色谱  2017, Vol. 35 Issue (3): 339-343   PDF    
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李玉娟
武广霞
欧婉露
孙欣欣
屈锋
毛细管区带电泳法考察牛凝血酶、核酸适配体与丹参活性分子间的相互作用
李玉娟 , 武广霞 , 欧婉露 , 孙欣欣 , 屈锋     
北京理工大学生命学院, 北京 100081
收稿日期：2016-10-09
基金项目：国家自然科学基金项目（81573693，21675012，21375008）
通讯联系人： 李玉娟, E-mail:lylyjlzh2006@163.com; 屈锋, E-mail:qufengqu@bit.edu.cn
摘要：采用毛细管区带电泳法（CZE）研究牛凝血酶（B-Thr）、凝血酶核酸适配体（Apt29）与丹参中3种活性物质（丹参素钠（SAS）、原儿茶酸（PA）、阿魏酸（FA））间的相互作用。电泳条件为：毛细管长度40 cm，紫外检测波长214 nm，分离电压15 kV，压力进样3.45 kPa，进样时间5 s。分别固定3种活性药物分子的浓度，改变B-Thr或Apt29的浓度，采用Scatchard方程和非特异性结合方程计算结合常数（Kb），表征药物分子和B-Thr或Apt29的相互作用大小。结果表明，PA与B-Thr结合能力最强，Kb为3.39×104L/mol，FA与B-Thr的Kb为1.05×104 L/mol，SAS与B-Thr未表现出结合能力；在与Apt29的相互作用的研究中显示，SAS基本未与Apt29结合，FA与Apt29结合能力强于PA与Apt29的结合能力，FA、PA与Apt29的Kb分别为1.48×104L/mol和1.32×104L/mol。该研究报道了丹参活性分子与B-Thr、Apt29的相互作用结果，可为核酸适配体（蛋白质）与中药分子相互作用的探索提供新方法，适配体与中药分子相互作用亦可为中药分子的靶点发现、靶向转运提供借鉴。
关键词： 毛细管区带电泳法     牛凝血酶     核酸适配体     丹参    
Investigation on interactions between bovine thrombin, aptamer and active components in Danshen by capillary zone electrophoresis
LI Yujuan, WU Guangxia, OU Wanlu, SUN Xinxin, QU Feng     
School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China
Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81573693, 21675012, 21375008)
Abstract: Investigation on interactions between bovine thrombin (B-Thr), aptamer29 (Apt29) and three active components (salvianic acid A sodium (SAS), protocatechuic acid (PA), ferulic acid (FA)) in Danshen was carried out by capillary zone electrophoresis (CZE). CZE conditions were as follows: capillary length of 40 cm, voltage of 15 kV, injection volume of 3.45 kPa, injection time of 5 s. By changing concentration of B-Thr or Apt29 with fixed levels of the three active components, binding constants (Kb) were calculated by Scatchard and non-specific binding equations to show interactions between B-Thr, Apt29 and the three active components. The results showed that PA had the strongest affinity to B-Thr with Kb 3.39×104L/mol. Kb between FA and B-Thr was 1.05×104 L/mol. SAS had no binding with B-Thr. FA showed stronger affinity with Apt29 than PA with Kb of 1.48×104 L/mol and 1.32×104 L/mol, respectively. The present study reported that interactions between the active constituents in Danshen and B-Thr/Apt29. New methods might be supplied for calculation of interactions between Apt (protein) and herbal drug molecules. And it could give insight for target discovery and delivery of herbal drug molecules.
Key words: capillary zone electrophoresis (CZE)     bovine thrombin (B-Thr)     aptamer (Apt29)     Danshen    

丹参是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge) 的干燥根和根茎, 具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦等功效[1], 因其富含多种酚酸类成分(如丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、原儿茶酸(protocatechuic acid, PA)、阿魏酸(ferulic acid, FA) 和咖啡酸等) 而对心血管系统具有良好的药理作用[2]。目前研究表明, 丹参的抗凝作用与改善血小板聚集和释放功能、溶解纤维蛋白原、抑制凝血酶活性等机制有关[3-5]。但是丹参中的有效成分是否直接作用于凝血酶从而发挥抑制作用, 还未见明确报道。

核酸适配体(aptamer, Apt) 是近年来新出现的识别分子与治疗分子, 是通过指数富集配基的系统进化技术, 从体外人工合成的大容量单链随机寡核苷酸文库中经过多轮筛选和富集获得的寡聚核苷酸(单链DNA或RNA)[6-8]。Apt在疾病治疗等相关药学领域显示出独特优势, 已广泛用于药物转运、靶点发现等研究[9-11]。已有的研究报道了两个凝血酶核酸适配体抑制剂, 其中一条是含有29个碱基的人凝血酶核酸适配体(5′-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3′, Apt29), 作用于凝血酶的肝素结合位点, 从而抑制凝血酶的活性[12-14]。

目前药物分子和蛋白质间相互作用的研究策略及方法(如毛细管电泳法、微透析与液相色谱-质谱联用法、光谱法等)[15-19]为中药分子靶蛋白质及作用靶点的发现提供了可借鉴的技术方法[20-24], 然而迄今未见丹参有效单体分子与凝血酶和凝血酶核酸适配体相互作用的研究报道。本研究采用毛细管区带电泳法(capillary zone electrophoresis, CZE) 研究丹参有效单体分子与凝血酶之间的相互作用, 以期为抗凝血靶点发现与识别提供有效信息。同时, 研究丹参有效单体分子和凝血酶核酸适配体间的相互作用, 为凝血酶核酸适配体是否能够靶向转运丹参有效单体分子、揭示潜在作用靶点等提供基础研究数据。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

Agilent 7100毛细管电泳系统, 配二极管阵列(DAD) UV-VIS检测器、ChemStation B.04.03工作站(美国安捷伦科技有限公司); 熔融石英毛细管(总长48.5 cm，有效长度40 cm，内径75 μ m，凯利奥拉色谱分析(河北邯郸) 有限公司)。

丹参素钠(salvianic acid A sodium, SAS)、FA、PA对照品(纯度＞99.9%, 上海友思生物技术有限公司, 化学结构见图 1); 氢氧化钠(NaOH)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸(HCl)、氯化钾(KCl)、十水合四硼酸钠(Na2B4O7\510H2O)、硼酸(H3BO3)(分析纯, 北京化工厂); 牛凝血酶(B-Thr, 美国Sigma Aldrich公司); Apt29(上海生工生物工程有限公司); 实验用水为蒸馏水。

图 1 SAS、PA和FA的化学结构式 Fig. 1 Chemical structures of SAS, PA and FA
1.2 溶液的配制
1.2.1 对照品储备液

分别精密称取5.0 mg SAS、FA、PA对照品, 置于5 mL容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 配制成质量浓度为1 g/L的SAS、FA、PA对照品储备液。使用时逐级稀释并配制成0.2 g/L SAS、0.1 g/L FA和0.1 g/L PA工作液。

1.2.2 适配体和蛋白质溶液

用适量蒸馏水溶解Apt29, 以3 000 r/min离心5 min, 于94 ℃变性5 min后, 于室温下缓慢冷却, 静置过夜, 得到浓度为0.1 mmol/L的Apt29储备液。精密称取4.0 mg B-Thr, 加入1 mL蒸馏水, 配制成浓度为0.1 mmol/L的B-Thr储备液。使用时将上述两种储备液逐级稀释至所需浓度。

1.2.3 电解质溶液

称取1.2 g Tris于100 mL容量瓶中, 用蒸馏水定容, 配制成0.1 mol/L Tris溶液。将50 mL 0.1 mol/L Tris、14.7 mL 0.1 mol/L HCl、5 mL 0.2 mol/L KCl溶液混合后, 用蒸馏水稀释至100 mL, 配制成含10 mmol/L KCl的Tris-HCl电解质溶液(pH 8.5), 经0.22 μ m微孔滤膜过滤、超声脱气后, 备用。

称取1.9 g Na2B4O7\510H2O和1.2 g H3BO3, 分别用100 mL蒸馏水溶解，将溶解后的Na2B4O7\510H2O溶液和H3BO3溶液按体积比3 : 2混合后, 稀释4倍, 配制成12.5 mmol/L Na2B4O7-50 mmol/L H3BO3电解质溶液(pH 8.5), 用0.22 μ m微孔滤膜(水系) 过滤, 超声脱气, 备用。

1.2.4 样品溶液

将SAS、PA、FA与B-Thr溶液(或Apt29溶液) 混合, 于25 ℃水浴中孵育30 min后, 仪器分析。

1.3 毛细管电泳条件

样品中有SAS、FA时, 运行含10 mmol/L KCl的Tris-HCl (0.05 mol/L, pH 8.5) 电解质溶液; 样品中有PA时, 运行12.5 mmol/L Na2B4O7-50 mmol/L H3BO3电解质溶液(pH 8.5);电解质溶液使用前经0.45 μ m微孔滤膜过滤。分离电压为15 kV; 分离温度为15 ℃; 检测波长为214 nm; 进样压力为3.45 kPa; 进样时间为5 s。

毛细管在使用前分别用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH和蒸馏水冲洗30 min; 两次进样中间, 分别用0.1 mol/L NaOH、蒸馏水和电解质溶液冲洗毛细管3 min。毛细管超过24 h不用时, 需两端水封，于室温下保存。

1.4 结合常数的计算

根据游离药物分子的浓度, 利用Scatchard方程[25]和非特异性结合方程[25]求算结合常数(Kb，L/mol), 从而判断丹参有效单体分子与B-Thr (或Apt29) 的相互作用。其中Scatchard方程用于结合较强的特异性相互作用; 当相互作用较弱时, 则采用非特异性结合方程计算。

Scatchard方程公式如下:

(1)

其中，n为结合位点数量, Cf为游离配体(受体) 的浓度(mol/L), r为结合的配体(或受体) 与受体(或配体) 的浓度比。本实验中r是结合的药物与适配体的浓度比, Cf是游离药物的浓度。

非特异性结合方程公式如下:

(2)

Cb:结合药物的浓度(mol/L); Cp:蛋白质的浓度(mol/L); Cu:游离药物的浓度(mol/L)。

2 结果与讨论
2.1 丹参有效单体分子与B-Thr相互作用

将已知浓度的丹参有效单体分子(SAS、PA、FA) 分别与不同浓度(0~15.0 μmol/L) 的B-Thr混合, 利用毛细管区带电泳法测定混合溶液中游离的SAS、PA、FA浓度，对应的毛细管电泳图见图 2, 其中已结合的SAS、PA和FA浓度见图 3。

图 2 与不同浓度(0~15.0 μmol/L) B-Thr孵育后(a) SAS、(b) PA和(c) FA化合物的毛细管电泳图 Fig. 2 Capillary electropherograms of (a) SAS, (b) PA and (c) FA incubated with different concentrations of bovine thrombin (B-Thr) The concentrations of SAS, PA and FA are 227.1, 162 and 257 μmol/L.

图 3 B-Thr浓度对结合SAS、PA和FA浓度的影响 Fig. 3 Effects of B-Thr levels on concentrations of combined SAS, PA and FA

随着B-Thr浓度的增加, SAS的峰面积几乎没有变化(见图 2a), 已结合的SAS浓度也没有明显变化(见图 3), 说明本实验条件下, SAS与B-Thr没有显著性结合作用。同样方法考察PA、FA与B-Thr间的相互作用, 随着B-Thr浓度的增加(2.5~7.5 μmol/L), PA的峰面积逐渐降低(见图 2b), 已结合的PA浓度明显增加(见图 3), 说明在2.5~7.5 μmol/L范围内，PA与B-Thr间有明显的相互作用，

当B-Thr浓度高于10 μmol/L时, PA的色谱峰明显展宽; FA的峰面积随着B-Thr浓度的增加而降低, 且峰形稳定(见图 2c), 已结合的FA浓度明显增加(见图 3), 说明在2.5~15.0 μmol/L范围内，FA与B-Thr间有明显的相互作用。

计算各分子与B-Thr的结合常数时, 做出的Scatchard曲线斜率为正, 与常规曲线的负斜率趋势相反。根据Shibukawa[26]报道, 这种现象属于非特异性结合, 应采用公式(2) 计算各分子与B-Thr的结合常数[27, 28]。通过公式2，计算得到PA、FA与B-Thr相互作用的Kb分别为3.39×104 L/mol和1.05×104 L/mol，表明PA与B-Thr的相互作用略强于FA与B-Thr的相互作用。

2.2 B-Thr和丹参有效单体分子相互作用与化学结构关系

药物分子与蛋白质间相互作用的强弱与药物分子的化学结构有着密切的关系[29, 30]。SAS和PA都具有邻二羟基苯酸结构, SAS的C1上2′-羟基丙酸钠侧链较PA的C1上的甲酸基侧链长, 烷基侧链的延长使π-π共轭体系缩短, 破坏了药物的平面结构。SAS与B-Thr结合作用微弱, 而PA与B-Thr的结合作用较强, 说明药物分子形成的平面结构有利于其与蛋白质的相互结合。同时，凝血酶肝素结合位点由精氨酸126(Arg126)、赖氨酸236(Lys236)、Lys240和Arg93的侧链构成了带正电的凹槽[30], PA上的羧基解离带负电, 可与正电凹槽结合，这可能是其与B-Thr结合作用最强的关键因素。FA与B-Thr的结合常数介于SAS与PA之间, FA分子共轭体系较PA长, C3上的-OH被-OCH3取代。影响结合的因素可能有:FA中苯环与C1侧链形成较长的共轭体系, 增大了药物分子的体积, 干扰FA与B-Thr的结合; -OCH3的取代增加了苯环的空间位阻, 羟基消失对结合作用影响不大。以上结果显示, 丹参中多酚酸药物分子的苯环与苯环侧链是否构成π-π共轭体系及共轭体系的长度、苯环上取代基的种类和数量等均影响酚酸类化合物与凝血酶的结合。

2.3 丹参有效单体分子与Apt29相互作用

将已知浓度的丹参有效单体分子溶液分别与不同浓度(0~10 μmol/L) 的Apt29混合, 利用毛细管区带电泳法测定混合溶液中游离的SAS、PA、FA浓度(见图 4)，已结合的SAS、PA和FA浓度见图 5。

图 4 与不同浓度(0~10.0 μmol/L) Apt29孵育后(a) SAS、(b) PA和(c) FA化合物的毛细管电泳图 Fig. 4 Capillary electropherograms of (a) SAS, (b) PA and (c) FA incubated with different concentrations of aptamer29 (Apt29) (0-10.0 μmol/L) The concentrations of SAS, PA and FA are 227.1, 162 and 257 μmol/L.

图 5 Apt29浓度对结合SAS、PA和FA浓度的影响 Fig. 5 Effects of Apt29 levels on concentrations of combined SAS, PA and FA

随着Apt29浓度的增加, SAS的峰面积呈无规律轻微波动(见图 4a), 已结合的SAS浓度同样呈无规律变化(见图 5), 说明SAS与Apt29没有明显的结合作用; 随着Apt29浓度的增加, PA的峰面积逐渐降低(见图 4b), 已结合的PA浓度逐渐增加(见图 5)，说明PA与Apt29间存在结合作用; FA的峰面积随着Apt29浓度的增加而降低, 且峰形稳定(见图 4c), 已结合的FA浓度逐渐增加(见图 5), 揭示FA与Apt29有明显的相互作用。

求算PA、FA与Apt29的Kb时, 用Scatchard方法作图，得到的曲线斜率为正, 与常规曲线负值斜率趋势相反, 说明PA、FA与Apt29的结合是非特异性结合作用。利用公式(2) 计算，得到PA、FA与Apt29相互作用的Kb, 分别为1.32×104 L/mol和1.48×104 L/mol，结果表明，FA与Apt29结合能力强于PA与Apt29的相互作用。

2.4 Apt29和丹参有效单体分子的相互作用与化学结构关系

已有文献[10-13]报道, 具有G四链体结构的核酸(quadruplex DNA) 与具有苯平面共轭结构的分子的结合作用较强。FA、PA分子存在π-π共轭体系, 能够形成平面结构, 增强Apt29与酚酸类药物的结合。此外, CZE表征药物和适配体相互作用时, 电解质溶液中含有Na+, Na+能够促进Apt29形成二级结构, 增强了Apt29与药物分子的结合作用。

3 结论

本文基于毛细管区带电泳法研究了丹参中3种有效单体分子SAS、PA、FA分别与B-Thr和Apt29间的相互作用。丹参有效单体分子与凝血酶间的结合作用, 或对有效单体是否作用于凝血酶的部分位点提供基础研究数据。丹参有效单体分子与适配体间较强的结合作用, 或使核酸适配体成为有效单体分子向凝血酶转运的工具。有效单体分子若能抑制凝血酶, 同时结合凝血酶核酸适配体特异性抑制凝血酶的能力, 亦或为中西药联合治疗提供科学依据。

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