血浆在生命科学及临床医学领域具有重要的研究价值, 但血浆内蛋白质的组成复杂, 浓度动态范围宽。据文献[1, 2]报道, 血浆中前10种高丰度蛋白质占蛋白质总含量的90%, 前22种高丰度蛋白质占蛋白质总含量的99%, 而血浆中剩余几千种蛋白质仅占总含量的1%。但是, 血浆中具有重要生物学意义的蛋白质(如疾病生物标志物) 通常都是中低丰度蛋白质。因而, 降低血浆内蛋白质的复杂程度, 实现更多中低丰度蛋白质的鉴定成为血浆蛋白质组学研究领域的核心问题之一。Lomas等[3, 4]于2005年首次提出六肽库技术, Lomas与Righetti等[5]于2006年首次提出均衡器概念。这种技术以六肽作为配体, 通过六肽与蛋白质之间的特异性相互作用, 在高丰度蛋白质去除的同时实现低丰度蛋白质的富集。该技术以多孔聚羟基甲基丙烯酸酯颗粒为基质, 固载206种随机六肽组合库, 每一种基质颗粒上的六肽数量理论上可以达到约50 pmol, 因此具有适当体积的基质颗粒理论上包含了可与复杂蛋白质组任何蛋白质相互作用的六肽。但目前基于组合六肽库的均衡器技术还存在诸如有些蛋白质与六肽之间结合力弱、在中性条件下孵育蛋白质易损失等问题[6-9]。因此, 发展基于新型结合配基的全新蛋白质均衡器技术对于解决诸如血浆等复杂蛋白质组样品浓度动态分布宽的问题具有重要意义。
随机寡核苷酸文库是指数富集的配基系统进化(SELEX) 技术中使用的一种初始文库, 由多种单链DNA分子组成, 其DNA分子的序列一般由22~25个碱基的随机寡核苷酸链组成, 相当于该文库含有1014~1015种不同类型的随机寡核苷酸分子。随机寡核苷酸文库的库容量随着单链DNA分子长度的增加呈指数增加, 因此理论上样品中每种蛋白质都能够在该文库中找到与之特异性结合的寡核苷酸配基[10-12]。同时由于核苷酸分子同时含有磷酸根和碱基基团, 其能够在特定pH值环境中以两性离子的形式存在。因此如以随机寡核苷酸文库中的寡核苷酸作为蛋白质的识别分子, 理论上也能够降低血浆蛋白质组的样品复杂程度。
本文利用寡核苷酸与蛋白质之间存在的相互作用, 将随机寡核苷酸库修饰于磁性颗粒表面, 发展了基于随机寡核苷酸文库的新型血浆蛋白质样品预处理技术, 重点对寡核苷酸键合量、上样和洗脱条件、洗脱体系进行了考察。
亲和素修饰的磁性纳米颗粒(MNP, 1.05 μ m) 购自Invitrogen (美国)。生物素修饰的随机寡核苷酸文库(Random, ssDNA, 40 bp) 由大连宝生物公司合成。C8、C18分离填料(XBP, 5 μ m, 12 nm) 购自天津博纳艾杰尔公司。乙腈(ACN) 购自Merck公司(德国)。其他试剂均为分析纯。实验中使用的正常人血浆样本由大连医科大学附属第二医院提供, 并通过伦理委员会审核。采用CARY 60紫外可见分光光度计(Agilent Technologies) 对颗粒上随机寡核苷酸文库的键合量进行表征。
将亲和素修饰的磁性纳米颗粒(10 mg/mL, 1.5 mL) 重悬于Tris-HCl缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 2 mol/L NaCl, pH 7.4) 中, 磁铁辅助, 振荡洗涤3次后重悬于Tris-HCl缓冲液中。将生物素修饰的随机寡核苷酸文库(40 bp, 10 μ mol/L, 7.5 nmol溶于灭菌水中) 在90 ℃水浴锅中加热3 min, 静置至室温后加入磁球中, 室温条件下反应2 h。反应结束后去除上清, 进一步使用Tris-HCl缓冲液淋洗颗粒3次, 将颗粒分散于20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L CaCl2, pH 7.4) 中, 制得寡核苷酸文库修饰的磁性纳米颗粒(MNP@ssDNA)。收集反应后的上清液, 根据寡核苷酸在260 nm处的紫外吸收, 测定寡核苷酸文库在磁性纳米颗粒表面的键合量。
将血浆样品(50 mg/mL, 400 μ L) 加入600 μ L含有15 mg MNP@ssDNA的20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L CaCl2, pH 7.4) 中, 室温孵育2 h。平行孵育两份。为了充分洗脱磁颗粒上的蛋白质, 在使用孵育缓冲液洗涤颗粒之后, 考察两种洗脱体系对颗粒上蛋白质的洗脱效果。洗脱体系1采用2 mol/L NaCl、200 mmol/L Gly-HCl (pH 2.5)、4%(v/v) 十二烷基硫酸钠-二硫苏糖醇(SDS-DTT) 依次洗脱, 洗脱体系2采用200 mmol/L Gly-HCl (pH 2.5)、200 mmol/L NaOH、50%(v/v) ACN、4%(v/v) SDS-DTT依次洗脱。采用超滤辅助样品制备(FASP) 方法[13]处理4%(v/v) SDS-DTT洗脱组分, 去除SDS并完成酶解过程；其余的洗脱组分依次进行除盐、冻干、酶解步骤。胰蛋白酶按其与蛋白质1 : 30的质量比加入, 于37 ℃水浴中酶解16 h, 以甲酸终止酶解。体系1中的NaCl/Gly-HCl酶解液组分合并冻干分析, 体系2中的Gly-HCl/NaOH/ACN酶解液组分合并冻干分析。实验流程如图 1所示。
采用nano-RPLC-ESI-MS/MS分析实验中得到的酶解产物。采用实验室内填装的反相C18分离柱(16 cm×75 μ m, 3 μ m, 12 nm) 进行肽段的分离, 流速为300 nL/min。利用2%(v/v) ACN-0.1%(v/v) 甲酸(流动相A) 和98%(v/v) ACN-0.1%(v/v) 甲酸(流动相B) 进行梯度分离。分离梯度如下:0~5 min, 0~5%B; 5~95 min, 5%B~35%B; 95~100 min, 35%B~80%B; 100~110 min, 80%B。每个样品均重复分析3次。LTQ-XL质谱(Thermo Fisher Scientific, 美国) 采用正离子扫描模式, 碰撞能量为35%。一个MS与MS/MS扫描设置一个微扫描, 最大入注时间为30 ms。所有的MS和MS/MS谱图均采用数据依赖模式(data-dependent mode) 采集。质谱扫描范围为m/z 300~1 800(分辨率R=60 000, m/z 400), 全扫描中前9个最高峰进行MS/MS扫描, 其中动态排除设定为:重复次数为1, 重复容忍时间为30 s, 动态排除时间为60 s。
采用pXtract软件将raw文件转换成*. mgf格式文件。数据采用Mascot (2.4.0版本) 检索, 数据库为IPI_human_v3.87(91464 sequence)。采用Decoy库控制结果的假阳性率(FDR)。肽段质量偏差为±2 Da, MS/MS质量偏差为±1 Da, 静态修饰设置为半胱氨酸残基57.02 Da, 可变修饰设置为甲硫氨酸残基15.99 Da。胰酶最大漏切位点设置为2, 肽段电荷数设置为2+、3+、4+。采用P＜0.005、离子得分(Ion score)＞20处理数据库检索结果，以得到高度可信的蛋白质信息。
由于捕获到的蛋白质是通过与寡核苷酸之间的相互作用而获得, 因此颗粒表面寡核苷酸数量的多少对捕获到的蛋白质含量影响较大。根据寡核苷酸文库在磁性颗粒上键合前后的紫外吸收值, 计算磁性颗粒上寡核苷酸的键合量为500 pmol/mg。分别将5 mg和15 mg MNP@ssDNA颗粒与血浆样品在室温孵育2 h后, 采用NaCl溶液、Gly-HCl溶液洗脱结合的蛋白质, 利用C8反相色谱除盐的方法测定5 mg和15 mg MNP@ssDNA颗粒结合的蛋白质的质量分别为10.4 μ g和26.3 μ g。说明随着颗粒用量的增加, 蛋白质的结合量也随之增加, 有助于结合更多的蛋白质。
在SELEX技术筛选过程中, 将目标物与筛选的文库分离的主要方法是热处理或加入一些变性剂等洗脱试剂。为了有效洗脱MNP@ssDNA颗粒结合的蛋白质, 本研究中首先尝试采用多步洗脱方法, 破坏寡核苷酸与蛋白质之间的相互作用力。使用了两个洗脱体系, 分别是NaCl、Gly-HCl与SDS-DTT逐级洗脱的洗脱体系1和Gly-HCl、NaOH、ACN与SDS-DTT逐级洗脱的洗脱体系2。NaCl可以破坏蛋白质之间或蛋白质与配体之间的离子相互作用力; Gly-HCl主要破坏生物分子之间的亲和作用力[14]; SDS-DTT可以破坏疏水作用力与氢键作用力[15]; NaOH能够使双链DNA解离成单链DNA, 破坏DNA形成的空间结构从而释放相互作用的蛋白质; 在DNA结构中存在大量疏水的腺苷, ACN能够有效破坏蛋白质与DNA之间的疏水作用力。
首先采用C8反相色谱除盐的方法测定两种洗脱体系得到的蛋白质质量, 由于两种洗脱体系中的SDS-DTT组分都直接采用FASP方法进行了蛋白质酶解, 所测蛋白质含量不包括该组分。结果发现洗脱体系1获得26.4 μ g蛋白质, 洗脱体系2获得76.0 μ g蛋白质, 说明第二种洗脱体系具有更强的洗脱能力, 能够提高蛋白质的回收率。根据Candiano等[16]及Santucci等[17]的报道, 采用SDS-DTT洗脱体系处理商品化六肽库颗粒, 回收率在94%以上, 说明SDS-DTT体系具有很强的洗脱能力。本文中, 血浆样品(20 mg) 与MNP@ssDNA材料(15 mg) 共同孵育, 收集处理后的流穿组分和洗涤组分, 利用C8反相色谱柱方法计算15 mg MNP@ssDNA材料上蛋白质结合量, 结果约为100 μ g。计算可知洗脱体系1所得蛋白质回收率为26.4%, 洗脱体系2所得蛋白质回收率为76.0%。需要特别说明的是, 由于SDS会影响蛋白质含量的测定, 在计算该回收率时, 不包含SDS-DTT组分中的蛋白质, 如采用Gly-HCl、NaOH、ACN与SDS-DTT洗脱体系, 蛋白质的实际回收率大于76%。
通过一维纳升液相色谱-串联质谱分析, 对各洗脱体系条件下得到的各组分蛋白质进行鉴定。原始血浆样品以及洗脱体系1、2样品的蛋白质鉴定结果如表 1所示。与原始血浆中蛋白质的鉴定结果相比, 虽然两种洗脱体系条件下鉴定到的蛋白质数目没有增加, 但是在处理后的血浆样品中, 仅有41.6%和34.2%的蛋白质在原始血浆样品中被鉴定到。综合分析两种洗脱体系的蛋白质, 发现合并两种洗脱体系共鉴定到303个蛋白质, 仅有81个(26.7%) 蛋白质被两种体系共同鉴定到, 说明两种洗脱体系鉴定到的蛋白质存在很好的互补性。与未处理的血浆样品相比, MNP@ssDNA材料处理后的蛋白质鉴定数量提升了约29.5%。
如图 2所示, 在原始血浆鉴定到的234个蛋白质中, 仅有101个(43%) 蛋白质在处理后的样品中被鉴定到, 说明MNP@ssDNA材料处理血浆不仅可以提高蛋白质的鉴定数目, 还有效提高了蛋白质的鉴定覆盖度。对于商品化组合六肽库均衡器, 一次样品预处理的六肽库使用量通常为1~5 μ mol。但是, 由于本研究中使用的材料量有限, 寡核苷酸文库的使用量仅为7.5 nmol, 不到组合六肽库用量的1%, 使得捕获的蛋白质数量与种类受到一定的限制。我们认为进一步提高寡核苷酸文库的使用量会鉴定到更多蛋白质。
将每个洗脱体系鉴定到的蛋白质分别与原始血浆中鉴定到的蛋白质按等电点分布情况进行比较, 结果如图 3所示。进一步发现, MNP@ssDNA颗粒处理后的蛋白质中等电点在5.0以下和9.0以上的蛋白质比例有不同程度的提高, 而等电点在7.0到9.0之间的蛋白质比例降低, 如表 2所示。尤其是在洗脱体系2鉴定到的蛋白质中, 分别有11.8%和16.6%的蛋白质为酸性(pI＜5.0) 或者碱性(pI＞9.0) 蛋白质, 显著高于原始血浆(2.6%或9.8%)。这些结果说明, 与原始血浆样品相比, MNP@ssDNA材料处理血浆样品之后, 鉴定到的蛋白质等电点分布更加均匀。对于碱性蛋白质, 我们认为这可能与孵育缓冲液为中性条件有关, 因为DNA单链分子的等电点约为4~4.5, 在pH值为7.4的孵育溶液中表面静电荷呈现负电性状态, 而等电点较高的蛋白质会呈现正电性, 静电吸引作用造成这些蛋白质更容易在MNP@ssDNA颗粒上保留。但对于酸性蛋白质, 虽然寡核苷酸链与蛋白质之间静电吸引作用比较弱, 其他作用力如疏水作用、空间结构作用可能起到较大作用, 这种推测还有待进一步证实。
血浆样品中前10种高丰度蛋白质占到总蛋白质含量的90%。为了评价MNP@ssDNA颗粒对高丰度蛋白质的处理效果, 统计分析处理血浆样品前后前10种高丰度蛋白质的有效谱图占有率, 结果如表 3所示。可以发现与原始血浆样品相比, 经过MNP@ssDNA处理后, 洗脱体系1中9种蛋白质的谱图占有率降低，洗脱体系2中8种蛋白质的谱图占有率降低。总的来说, 血浆中前10种高丰度蛋白质的谱图占有率从处理前的31.82%, 分别降低到了21.31%(洗脱体系1) 和26.20%(洗脱体系2)。这些结果说明, 经过MNP@ssDNA处理之后, 血浆中前10种高丰度蛋白质对于中低丰度蛋白质的干扰有一定程度的降低。
血浆样品预处理的一个重要目的是实现低丰度蛋白质的鉴定, 在本研究中我们将血浆中质量浓度低于100 ng/mL的蛋白质定义为低丰度蛋白质。为了进一步研究MNP@ssDNA材料处理血浆样品后低丰度蛋白质的鉴定效果, 我们以公开发表的血浆低丰度蛋白质数据库为对照, 挖掘鉴定结果中的低丰度蛋白质信息, 血浆中蛋白质的浓度信息综合参考了Silva等[18]和Tu等[19]的报道。如表 4所示, 在原始血浆和MNP@ssDNA材料处理后的样品中分别鉴定到6和7个低丰度蛋白质。其中, 丰度最低的蛋白质为I型胶原C端端肽(collagen I c-terminal telopeptide), 其在血浆中的质量浓度约为0.29 ng/mL, 该蛋白质仅在MNP@ssDNA材料处理后被鉴定到。证明MNP@ssDNA策略能够为低丰度蛋白质的鉴定分析提供有效的途径。
基于生理条件下寡核苷酸与蛋白质之间的相互作用, 发展了一种以随机寡核苷酸文库为配基的新型蛋白质组样品预处理技术。考察了两种洗脱试剂体系对于蛋白质回收率的影响, 发现两种洗脱体系获得的蛋白质种类之间存在一定的互补性。与原始血浆相比, MNP@ssDNA材料处理后的蛋白质鉴定数目从234个提高到了303个。该方法不仅提高了蛋白质的鉴定数目, 也有效增加了血浆蛋白质组的覆盖度, 说明以随机寡核苷酸文库为配基的蛋白质组样品预处理技术有望实现血浆中的蛋白质深度覆盖分析。
2017,
Vol. 35 Issue (3): 280-285
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