酶几乎在所有生物学过程中都存在着不可替代的活性及特异性, 因此被广泛应用于临床诊断、生物医疗分析及工业应用中[1, 2]。然而自由酶在反应和储存过程中存在着稳定性差、回收率和重复利用率低等问题, 这使其应用受到一定的限制[3]。固定化酶提供了一种通用型的酶反应平台, 自由酶经过固定化后具有高酶-底物比, 可降低酶的自动消解并具有易从反应媒介中分离等特性, 因而得到快速的发展[4-7]。
磁性纳米材料具有表面体积比大[8]、可增强酶活性和稳定性[9]、对磁场有高响应性[10]等优点, 因此作为固定化酶的载体成为研究热点。大量的研究工作者用各种材料对磁性纳米粒子表面进行改性, 从而提高固定化酶的性能[11-13]。尽管这些固定化酶反应器可得到满意的酶促分析效果, 但其固定化方式会使固定化酶的活性降低, 且难以实现动态酶的固定化, 导致酶的大量浪费。因此, 需要进一步探索将酶固定到磁性纳米粒子表面且可实现动态可逆固定化的酶固定化新方法。
DNA定向固定化(DNA directed immobilization, DDI) 技术是基于DNA分子碱基互补配对(A-T, G-C), 采用温和的方式特异性固定生物大分子的技术[14]。DDI通过具有强机械刚性和高度物理化学稳定性的短双螺旋双链DNA将酶固定到载体上, 在保持酶的生物活性的同时充分暴露酶的活性位点[15-17]。尽管DDI可以显著增强酶促活性, 并可通过DNA杂交及解杂交实现酶的动态可逆固定化, 但是在解杂交时, 通常采用碱或高温来解旋DNA双螺旋, 容易导致酶的失活, 限制了其后续再利用。DNA链置换反应(DNA strand displacement reactions) 是指两条碱基互补配对的DNA，以其中一条DNA的黏性末端为起点和推动力，通过步进的方式杂交，将另一条互补的DNA序列置换的过程。由于DNA链置换反应优异的动力学性能, 已被广泛应用于设计各种纳米结构和装置, 在动态DNA纳米技术中发挥着核心作用[17]。采用DNA链置换反应可以通过温和的置换方式实现酶的动态可逆固定化, 不仅可以提高酶活性, 还可以实现对链置换目标酶的再利用。因此, 本文采用磁性纳米粒子作为固定化酶载体, 通过DDI成功固定碱性磷酸酶(ALP), 并利用DNA链置换反应将胰蛋白酶(trypsin) 在温和条件下替换ALP进而固定化胰蛋白酶, 实现了酶的无损更替, 并以链置换固定化胰蛋白酶为模型, 进行了蛋白质酶切分析研究。
LC-20A液相色谱仪, 配有二极管阵列检测器(PDA)(日本岛津公司); UltrafleXtreme基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS, 德国布鲁克\5道尔顿公司); H2050R高速冷冻离心机(湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司); BS124S电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)。
胰蛋白酶、ALP、马心肌红蛋白(Myo)、碘乙酰胺(IAA)、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)、4-硝基苯酚磷酸酯(4-NPP) 均购自美国Sigma-Aldrich公司; 4-(N-马来酰亚胺基甲基) 环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐(sSMCC)、三(2-羧乙基) 膦盐酸盐(TCEP)、Tween-20均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 原硅酸四乙基酯(TEOS)、戊二醛、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES) 均购自北京百灵威科技有限公司; HPLC纯化的DNA寡聚核苷酸购自上海生工股份有限公司。
3′-NH2-ssDAN修饰的磁性纳米粒子的制备:TEOS及APTES功能化修饰的四氧化三铁(MNPs) 的制备方法同文献[16]。称取5 mg MNPs, 加入4.5 mL 20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH 8.0) 及0.5 mL 50%(质量分数) 戊二醛, 于29 ℃以400 r/min摇床反应3 h。反应结束后, 用10 mmol/L PBS (0.1 mol/L NaCl, 0.05%(v/v) Tween-20, pH 7.4) 充分洗涤, 加入1 mL溶有3′-NH2-ssDNA (44个碱基) 的20 mmol/L PBS (0.1 mol/L NaCl, pH 8.0) 反应溶液, 于29 ℃以400 r/min摇床反应3.5 h, 得到的产物为MNPs@capDNA。反应结束后, 分别加入3 mL 1 mmol/L乙醇胺溶液和3 mL 0.5%(质量分数) 牛血清白蛋白(BSA), 于29 ℃以400 r/min摇床反应30 min, 得到的产物为3′-NH2-ssDAN修饰的磁性纳米粒子, 命名为MNPs@capDNA。
3′-SH-ssDNA修饰酶的制备:按文献[16]的方法制备, 分别得到ALP-SH-ssDNA (24个碱基) 和Trypsin-SH-ssDNA (44个碱基)。
MNPs@DNA-Trypsin的制备:取5 mg MNPs@capDNA, 加入过量的ALP-SH-ssDNA (24个碱基), 于37 ℃以400 r/min摇床反应2 h, 反应结束后用10 mmol/L PBS (0.1 mol/L NaCl, pH 7.4) 充分洗涤, 制备的产物命名为MNPs@DNA-ALP。取5 mg MNPs@DNA-ALP, 加入过量的Trypsin-SH-ssDNA (44个碱基), 于37 ℃以400 r/min摇床反应3 h, 即可获得MNPs@DNA-Trypsin。
色谱条件：ODS-XR C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μ m, 日本岛津公司)；等度洗脱; 流速为1 mL/min, 进样体积为20 μ L；分析物为BAEE及其产物时，流动相为乙腈-水(30 : 70, v/v), 检测波长为254 nm; 分析物为4-NPP及其产物时，流动相为乙腈-水(50 : 50, v/v), 检测波长为405 nm。
质谱条件：正离子模式; 加速电压为25 kV; 扫描范围为m/z 700~4 000。每次实验前均使用肽蛋白标准品进行校准。
DNA链置换反应：称取2份0.5 mg MNPs@DNA-Trypsin, 加入1 mL 10 mmol/L PBS (0.1 mol/L NaCl, pH 7.4), 分别对BAEE和4-NPP进行水解。水解条件为:量取1 mL 2 mg/mL的BAEE, 于37 ℃以400 r/min摇床反应40 min; 量取1 mL 1 mg/mL的4-NPP, 于37 ℃以400 r/min摇床反应1 h。
高温处理:称取0.5 mg MNPs@DNA-Trypsin (2份), 加入1 mL 10 mmol/L PBS (0.1 mol/L NaCl, pH 7.4), 于90 ℃以400 r/min摇床反应10 min; 碱处理:称取0.5 mg MNPs@DNA-Trypsin (2份), 加入1 mL NaOH (0.05 mol/L), 于37 ℃以400 r/min摇床反应10 min。高温或碱处理后, 分别吸取上清液及磁性材料复合物。用2份上清液(1 mL) 分别水解底物BAEE和4-NPP; 2份磁性材料复合物中各加入1 mL 10 mmol/L PBS (0.1 mol/L NaCl, pH 7.4) 后, 分别水解底物BAEE和4-NPP, 产物用高效液相色谱分析。
称取0.5 mg MNPs@DNA-Trypsin, 加入2 mL 2 mg/mL BAEE, 于37 ℃以400 r/min摇床反应40 min, 反应结束后, 固定化酶体系用10 mmol/L PBS (0.1 mol/L NaCl, pH 7.4) 多次充分洗涤, 去除其中的底物溶液, 然后加入2 mL 2 mg/mL BAEE, 于37 ℃以400 r/min摇床反应40 min。
称取0.5 mg MNPs@DNA-Trypsin, 加入100 μ L处理过的Myo, 于37 ℃以400 r/min摇床反应5 min后, 用磁铁分离MNPs@DNA-Trypsin固定化酶体系, 上清液直接用MALDI-TOF-MS分析。
以Trypsin-SH-ssDNA (44个碱基) 置换ALP-SH-ssDNA (24个碱基) 为模型, 考察DNA链置换反应固定化酶与高温变性、碱变性解旋DNA双链固定化酶对胰蛋白酶和ALP酶活性质的影响。按1.4.1节对MNPs@DNA-Trypsin进行DNA解旋变性处理, 并利用高效液相色谱法分析。由于链置换的不完全性，链置换得到的MNPs@DNA-Trypsin中仍有少许MNPs@DNA-ALP残留，将其命名为MNPs@DNA-Trypsin (ALP)。因此高温、碱变性解旋DNA双链后，上清液中含有从MNPs@DNA-Trypsin (ALP) 上经DNA解旋后的产物Trypsin-SH-ssDNA (44个碱基) 和ALP-SH-ssDNA (24个碱基)，同时部分Trypsin-SH-ssDNA (44个碱基) 和ALP-SH-ssDNA (24个碱基) 仍保留在MNPs@DNA-Trypsin (ALP) 上。如图 1所示，将经链置换反应得到的MNPs@DNA-Trypsin (ALP) 的相对活性设为100%，无论对于固定化ALP还是Trypsin，碱变性和高温变性解旋DNA双链后，上清液中Trypsin-SH-ssDNA (44个碱基) 和ALP-SH-ssDNA (24个碱基) 的相对活性及经碱和高温处理后的MNPs@DNA-Trypsin (ALP) 的相对活性均远小于MNPs@DNA-Trypsin (ALP) 的活性。高温变性及碱变性虽然可以解旋双链DNA, 但可对单链DNA标记酶的三维结构产生不可逆的破坏, 导致酶的不可逆失活。然而DNA链置换方法固定化酶是在温和的条件下进行, 对酶活性影响很小, 采取适当的手段对上清液中活性未损失的经链置换下来的ALP和未反应的Trypsin进行分离, 即可得到纯净的ALP和Trypsin, 从而进行酶的再利用, 可节约成本, 具有较大优势。
以MNPs@DNA-Trypsin固定化酶为代表, 考察其重复使用性。根据水解产物N-苯甲酰基-L-精氨酸(BA) 的高效液相色谱峰面积，比较酶的相对活性。多次重复1.4.2节的实验过程, 考察MNPs@DNA-Trypsin固定化酶的重复使用性。结果表明, 所制备的DNA链置换固定化胰蛋白酶在重复使用10次后仍可保持原酶活性的86%, 体现出DNA链置换反应制备的固定化酶体系的优越性。
为进一步证明DNA链置换反应法制备的固定化酶微反应器的优越性, 利用链置换法制备了MNPs@DNA-Trypsin酶切Myo (酶切条件及蛋白质前处理同文献[16]), 并与自由胰蛋白酶酶切Myo进行对比。如表 1所示, MNPs@DNA-Trypsin固定化酶体系酶切Myo，5 min后得到Myo氨基酸序列覆盖率为95%±0%, 肽段匹配数为21±2;而采用自由胰蛋白酶酶切Myo (酶与蛋白质的质量比为1 : 40), 720 min后得到Myo氨基酸序列覆盖率仅为62%±3%, 肽段匹配数为14±1。结果表明, 经过DNA链置换反应的固定化酶具有超快的酶切速度和较高的酶切效率。
本研究利用DNA链置换反应成功地在单链DNA标记的磁性纳米粒子上实现了酶的链置换更替, 相对于传统的碱变性和高温变性解旋DNA双链后再进行酶固定化, 该固定化酶技术实现了酶的无损更替, 从而获得酶的高重复利用率。该固定化胰蛋白酶体系与自由胰蛋白酶相比展现出高的酶切效率, 因此在蛋白质组学中具有较好的应用前景。
2017,
Vol. 35 Issue (3): 260-263
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2017,
Vol. 35 Issue (3): 260-263
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