片, 且有比SG的单色荧光更好的指示性能[17]。
本文在本研究组前期研发的自吸式微流控芯片[18, 19]基础上设计了新的结构, 增加了反应小室的密度, 缩小了其体积, 大大增加了芯片单位面积的反应小室数量, 提高了芯片核酸定量的性能。并结合双荧光显色的IMSA反应系统[17], 开发了结合双荧光IMSA扩增的高密度皮升级微流控核酸定量芯片。芯片用多层软光刻技术制成, 以聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS) 和玻璃为材料。以HBV质粒为模板进行芯片上的定量测试, 实现了对模板的精确定量。本装置具有定量精确、灵敏、快捷、操作简单等优势, 可用于核酸精准定量检测。
MGL96G型PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司); Maestro Ex IN-VIVO IMAGING SYSTEM荧光成像仪(美国CRI Maestro公司); IX71型荧光倒置显微镜(日本Olympus公司); H94-25C型单面光刻机(中国四川南光公司); SU-8 2025及SU-8 3025负性光胶(美国MicroChem公司); PDMS (美国Dow Corning公司); 三甲基氯硅烷(中国阿拉丁公司); SYBR Green I及无核酸酶水(美国Life Technologies公司); 羟基萘酚蓝(HNB，商品目录号63451-35-4，中国Lemongreen公司); Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(8 U/ μL), dNTPs (10 mmol/L), MgSO4(100 mmol/L), 和10×等温扩增缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, 10 mmol/L (NH4)2SO4, 2 mmol/L MgSO4, 0.1%(v/v) Tween-20)(美国New England BioLabs公司); 甜菜碱(商品目录号107-43-7，英国Sigma-Aldrich公司); HBV质粒(中国生工公司)。
首先制作芯片模具。用Corel DRAWX4绘制芯片图形, 如图 1a所示。芯片模具采用多层软光刻技术制成。在干净的硅片上旋涂SU-8 3025, 厚度30 μm, 于95 ℃烘烤15 min。然后将有微通道图样的掩膜紧贴在光胶上, 紫外曝光20 s。再次升温至95 ℃, 保持5 min。旋涂SU-8 2025, 厚度90 μm, 于95 ℃烘烤25 min。将小室图样掩膜贴在光胶上, 利用对准设备将掩膜与已曝光的通道层图案对准。紫外照射34 s。于65 ℃和95 ℃分别烘烤3 min和12 min。最后, 将硅片浸泡在显影液中, 洗去未曝光的光胶。最后升温至250 ℃, 烘烤30 min, 将两次曝光图形融合。
芯片构成如图 1b所示。制作芯片前将模具在三甲基氯硅烷中浸泡5 min, 使模具表面硅烷化。首先制作空白层, 作为芯片的封底, 防止核酸吸附到盖玻片上。将PDMS单体(A) 和固化剂(B) 按照30 : 1(质量比, 下同) 混合均匀, 并真空脱气, 然后旋涂在干净的硅片上, 厚约50 μm, 于90 ℃固化20 min。配制质量比为5A : 1B的PDMS预聚物, 倾倒在模具上, 旋涂200 μm, 于90 ℃烘烤1 min固化, 为反应小室层。在反应小室层上旋涂一层纳米防蒸发层。将剩余的PDMS预聚物倒在纳米防蒸发层上, 于90 ℃固化1 h, 制作支撑层, 为反应小室提供负压, 并且有利于脱模。固化后, 纳米防蒸发层被嵌入支撑层和反应小室层中间, 3层融合成芯片主体。脱模, 打孔, 将芯片主体图案一面贴在空白层上, 于100 ℃烘烤40 min使两层PDMS融合。用等离子体处理空白层和干净的盖玻片, 进行贴合, 芯片组装完成。盖玻片用来维持负压状态下芯片的形状。最后配制10A : 1B的PDMS预聚物, 于90 ℃固化1 h, 制作真空储气层。将其贴在出样口处, 提供持续的负压将热凝固油相吸入通道, 封闭反应小室。
20 μL反应体系中含有2 μL 10×等温扩增缓冲液、0.2 μmol/L外引物DsF和DsR、0.8 μmol/L内引物FIT和RIT、1.6 μmol/L茎引物SteF和SteR、1.4 mmol/L dNTPs、8 U Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、0.8 mol/L甜菜碱、6 mmol/L MgSO4、0.4 μL 50× SYBR Green I和240 μmol/L HNB、2.0 μL稀释至1 000拷贝/ μL的HBV质粒, 剩余体积用无核酸酶水补齐。阴性对照用无核酸酶水代替模板。引物和模板序列参照文献[17]。
配制10 A : 1B的PDMS 1.1 g, 加入4 g硅油(50 cSt), 混匀真空脱气, 作为封闭小室的油相。将芯片表面用胶带贴合, 以延长负压保持时间。芯片真空脱气30 min后刺破进样口的胶带, 用移液器吸头将20 μL配制好的IMSA反应混合液加入进样孔。并将配制好的硅油加到反应液的上层。在负压的作用下, 反应液进入芯片, 精确分配到各个反应小室, 见图 2a。随后油相进入通道, 将通道中的反应液排出, 封闭小室, 见图 2b。最后将芯片的进口和出口封闭。
芯片在平板PCR仪上于62 ℃进行扩增反应, 反应时间60 min。扩增完成后分别在荧光成像仪和荧光倒置显微镜下检测芯片的反应结果。455 nm蓝光激发荧光, 发射光透过495 nm长波透镜, 通过电荷耦合元件(CCD, charge-coupled device) 图像传感器进行荧光图像和数据采集。用Image J软件分析荧光图像, 统计阳性扩增个数。利用泊松分布原理计算待检测目标的分子数目。
本文中的等温扩增芯片实际尺寸40 mm×55 mm, 厚度约3 mm。共有3个样品通道, 每个样品进入4个样品反应区, 共计12个反应区, 每个反应区有10 048个反应小室, 共有120 576个反应小室, 芯片反应室的密度达7 000个/cm2。每个小室的尺寸为50 μm×50 μm×120 μm, 反应体积为300 pL, 整张芯片的载样量为36 μL。根据Heyries等[12]在文献中给出的动态范围计算公式, 该芯片理论上可检测模板的动态范围为6个数量级, 可检测的最大模板量为1.13×106拷贝。芯片材料为PDMS和玻璃, 具有较好的透光性。芯片实物见图 3。
由于PDMS的气透性及长时间在62 ℃保温会引起反应液水分的蒸发, 少量的蒸发对于微量反应体系就可能造成严重结果。特别是反应区域边缘的小室, 蒸发尤为严重(见图 4a)。本文采用一种纳米防蒸发涂层嵌入到反应小室的上方, 防止蒸发。在整个反应过程中, 芯片内处于蒸发平衡。该纳米涂层可以在小室上方形成一层透过屏障, 从而有效阻断水蒸气的散失, 维持蒸发平衡, 达到抑制蒸发的目的(见图 4b)。
IMSA反应结束后, 分别使用IX71型荧光倒置显微镜和Maestro Ex IN-VIVO荧光成像仪进行荧光检测。SG在455 nm蓝色激发光下会发出绿色荧光, 最大发射波长为520 nm。经过等温IMSA反应后, 阳性小室的绿色荧光大幅增强。荧光显微镜下的结果如图 5a所示。亮绿色为含有模板的阳性扩增小室, 暗绿色为无模板的阴性小室。同时, 阳性反应小室与相邻阴性小室间荧光的差异明显, 说明热凝固油相有很好的封闭小室的作用, 并无交叉污染现象。
本实验中加入的HNB可实现荧光可视化检测。由于显微镜为窄带滤光片, HNB的红色荧光(最大发射波长为610 nm) 被过滤, 但是在荧光成像系统中呈现明显的双色荧光, 如图 5b所示。绿色小室为含目标片段的阳性扩增小室, 红色小室为不含目标片段的阴性小室, 因此可以通过颜色区分小室中是否含有模板, 实现可视化分辨。且荧光强度有明显的差异(见图 5c)。双荧光系统中, 阳性荧光的指示染料SG是一种核酸嵌入型荧光染料, 虽有双链选择性, 但由于等温扩增中的引物较多, 所以有明显的背景荧光, 需要加入较多的HNB以掩盖绿色荧光[17]。本研究组已经开发了一种双向置换荧光探针用以解决该问题[20], 已在96孔板上使用, 降低了背景荧光的强度, 有很好的反应效果。在微流控芯片上的效果尚待验证。
本文采用双荧光指示法, 由于HNB的存在, 含有模板的阳性小室扩增前为红色, 扩增后显示绿色, 而无模板的阴性小室一直为红色。因此在进行阳性小室计数时, 可以很容易根据颜色区分小室中是否含有待测模板, 与只有SG的单色荧光相比, 不需划定阈值。本文用稀释至1 000拷贝/ μL的HBV质粒作为模板, 检验芯片定量的准确性。图 6a是荧光成像系统采集的反应结果图像；图 6b为阴性对照, 反应区域中无阳性扩增, 全部呈现阴性。图 6中为一个反应区的图像, 有小室10 048个, 每个小室的反应体积为300 pL。该区域共有阳性亮点287个。另外3个区域的阳性亮点为858个。
核酸定量结果用泊松分布原理进行计算。泊松分布公式为P(n, λ)=λn/(eλ×n!), n为每个反应通道中的核酸分子数, λ为核酸分子数与反应小室数的比值, P为实际的阳性小室的比例, 即阳性小室与总反应小室的比值。在没有模板存在时, 泊松分布公式为P(n=0, λ)=1/eλ; 有模板存在时为P(n＞0, λ)=1-P(n=0, λ)=1-1/eλ。令阳性反应的小室个数为W, 本次反应中的核酸模板数为X。因此在本芯片上每个反应通道的P=W/40 192, λ=X/40 192。泊松分布公式变为W/40 192=1-1/eX/40 192, 所以每个反应通道中的核算模板的拷贝数X=-ln [(40 192-W)/40 192]×40 192。由于核酸分子随机性的分配, 一个阳性反应小室中可能含有不止一个拷贝的模板。因此该公式的意义在于将该反应通道中的模板分子数进行校正, 以得出准确数值。再根据小室个数、每个小室的体积以及稀释倍数计算出原始模板的浓度。本次反应计算出加入的模板浓度为946拷贝/ μL。在本文中用到的模板浓度用紫外分光光度法测定, 稀释至1 000拷贝/ μL。两者有差异的原因有可能是模板断裂、有杂质或稀释。针对该问题可利用其他核酸定量系统进行后续检测。
本文采用新的芯片结构, 设计制作的利用PDMS储存负压为动力的皮升级核酸精确定量微流控芯片实现了样品精确分配。随后热凝固油相将小室封闭, 进样过程无需泵和阀及其他仪器辅助, 扩增反应快速, 无需热循环, 并且具有可精确定量、便携、快捷、操作简单等优势。芯片采用的氟硅烷纳米涂层可以有效地阻止反应过程中水蒸气的散失, 保证了数字HBV-IMSA的正常进行, 实现了目标分子的精确定量。应用双荧光显色系统, 无需划定阈值, 可以通过颜色变化区分阴性和阳性小室, 降低了数据处理的难度。芯片上含有120 576个反应小室, 可以分成12个含有约10 000小室的区域, 一个普通PCR热板可同时满足两个芯片反应, 因此可以同时检测24个样本。本芯片不但可以实现精确定量和分子诊断, 而且增加了实验密度, 提高了通量, 促进了数字核酸定量芯片的应用。另外, 本研究组[21]已经研制出基于智能手机的便携式温控和图像采集平台, 如配合高分辨率CCD进行数据采集, 将极大地提高芯片在灾害现场和不发达地区的利用程度。
2017,
Vol. 35 Issue (3): 351-356
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