功能化介孔硅材料的合成及其对富含裸露组氨酸蛋白质的选择性吸附


扩展功能
	加入收藏夹

	复制引文信息

	加入引用管理器

	Email Alert

	RSS
本文作者相关文章
	王娇娇

	杨霞霞

	刘晓燕

	张海霞

王娇娇¹ , 杨霞霞¹ , 刘晓燕^1,2 , 张海霞^1,2

1. 兰州大学化学化工学院, 甘肃兰州 730000;
2. 兰州大学中卫高新技术研究院, 宁夏中卫 755000

收稿日期：2016-10-09

基金项目：国家自然科学基金项目（21105039，21375052）

通讯联系人：刘晓燕, Tel:(0931)8912510, E-mail:liuxiaoy@lzu.edu.cn

摘要：通过自由基聚合反应合成了具有高比表面积的介孔硅（PPOSS），并对其表面进行修饰和铜离子（Cu²⁺）的固定，最终得到功能化介孔硅材料（PPOSS-IDA-Cu²⁺），然后利用PPOSS-IDA-Cu²⁺中的Cu²⁺与蛋白质裸露组氨酸的螯合作用，选择性吸附富含裸露组氨酸的蛋白质。对牛血红蛋白、牛血清白蛋白、肌红蛋白和溶菌酶的吸附结果表明，所合成的PPOSS-IDA-Cu²⁺材料对富含组氨酸的牛血红蛋白有较好的吸附选择性和较大的吸附容量（3150 mg/g），并且有望与其他材料联合使用，以检测到更多相对丰度较低的蛋白质，丰富人类蛋白质组学信息，为疾病的临床诊断及病理研究提供帮助。

关键词：自由基聚合介孔硅聚多面体低聚倍半硅氧烷-亚氨基二乙酸-Cu²⁺ 裸露组氨酸牛血红蛋白

Synthesis of functional mesoporous silica and selective adsorption of surface-exposed histidine proteins

WANG Jiaojiao¹, YANG Xiaxia¹, LIU Xiaoyan^1,2, ZHANG Haixia^1,2

1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;
2. Zhongwei High Technology Research Institute of Lanzhou University, Zhongwei 755000, China

Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21105039, 21375052)

Abstract: The Cu²⁺immobilized mesoporous silica particles (PPOSS-IDA-Cu²⁺) were fabricated. The prepared materials were applied to the highly specific separation of surface-exposed histidine proteins, based on immobilized metal ion affinity chromatography. The adsorption experiments of bovine serum albumin, myoglobin, lysozyme and bovine hemoglobin (BHb) exhibited that PPOSS-IDA-Cu²⁺ had excellent performance in the separation of protein BHb. The maximum binding capacity of the proposed materials for BHb was 3150 mg/g. The results also demonstrated that PPOSS-IDA-Cu²⁺ had potential application in removing highly abundant proteins in proteomic analysis, and can be combined with other techniques to get more information on low abundant proteins.

Key words: free-radical polymerization mesoporous silica particles polymeric polyhedral oligomeric silsesquioxane-iminodiacetic acid-Cu²⁺ (PPOSS-IDA-Cu²⁺) surface-exposed histidine bovine hemoglobin (BHb)

蛋白质是生物体的重要组成成分, 在各项生命活动中起着至关重要的作用, 甚至是某些疾病的生物标记物, 但是同一样品中不同种类蛋白质的含量差异较大, 这使得相对丰度较低的蛋白质的检测十分困难^[1]。

为解决上述问题, 研究者基于蛋白质的物理化学性质, 设计并合成了各种类型的吸附材料, 其中基于金属离子(如铜离子(Cu²⁺)^[2-5]、镍离子^{[6, 7]}) 与蛋白质表面裸露组氨酸的螯合作用的材料被广泛用于选择性去除或富集富含组氨酸的蛋白质^{[4, 7]}。因此, 发展合成过程简单、吸附容量大、适用范围广及选择性好的检测蛋白质的方法具有重要的研究意义。

多面体低聚倍半硅氧烷(POSS) 具有笼型分子结构, 被视为最小的二氧化硅粒子, 一般每个分子中含有8、10或12个硅原子, 每个硅原子可以通过化学方法修饰各种官能团, 是制备有机无机杂化材料常用的功能单体或交联剂^{[8, 9]}。近几年, 研究者们运用POSS及其衍生物发展了多种新型杂化材料, 这些材料通常具有较好的疏水性^{[10, 11]}、生物相容性^{[12, 13]}、渗透率^[14]和传质效率^[15]。

本文通过热引发的八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷(OvPOSS) 的自由基聚合, 合成了多孔的高比表面积的介孔硅(PPOSS), 经过后修饰, 螯合上Cu²⁺, 形成Cu²⁺螯合介孔硅(PPOSS-IDA-Cu²⁺), 并运用原子吸收和比表面积、孔径测试对其组成和形貌进行了表征, 同时测定了材料对含有不同裸露组氨酸蛋白质的吸附情况。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Varian 210高效液相色谱仪(配有Varian 325紫外检测器、StarWS色谱工作站)、AA240原子吸收光谱仪(美国Varian公司); TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司); SHA-C恒温水浴振荡器(常州国华电器有限公司); YJ03-043-4000型电动离心沉淀机(天津医疗器械厂); Tristar 3000全自动比表面积及空隙度测定仪(美国Micromeritics公司)。

牛血清白蛋白(BSA, ≥98%)、牛血红蛋白(BHb, ≥98%)、溶菌酶(Lyz, 超纯级)、肌红蛋白(Mb, ≥95%) 均购自北京拜尔迪生物技术有限公司; 聚乙二醇200(PEG 200)、亚氨基二乙酸(IDA) 购自天津阿法埃莎化学有限公司; 偶氮二异丁腈(AIBN) 购自天津市越丰化学品有限公司; 乙烯基三氯硅烷购自上海萨恩化学技术有限公司; 30%(质量分数) 过氧化氢购自天津市北辰方正试剂厂; 五水合硫酸铜购自四川西陇化工有限公司; 氢氧化钾购自成都市科龙化工试剂厂; 乙酸购自天津利安隆博华公司。实验过程中使用的水均由超纯水系统(ALH-6000-U, 美国Aquapro公司) 制备。其他试剂(分析纯) 均购自天津市光复精细化工研究所。

1.2 功能化介孔硅材料的合成

1.2.1 PPOSS的制备

根据文献[16]报道的方法合成OvPOSS, 具体过程如下:在500 mL的烧瓶中加入20 mL乙烯基三氯硅烷和200 mL丙酮, 在氮气保护下缓慢滴加70 mL超纯水, 冷凝回流72 h, 此时溶液变成深红褐色, 同时析出白色固体, 抽滤溶液, 并用丙酮将固体洗至纯白色, 最终得到2.2 g白色粉末。

通过热引发的自由基聚合反应制备PPOSS^[17], 具体步骤如下:称取1.2 g OvPOSS, 置于20 mL小瓶中, 加入4.05 mL四氢呋喃、1.06 mL PEG 200和0.192 g AIBN, 超声1.0 min, 混合均匀, 通氮气2.0 min, 密封, 于60 ℃反应24 h。将得到的半透明晶体材料用四氢呋喃索氏提取24 h, 于60 ℃真空干燥12 h, 研磨, 所得材料即为PPOSS。

1.2.2 PPOSS表面环氧基官能团的修饰

向2.0 g PPOSS材料中加入60 mL氯仿、40 mL醋酸、2.0 mL浓硫酸, 缓慢滴加90 mL 30%(质量分数) 双氧水, 于70 ℃搅拌反应8.0 h, 过滤, 并用超纯水洗至溶液呈中性, 于60 ℃真空干燥12 h。

1.2.3 PPOSS-IDA-Cu²⁺的合成

对PPOSS表面进行IDA的功能化修饰^[18]。具体过程如下:称取2.4 g IDA (按照OvPOSS中的双键量换算以确保充分反应) 和2.1 g KOH (n_IDA: n_KOH=1 : 2), 加入150 mL超纯水后, 加入1.4 g 1.2.2节合成的材料, 于65 ℃下反应8 h, 过滤，并用超纯水除去过量的IDA, 于60 ℃真空干燥12 h, 所制备的材料命名为PPOSS-IDA。

称取1.5 g PPOSS-IDA，分散于150 mL 100 mmol/L硫酸铜的磷酸盐缓冲溶液(10 mmol/L, pH 7.4) 中, 于室温下搅拌2.0 h, 用超纯水洗至滤液无色后, 于60 ℃真空干燥, 所得材料即为PPOSS-IDA-Cu²⁺。具体合成方法见图 1。

图 1 PPOSS-IDA-Cu²⁺材料的合成示意图 Fig. 1 Schematic diagram of synthesis of PPOSS-IDA-Cu²⁺ AIBN: 2, 2′-azobis (2-methylpropionitrile); THF: tetrahydrofuran; IDA: iminodiacetic acid; PPOSS: polymeric polyhedral oligomeric silsesquioxane; PPOSS-IDA-Cu²⁺: polymeric polyhedral oligomeric silsesquioxane-iminodiacetic acid-Cu²⁺.

1.3 组氨酸蛋白质浓度和吸附量的测定

称取5.0 mg PPOSS-IDA-Cu²⁺, 分别加入5.0 mL BHb、BSA、Mb或Lyz水溶液, 于25 ℃下摇床振荡240 min后, 以6 580 g离心5 min, 移取上清液, 用考马斯亮蓝显色后, 测定其在595 nm处的吸光度, 根据公式(1) 和公式(2) 计算溶液中剩余蛋白质的浓度(C, mg/mL) 和吸附量(Q, mg/g), 具体公式如下:

(1)

(2)

其中, A₀、A分别为吸附前、后溶液的吸光度; C₀、C分别为吸附前、后蛋白质的浓度(mg/mL); V为蛋白质溶液的体积(mL); m为所用材料的质量(g), 本实验将材料质量均固定为5.0 mg。

1.4 色谱条件

色谱柱:TSK-GEL G3000SW_xL (300 mm×7.8 mm; 粒度:5 μ m; 孔径:25 nm); 流动相:含有0.05%(质量分数) 叠氮化钠-0.1 mol/L硫酸钠-0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.7);等度洗脱; 流速:0.8 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 PPOSS-IDA-Cu²⁺的表征

未经研磨的PPOSS的照片见图 2。可以看出, 由热引发OvPOSS自由基聚合生成的PPOSS材料呈刚性半透明状晶体。对PPOSS材料进行氮气吸附实验, 结果表明, PPOSS材料具有较大的比表面积(837 m²/g), 孔径为5.27 nm。该PPOSS材料的孔径与BHb、BSA、Mb和Lyz蛋白质分子的尺寸接近(见表 1), 适于本实验目标蛋白质的分离。当PPOSS材料与目标蛋白质接触时, 蛋白质表面裸露的组氨酸与PPOSS材料表面的Cu²⁺进行络合, 从而进行富含组氨酸蛋白质的选择性吸附。当然, 部分尺寸较小的蛋白质(如Mb, Lyz) 也可以通过物理吸附作用进入到PPOSS材料的孔内。

图 2 未经研磨的PPOSS的照片 Fig. 2 Photograph of PPOSS without grinding

表 1 目标蛋白质的物理性质 Table 1 Physical properties of target proteins

PPOSS材料和PPOSS-IDA-Cu²⁺的亲水性测试照片见图 3。将水滴到未经修饰的PPOSS材料上时, 其依然保持水滴状(见图 3a), 说明其有较强的疏水性; 而将水滴到经过修饰的PPOSS-IDA-Cu²⁺材料上时, 水滴迅速在材料表面扩散(见图 3b), 这是因为IDA的引入, 大大增强了PPOSS-IDA-Cu²⁺材料的亲水性, 说明PPOSS-IDA-Cu²⁺材料经过功能化修饰后, 其表面性质发生了较大改变。

图 3 将水滴加到(a) PPOSS和(b) PPOSS-IDA-Cu²⁺材料表面的照片 Fig. 3 Photographs of (a) PPOSS and (b) PPOSS-IDA-Cu²⁺ dropped pure water

此外, 采用原子吸收法测定PPOSS-IDA-Cu²⁺材料络合Cu²⁺的含量, 为70.56 mg/g, 进一步表明其修饰成功, 有助于提高材料的吸附量和选择性。

2.2 吸附时间对吸附量的影响

因BHb中含有的裸露组氨酸个数较多，因此本实验考察了PPOSS-IDA-Cu²⁺在不同的吸附时间(10、20、40、60、90、120、180、240和300 min) 下对其吸附量的影响(见图 4)。结果表明, 随着吸附时间的增加, PPOSS-IDA-Cu²⁺对BHb的吸附量逐渐增大, 前120 min, PPOSS-IDA-Cu²⁺材料对BHb的吸附速度较快, 其吸附量可以达到饱和吸附量的85%;当吸附时间为240 min时, 材料对BHb的吸附达到平衡。因此将吸附时间设为240 min。

图 4 不同吸附时间对BHb吸附量的影响 Fig. 4 Effect of incubation time on adsorption capacity of BHb Experimental conditions: 5.0 mL 4.0 mg/mL BHb; 5.0 mg PPOSS-IDA-Cu²⁺.

2.3 蛋白质浓度对吸附量的影响

本实验考察了在不同蛋白质含量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL) 下, PPOSS-IDA-Cu²⁺对4种蛋白质吸附量的影响(见图 5)。可以看出, PPOSS-IDA-Cu²⁺材料对BHb、BSA、Mb和Lyz的最大吸附量的顺序为:BHb＞Mb≈BSA＞Lyz, 这与蛋白质表面裸露组氨酸个数的多少一致(见表 1), 表明PPOSS-IDA-Cu²⁺材料对4种蛋白质的吸附主要是通过蛋白质表面裸露组氨酸残基与Cu²⁺的螯合作用实现的。

图 5 蛋白质含量对4种蛋白质吸附量的影响 Fig. 5 Effect of content of the four species of proteins on adsorption capacity Experimental conditions: volume, 5.0 mL; PPOSS-IDA-Cu²⁺: 5.0 mg; incubation time: 240 min.

为进一步考察PPOSS-IDA-Cu²⁺材料对蛋白质的吸附机理, 测定了PPOSS-IDA和PPOSS-IDA-Cu²⁺对BHb的吸附情况。结果显示, PPOSS-IDA对4 mg/mL BHb的吸附量为70 mg/g, 远小于相同条件下PPOSS-IDA-Cu²⁺对BHb的吸附量(3 150 mg/g)。证明PPOSS-IDA-Cu²⁺材料与蛋白质间的作用主要是Cu²⁺与蛋白质表面组氨酸残基的螯合作用。

3 结论

本文通过热引发的自由基聚合反应合成了具有高比表面积的PPOSS, 通过后修饰, 嫁接上IDA, 并螯合固定Cu²⁺, 用于选择性吸附含有裸露组氨酸的蛋白质。合成的PPOSS-IDA-Cu²⁺材料对富含裸露组氨酸的蛋白质有较好的选择性和较大的吸附容量, 有望与其他蛋白质吸附材料联合使用, 在去除相对丰度较高的蛋白质和富集相对丰度较低的蛋白质中发挥作用, 为人类提供更多有意义的蛋白质信息。

参考文献

[1]	Fang X M, Zhang W W. J Proteomics, 2008, 71 (3): 284. Doi: 10.1016/j.jprot.2008.06.011
[2]	Ma Z Y, Guan Y P, Liu X Q, et al. J Appl Polym Sci, 2005, 96 (6): 2174. Doi: 10.1002/(ISSN)1097-4628
[3]	Zhang M, Cheng D, He X W, et al. Chem Asian J, 2010, 5 (6): 1332.
[4]	Ding C, Ma X D, Yao X, et al. J Chromatogr A, 2015, 1424 : 18. Doi: 10.1016/j.chroma.2015.11.004
[5]	Qin X R, Wu L, Yi D L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2005, 23 (3): 255. 秦晓蓉, 伍林, 易德莲, 等. 色谱, 2005, 23 (3) : 255.
[6]	Wang Y T, Zhang M, Wang L L, et al. New J Chem, 2015, 39 (6): 4876. Doi: 10.1039/C5NJ00241A
[7]	Cao J L, Zhang X H, He X W, et al. J Mater Chem B, 2013, 1 (30): 3625. Doi: 10.1039/c3tb20573h
[8]	Renò F, Carniato F, Rizzi M, et al. J Appl Polym Sci, 2013, 129 (2): 699. Doi: 10.1002/app.38789
[9]	Gu H Y, Faucher S, Zhu S P. Macromol Mater Eng, 2012, 297 (3): 263. Doi: 10.1002/mame.v297.3
[10]	Ye X L, Gong J B, Wang Z P, et al. Macromol Biosci, 2013, 13 (7): 921. Doi: 10.1002/mabi.201200461
[11]	Mabry J M, Vij A, Iacono S T, et al. Angew Chem Int Ed, 2008, 120 (22): 4205. Doi: 10.1002/(ISSN)1521-3757
[12]	Wang W S, Guo Y L, Otaigbe J U. Polymer, 2009, 50 (24): 5749. Doi: 10.1016/j.polymer.2009.05.037
[13]	Raghunath J, Georgiou G, Armitage D, et al. J Biomed Mater Res A, 2009, 91A (3): 834. Doi: 10.1002/jbm.a.v91a:3
[14]	Weng Z Y, Xue Y, Shi W J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34 (5): 467. 翁中亚, 薛芸, 施文君, 等. 色谱, 2016, 34 (5) : 467. Doi: 10.3724/SP.J.1123.2015.12040
[15]	Liu Z Y, Ou J J, Liu Z S, et al. J Chromatogr A, 2013, 1317 (19): 138.
[16]	Zhang J Q, Li Q F. Fine Chemicals, 2007, 24 (1): 17. 张剑桥, 李齐方. 精细化工, 2007, 24 (1) : 17.
[17]	Alves F, Scholder P, Nischang I. ACS Appl Mater Interfaces, 2013, 5 (7): 2517. Doi: 10.1021/am303048y
[18]	Li W, Sun Y, Yang C C, et al. ACS Appl Mater Interfaces, 2015, 7 (49): 27188. Doi: 10.1021/acsami.5b07946
[19]	Zheng J N, Lin Z, Lin G, et al. J Mater Chem B, 2015, 3 (10): 2185. Doi: 10.1039/C4TB02007C
[20]	Surio S, Kashima A, Mochizuki S, et al. Protein Eng, 1999, 12 (6): 439. Doi: 10.1093/protein/12.6.439
[21]	Brunori M, Vallone B, Cutrozzola F, et al. Proc Nat Acad Sci U S A, 2000, 97 (5): 2058. Doi: 10.1073/pnas.040459697
[22]	Motoshima H, Mine S, Masumoto K, et al. J Biochem, 1997, 121 (6): 1076. Doi: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a021697
[23]	Paddon C A, Marken F. Electrochem Commun, 2004, 6 (12): 1249. Doi: 10.1016/j.elecom.2004.09.025