动力学毛细管电泳(KCE) 为测定蛋白质-配体间相互作用的动力学和热力学参数提供了多种途径[1], 可用于研究分子间相互作用。KCE包括平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NECEEM)[2, 3]、平衡混合物的平衡毛细管电泳(ECEEM)[4]、区带顺进毛细管电泳(ppKCE)[5-8]、扫集毛细管电泳(Sweep CE)[9]等多种模式。NECEEM可测定平衡解离常数Kd、解速率常数koff和毛细管柱温[10], Temperature-Controlled NECEEM模式可测定热力学参数Δ H和Δ S[11], SweepCE可测定结合速率常数kon, 而ppKCE可同时测定kon和koff。KCE方法还被用于核酸适配体筛选, 不仅可筛选具有某一特定动力学参数(如koff和Kd) 的核酸适配体, 还可定量表征适配体与靶标的亲和力[1, 4, 12, 13]。基于KCE模式的适配体筛选(CE-SELEX) 被公认为是分离蛋白-核酸复合物效率最高的方法之一, 能使分离、表征及筛选同步进行。
目前, 核酸适配体筛选主要应用NECEEM和ECEEM两种模式[14]。NECEEM中, 平衡混合物被注入充满运行缓冲液的毛细管中, 进样端和出口端的样品瓶中均仅含有运行缓冲液; 平衡混合物中的复合物在电泳过程中不断解离。ECEEM中, 毛细管中预先充入含有一定浓度靶标的缓冲液。毛细管进样端注入一段平衡混合物, 在进样端样品瓶中为含相同浓度靶标的缓冲液, 而出口端样品瓶中则为运行缓冲液; 在平衡混合物的分离过程中, 复合物保持平衡而不发生解离。Krylov等[12]基于ECEEM, 经过3轮筛选, 得到针对MutS蛋白的Kd值达15 nmol/L的核酸适配体。Bowser等[15]基于NECEEM, 经过3轮筛选, 得到小分子N-甲基卟啉二丙酸(N-methyl mesoporphyrin IX) 的核酸适配体, 其中具有最强亲和力的适配体的Kd=(1.2±0.1) μmol/L。目前基于CE-SELEX已筛选出神经肽Y[16]、HIV-1逆转录酶[17]、人IgE[18]、蛋白激酶C[19]、信号转导蛋白[20]、血管内皮生长因子rhVEGF165[21]、α -甲胎蛋白[22]等多种蛋白质靶标的核酸适配体。
国内已有报道的KCE方法的应用主要是用ppKCE研究西酞普兰与牛血清白蛋白(bovine albumin, BSA)[6]、盐酸异丙肾上腺素与BSA[8]相互作用的动力学参数kon、koff以及药物跨膜转运的动力学过程[7]。关于该方法用于核酸适配体筛选的研究还少有报道。本课题组[23-27]在研究核酸适配体筛选过程中发现需解决核酸和靶标的亲和力表征和解离常数测定问题。目前用于测定Kd值的方法有KCE方法[28]、电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)[29, 30]、亲和毛细管电泳法(affinity capillary electrophoresis, ACE)[31]、表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)[32]等。KCE用于测定Kd值具有样品用量少、自动化程度高、易于操作等特点[28]。Krylov等[2]的研究表明利用KCE方法所求Kd值与利用其他方法(如亲和毛细管电泳法、荧光各向异性、荧光淬灭法等) 所求结果具有可比性。
基于NECEEM求解动力学参数时需从电泳图谱中提取准确的游离配体峰的峰面积A1、蛋白质-配体复合物峰的峰面积A2、复合物解离区的峰面积A3等参数。Krylov等[2, 28]曾提出:在游离配体峰与复合物解离区之间的边界划分可参考对比靶标存在与否时游离配体峰的位置, 且实验偏差在10%以内时, 实验结果可接受, 但其并未对该结论给出支持性的实验数据。本文以单链DNA结合蛋白(SSB) 靶蛋白与4种单链DNA (ssDNA) 的结合为例, 以普遍使用的两种长度(15 nt和29 nt) 的凝血酶适配体5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′(15mer) 和5′-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3′(29mer) 作为模式核酸分子, 利用动力学毛细管电泳法求解解离常数Kd。比较了蛋白质与核酸浓度比、毛细管柱温等条件变化所致的Kd变化, 分析了从毛细管电泳图中提取峰面积数据时由游离配体峰、复合物解离区的边界划分问题可能导致的计算误差。并基于电泳图A1、A2、A3提取数据, 用数值计算的方法分析了面积积分偏差对解离常数Kd求解的影响。
Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳系统, 配备紫外(UV) 检测器和激光诱导荧光(LIF) 检测器(美国Beckman Coulter公司)。熔融石英毛细管(有效长度/总长:40 cm/50.2 cm; 内径75 μm) 购自邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司。
SSB购自克劳宁(北京) 生物科技有限公司。4种ssDNA序列为:5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′(15mer)、5′-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGG-GTGACT-3′(29mer)、5′-d (T)15-3′(dT15) 和5′-d (T)29-3′(dT29);荧光ssDNA序列5′端使用6-羧基荧光素(FAM) 进行标记, 以上均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。氢氧化钠、硼砂和硼酸(均为分析纯) 购自北京化工厂; 实验室用水为蒸馏水。
将50 mmol/L Na2B4O7溶液和200 mmol/L H3BO3溶液以7 : 13的体积比混合, 配制成200 mmol/L pH 8.2的硼酸盐储备液。用蒸馏水稀释为50 mmol/L pH 8.2的硼酸盐溶液作为电泳缓冲液, 经0.22 μmol/L水相滤膜过滤后使用。
购买的ssDNA样品均为固体粉末, 按照说明书加入一定量的水溶解成100 mmol/L的母液, 小心振荡混匀后于94 ℃变性处理5 min, 冷却至室温后取出, 用蒸馏水稀释到需要的浓度。
购买的SSB母液浓度为264 μmol/L, 用蒸馏水稀释到需要的浓度。
熔融石英毛细管; 进样压力:3 447.4 Pa; 进样时间:5 s; 分离电压:+20 kV; 紫外检测波长:214 nm; 荧光激发波长:488 nm, 荧光发射波长:520 nm。毛细管柱温变化范围为15~40 ℃。新毛细管在使用前分别用1 mmol/L NaOH、0.1 mmol/L NaOH、H2O各冲洗30 min。两次进样间用0.1 mmol/L NaOH、H2O和电泳缓冲液各冲洗3 min。毛细管电泳不用时两端水封, 于室温下保存。
图 1为NECEEM模式求解动力学常数所需的参数示意图。游离ssDNA的峰面积为A1、复合物的峰面积为A2、复合物解离区的峰面积为A3。各峰面积可在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳系统上积分得出。试验中, 已知SSB和ssDNA孵育时的原始浓度[SSB]0和[ssDNA]0, 获取电泳图中各峰面积值后可根据公式(1) 求解Kd:
定量描述面积积分偏差数学方法的建立:如图 1所示, 设定初始手动积分时所得复合物解离区的峰面积为A30。因与游离ssDNA的峰相邻, 故A3与A1积分时的偏差可用A3与A30的偏差Δ A3来表示。定义面积积分时A3的相对偏差ε=Δ A3/A30, 其中Δ A3可为正值(表示积分时A3偏大而A1偏小), 也可为负值(表示积分时A3偏小而A1偏大)。由此可得:A3=A30±Δ A3=A30×(1±ε)。因复合物解离区与复合物的峰相邻, (A2+A3) 在公式(1) 中作为一个整体, 故计算时无需考虑A2与A3间的积分偏差。
数值计算及求解误差分析:以SSB与15mer的相互作用为实验模型, 对电泳图进行积分。分别设置面积积分相对偏差ε为:-10%≤ε≤0和0＜ε≤10%, 并依照公式(1) 求解Kd。对求解结果进行Kd与ε的线性分析, 对一定积分偏差范围内Kd的最大相对偏差和RSD比较等数据进行分析。
向15mer、29mer、dT15和dT29 4种ssDNA中分别加入不同浓度的SSB, 室温孵育30 min后进行混合物分析。4种ssDNA与SSB结合呈现不同的电泳图(见图 2)。向15mer、29mer和dT29加入SSB时, 随着SSB浓度的增加, SSB-ssDNA复合物峰增大, 且游离核酸峰逐渐减小直至消失。说明SSB与15mer、29mer、dT29作用较强, 可形成明显的复合物, 符合图 1示意图, 可用于数值分析计算。但在dT15中加入相应浓度的SSB时, 则无复合物峰出现, 与图 1示意图不符, 该电泳图不能用于计算。
向0.4 μmol/L的15mer或29mer中分别加入0.8~8 μmol/L SSB, 使SSB与核酸的浓度比r介于2 : 1和20 : 1之间。由图 3可知, 当r=4 : 1、8 : 1和18 : 1时, SSB-15mer中游离核酸峰、复合物峰及解离区均能准确区分。而SSB-29mer在较高的浓度比(如r=14 : 1) 时, 游离核酸峰及解离区很难区分, 因此无法计算Kd。表 1为不同浓度比时计算的复合物SSB-15mer和SSB-29mer的Kd。对于SSB-15mer复合物, 在考察的各浓度比下均可计算Kd。但对于SSB-29mer复合物, 当浓度比达到12 : 1时已无法计算。
表 1为不同浓度比的SSB与核酸对求解Kd的影响, 结果表明所设的浓度比对Kd的影响在一个数量级范围内。比较了试验中所有浓度比(r=2 : 1~20 : 1) 下Kd的均值()。所求SSB-15mer复合物的=1.247 8 μmol/L, SSB-29mer复合物的=0.241 2 μmol/L。表明该试验条件下, SSB-29mer复合物的稳定性强于SSB-15mer复合物的稳定性。
3.2 μmol/L SSB分别与0.4 μmol/L 15mer和29mer混合, 将样品分析时的毛细管柱温设为15~40 ℃, 进行分析。由图 4可见, 柱温升高导致各峰的迁移时间加快, SSB-15mer复合物峰减小, 直至消失; 而在20~40 ℃, 随着温度的增加, SSB-29mer复合物峰型尖锐, 峰面积变化不大。表 2为不同柱温下计算的Kd, 比较了柱温对SSB-15mer和SSB-29mer复合物Kd的影响。可见SSB-15mer复合物的Kd波动较小, 说明SSB-15mer复合物在15~40 ℃间较稳定。SSB-29mer复合物的Kd在15~25 ℃和30~40 ℃时分别保持稳定, 仅在25 ℃和30 ℃间跳动上升。值得注意的是, 低于25 ℃时, SSB-29mer的Kd均小于SSB-15mer的Kd; 高于30 ℃后, SSB-29mer的Kd均大于SSB-15mer的Kd。说明柱温对于两种复合物稳定性的影响存在细微差异, 毛细管柱温影响Kd值的求解, 因此求解Kd和比较Kd时应确定柱温条件。
由图 1可知, 边界划分和积分峰面积值对Kd求解有影响, 其中游离核酸峰与解离区的边界区分偏差更大。因此, 手动积分时人为设定峰面积边界导致的误差将直接影响Kd的求解结果。但在上述Kd计算中, 均忽略了手动积分面积产生的偏差对Kd求解的影响。为检验以上Kd计算结果的可靠性, 以图 4a中25 ℃时SSB与15mer的作用为模型, 考察面积积分偏差ε对Kd求解的影响(考察范围为-10%≤ε≤10%), 结果见表 3。首先对表 3中的21个点进行线性拟合, 线性方程为Kd=-0.016 68 ε +1.323, R2=0.999 0, 说明Kd求解结果与面积积分偏差间的线性关系较好; 同时拟合直线的斜率为负值, 说明A3为正值偏差(即积分时A3偏大) 时, 计算所得Kd会偏小。
其次, 对两组积分偏差区间内(-10%≤ε≤0和0＜ε≤10%)Kd的均值和最大相对偏差进行分析。结果如下:-10%≤ε≤0时, =1.406 3 μmol/L, 最大相对偏差(| ε |=0时)=6.58%; 0＜ε≤10%时, $ $=1.239 5 μmol/L, 最大相对偏差(| ε |=10%时)=6.23%。在考察的两个偏差区间内, 所求的Kd值与均值的最大相对偏差均小于7%。再对3个误差区间内Kd的RSD进行比较。结果如下：-10%≤ε≤0时, RSD=5.87%; 0＜ε≤10%时, RSD=5.21%。以上结果说明, 当图 1中A1和A3积分的偏差在10%以内时, 所求Kd的误差在可接受范围, 所求Kd值与均值的最大相对偏差均小于7%, 所求Kd值之间的RSD均小于6%。实际应用中所积累的经验表明, 在本文所使用的Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳分析软件中, 对峰面积进行手动积分时, 面积积分的最大偏差ε无论是正值偏差还是负值偏差均不会达到10%。因此, 可以认为在已有实验条件和技术条件下基于NECEEM求解动力学相关参数的方法可靠, 实际应用中不需考虑面积积分的偏差所致的Kd误差。
本文以SSB靶蛋白与单链DNA的结合为实例, 基于NECEEM模式计算蛋白质与核酸相互作用的解离常数Kd, 分析了Kd计算的影响因素。结果表明, 靶蛋白与单链DNA结合强弱产生不同的电泳图, 符合示意图 1的电泳图可用于计算Kd。SSB与ssDNA的浓度比、毛细管柱温均影响Kd计算。此外, 手动积分时产生的面积积分偏差是计算Kd误差的来源。针对提取的峰面积数据计算分析表明, 在现有实验条件下面积积分偏差对Kd计算虽有影响, 但在10%的偏差区间内, 所求Kd值的最大相对偏差小于7%, 误差可忽略。本文证实了基于NECEEM求解动力学相关参数的方法可靠。
2017,
Vol. 35 Issue (3): 332-338
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