热纤梭菌(Clostridium thermocellum) 是一种嗜热厌氧菌, 属于革兰氏阳性细菌, 其分泌的纤维小体超分子酶系复合物是自然界中高效的纤维素降解系统, 因此热纤梭菌能够高效地降解纤维素底物, 进而生成乙醇以及多种有机酸等发酵产物, 可用于降解木质纤维素生产生物燃料^{[1, 2]}。近年来对热纤梭菌细胞新陈代谢的研究已被广泛关注, 分析细胞代谢物的某些成分, 特别是重要代谢物成分的检测, 对准确阐明新陈代谢的途径、揭示其代谢途径以及控制发酵过程, 进而从代谢工程角度改良菌种和优化发酵工艺条件具有重要的意义^[3]。

有机酸是一类在细胞代谢上极为重要的物质, 它们几乎参与细胞的所有生化过程。用于测定有机酸的方法很多, 如比色法^[4]、质谱联用技术^[5-8]、酶流动注射分析法^[9]、气相色谱法^[10-12]、毛细管电泳法^{[13, 14]}、高效液相色谱法^[15-17]以及其他色谱联用技术^{[18, 19]}等。然而, 由于酶具有专一性的特性, 酶流动注射分析不能同时分析多个有机酸; 部分有机酸沸点高, 难气化, 致使在用气相色谱对有机酸进行检测时需要对其进行衍生化; 虽然高效液相色谱法应用较为广泛且具有较好的灵敏度, 但预处理复杂、操作繁琐; 毛细管电泳能耗较低, 但却具有较高的检出限, 重复性不够理想。

与上述方法相比, 离子色谱法具有预处理简单、无需衍生化、操作简便、灵敏度高、选择性好等明显的优势, 已经成为分析有机酸的有效方法^[20]。然而, 苹果酸、琥珀酸等重要的代谢中间物在阴离子交换色谱柱上容易共洗脱, 对分析造成干扰。近期的研究发现, 高灵敏度的质谱检测器联用方法将会解决这些化合物的分析问题^[21]。而小尺寸的填料和柱子能够提高分离效果, 因此本实验采用毛细管离子交换色谱与质谱联用, 具有试剂消耗低、分离效率高、灵敏度高的优点^[22]。

本实验采用Capillary MAX-100G保护柱(50 mm×0.25 mm) 和Capillary MAX-100分析柱(150 mm×0.25 mm), 以KOH水溶液为流动相, 流速只有0.012 mL/min, 因此流动相进入质谱之前不需分流。该方法具有良好的线性关和较低的检出限, 灵敏度高, 重现性好, 可用于热纤梭杆菌发酵液中有机酸的测定, 也可用于组分相似的其他发酵液样品中低相对分子质量有机酸的检测。

1 实验部分

1.1 材料和试剂

有机酸标准品(丙酮酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、α -酮戊二酸、柠檬酸和异柠檬酸) 购于Sigma-Aldrich (美国)。甲醇(色谱级) 购于Burdick & Jackson (美国)。所有溶液由超纯水配制后经0.22 μ m微孔膜滤过滤。IC-RP离子色谱前处理柱(博纳艾杰尔科技公司)。

1.2 仪器设备

ICS-5000多功能色谱装置包括双泵(DP) 模块、抑制电导检测器/色谱(DC) 模块、淋洗液自动发生(EG) 模块、自动进样器(AS) 模块; LTQ XL质谱仪、ESI离子源(美国Thermo Fisher公司); Milli-Q^® Advantage A10超纯水制备仪(美国Millipore公司)。

1.3 色谱和质谱条件

色谱条件:所用离子色谱柱为Capillary MAX-100G保护柱(50 mm×0.25 mm) 和Capillary MAX-100分析柱(150 mm×0.25 mm)。以KOH水溶液作为流动相, 采用梯度洗脱。梯度洗脱程序为:0~8 min, 4.0 mmol/L; 8~30 min, 35.0 mmol/L; 30~45 min, 80.0 mmol/L; 45~50 min, 35.0 mmol/L; 50~55 min, 4.0 mmol/L。流速为0.012 mL/min, 进样体积为0.4 μ L, 柱温箱温度为30 ℃。外接水流速为0.02 mL/min。

质谱条件:喷雾电压为3.0 kV, 鞘气压强为2 000 kPa, 离子传输管温度为275 ℃。在选择离子监测(SIM) 模式下进行质谱分析。

1.4 样品前处理

取1 mL热纤梭菌发酵液置于2 mL塑料离心管中, 以6 000 r/min的速度离心5 min, 固体沉淀于离心管底。取适量上清液, 用水稀释100倍, 稀释液过IC-RP柱除去蛋白等有机杂质, 经0.22 μ m水相滤膜过滤待测。

1.5 标准溶液的配制

分别配制1.00 g/L的丙酮酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、α -酮戊二酸、柠檬酸和异柠檬酸储备液。用储备液配制成0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 mg/L的混合标准溶液。按不同质量浓度分别进样, 以峰面积对质量浓度绘制各组分的标准曲线。以5.00 mg/L的混合标准液重复进样8次, 计算峰面积的相对标准偏差(RSD)。以2.00、5.00和10.00 mg/L 3个质量浓度做样品的加标回收率试验。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化和选择

由表 1可知, 在100 mmol/L KOH、负离子模式条件下, 喷针电压小于3.5 kV时, 喷针电流较小。喷针电流过大可能会导致质谱离子源产生电火花, 损坏电路板。因此最优化的调谐文件参数为:喷雾电压为3.0 kV, 鞘气压强为2 000 kPa, 离子传输管温度为275 ℃。

表 1 (Table 1)

表 1 不同条件下喷雾电流的变化 Table 1 Changes of spray current under different conditions No. Spray voltage/kV Sheath gaspressure/kPa Capillary temperature/℃ Spray current/μA 1 1.5 500 200 0.05-0.13 2 2.0 1000 225 0.04-0.12 3 2.5 1500 250 0.05-0.15 4 3.0 1700 275 0.10-0.20 5 3.5 2000 290 0.10-0.19 6 4.0 2500 300 6.70-14.08

表 1 不同条件下喷雾电流的变化 Table 1 Changes of spray current under different conditions

2.2 旁路流速的优化

在进入质谱仪的ESI探针之前, 通过辅助泵将不同流速的甲醇泵入质谱, 以提高雾化效率。以2.0 mg/L的异柠檬酸为例, 当KOH溶液的流速为0.012 mL/min, 甲醇流速分别为0.01、0.02、0.10、0.20和0.40 mL/min时, 随着甲醇用量的增加, 质谱的灵敏度相应增加。然而甲醇用量的增加也会导致色谱峰的展宽。因此, 本试验以有机酸做标准品时, 为保证峰形, 采用直接进样方式。

2.3 分离度的改善

由图 1可知, 在本试验的色谱条件下, 苹果酸和琥珀酸共洗脱, 而通过质谱分析可以分别提取苹果酸和琥珀酸的分子离子峰, 大大提高了分离度。另外, 柠檬酸和异柠檬酸为同分异构体, 直接进行质谱分析时两种物质无法分开。而两个同分异构体进入质谱前能在离子色谱柱上分离开, 随后进入质谱进行鉴定, SIM模式下的提取离子色谱图上可以得到两个峰(如图 1所示), 说明同分异构体得到了很好的分离。

图 1

Fig. 1

图 1 8种有机酸标准品的提取离子色谱图 Fig. 1 Selected ion monitoring (SIM) chromatograms of eight organic acid standards Peak: 1. citric; 2. isocitrate; 3. fumaric; 4. α -ketoglutaric; 5. tartaric; 6. succinic; 7. malic; 8. pyruvic.

2.4 方法评价

分别测定0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、10.00、20.00和50.00 mg/L的标准溶液, 结果见表 2。线性相关系数为0.9696~0.9986; 1.00 mg/L标准混合物重复8次的相对标准偏差为1.45%~5.99%。标准溶液稀释后进样, 将信噪比为3时有机酸的含量确定为本方法的检出限。分别进行2.0、5.0和10.0 mg/L 3个水平的加标回收试验, 最终得到各种有机酸的平均加标回收率, 平均回收率为89.0%~110.0%, 结果见表 3。这说明本方法有很好的重现性和准确度。

表 2 (Table 2)

表 2 方法的相对标准偏差、相关系数、回归方程、线性范围和检出限 Table 2 Relative standard deviations (RSDs), correlation coefficients (r2), regression equations, linear ranges and limits of detection (LODs) of the method Compound RSD/% (n=8) r2(n=5) Regression equation Linear range/(mg/L) LOD/(mg/L) Pyruvic 4.40 0.9982 Y=4.58×104X-3.03×104 1.0-50.0 0.50 Succinic 5.99 0.9986 Y=2.91×104X-8.97×104 0.1-50.0 0.01 Malic 2.32 0.9913 Y=7.69×104X-4.84×104 0.1-50.0 0.01 Fumaric 1.72 0.9804 Y=6.61×104X-8.64×104 0.1-50.0 0.01 Tartaric 1.45 0.9891 Y=2.19×104X-9.23×104 0.5-50.0 0.05 α-Ketoglutaric 3.12 0.9953 Y=3.39×104X-2.00×104 0.2-50.0 0.02 Citric 5.48 0.9696 Y=4.81×104X-7.50×106 1.0-100.0 0.10 Isocitrate 5.90 0.9788 Y=6.53×104X-1.00×106 0.5-50.0 0.02 Y: peak area; X: mass concentration, mg/L

表 2 方法的相对标准偏差、相关系数、回归方程、线性范围和检出限 Table 2 Relative standard deviations (RSDs), correlation coefficients (r2), regression equations, linear ranges and limits of detection (LODs) of the method

表 3 (Table 3)

表 3 8种目标化合物在3个加标水平的回收率和相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs of the eight target compounds at three spiked levels (n=6) Compound 2.0 mg/L 5.0 mg/L 10.0 mg/L Average recovery/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Pyruvic 83.2 4.7 88.3 6.1 95.5 5.8 89.0 Succinic 99.3 4.6 95.6 5.3 99.1 4.8 98.0 Malic 83.6 5.2 89.1 6.4 85.4 5.7 86.0 Fumaric 110.0 7.3 98.1 6.5 98.0 7.5 102.0 Tartaric 112.0 6.8 107.4 8.7 110.5 7.3 110.0 α-Ketoglutaric 96.4 5.6 98.4 4.9 99.2 5.2 98.0 Citric 90.1 13.2 91.3 11.6 98.7 12.3 93.0 Isocitrate 108.0 9.4 105.0 8.5 102.0 11.3 105.0

表 3 8种目标化合物在3个加标水平的回收率和相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs of the eight target compounds at three spiked levels (n=6)

2.5 样品分析

利用所建立的方法对热纤梭菌的发酵液进行定性和定量分析。通过对样品色谱图的分析发现发酵液中主要含有的低相对分子质量有机酸为丙酮酸、苹果酸、琥珀酸和柠檬酸, 其质量浓度分别是122.48、105.78、48.76和51.77 mg/L。样品的色谱图见图 2。从谱图中可以看出, 所有检测到的有机酸都能很好地分开。

图 2

Fig. 2

图 2 样品的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the sample

3 结论

本文建立了毛细管离子色谱-串联质谱检测热纤梭杆菌发酵液中的低相对分子质量有机酸的方法。该方法准确可靠, 具有较高的灵敏度和较好的重现性, 实现了对热纤梭菌发酵液中多种低相对分子质量有机酸的同时快速、准确、高效分离检测, 并为与之类似的发酵液或其他样品中有机酸的定性和定量检测提供借鉴。为发酵工艺过程中技术监控和质量控制提供了有效的分析方法。

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