色谱  2017, Vol. 35 Issue (3): 344-350   PDF    
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张冰宇
蔡晓蓉
尹艳艳
李茜诺
吕海霞
吴晓苹
毛细管电色谱-激光诱导荧光检测法分析食品中的生物胺
张冰宇1,2 , 蔡晓蓉1,2 , 尹艳艳1,2 , 李茜诺1,2 , 吕海霞3 , 吴晓苹1,2     
1. 食品安全分析与检测教育部重点实验室(福州大学), 福建 福州 350108;
2. 福州大学化学学院, 福建 福州 350108;
3. 福州大学材料科学与工程学院, 福建 福州 350108
收稿日期：2016-10-10
基金项目：国家自然科学基金项目（21375019，21307013，21271044）；国家重大科学仪器装备开发专项（2011YQ150072）
通讯联系人： 吴晓苹, Tel:(0591)22866131, E-mail:wapple@fzu.edu.cn
摘要：以4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并氧杂恶二唑（NBD-F）为衍生化试剂，建立了食品中5种痕量生物胺（色胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺）的毛细管电色谱-激光诱导荧光检测（CEC-LIF）分析方法。采用50 mmol/L硼酸盐缓冲溶液（pH 8.0）作为衍生介质，在75 ℃条件下对生物胺进行衍生化反应25 min。生物胺衍生产物的最优色谱条件：固定相为C18毛细管电色谱柱，流动相为乙腈-乙酸铵（20 mmol/L，pH 8.0）（75：25，v/v），辅助压力为6.9 MPa，分离电压为-8 kV，流速为0.03 mL/min。实验结果表明，生物胺的检出限（LOD，S/N=3）为0.1~1.0 μg/L，加标回收率为78.3%~113.9%。该方法可成功用于加工和发酵食品中生物胺的测定，结果与传统HPLC法的检测结果无显著性差异，且检出限更低、分析速度更快，对于食品中痕量污染物的残留监测具有应用价值。
关键词： 毛细管电色谱     激光诱导荧光     衍生化     生物胺     食品    
Analysis of biogenic amines in foods by capillary electrochromatography coupled with laser induced fluorescence detection
ZHANG Bingyu1,2, CAI Xiaorong1,2, YIN Yanyan1,2, LI Xinuo1,2, LÜ Haixia3, WU Xiaoping1,2     
1. Key Laboratory of Analysis and Detection for Food Safety (Ministry of Education), Fuzhou University, Fuzhou 350108, China;
2. College of Chemistry, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China;
3. College of Materials Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China
Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21375019, 21307013, 21271044); Special-Funded Program on National Key Scientific Instrument and Equipment Development (No. 2011YQ150072)
Abstract: A rapid and sensitive method was established for the analysis of biogenic amines (tryptamine, histamine, tyramine, spermidine and spermine) in foods by capillary electrochromatography (CEC) coupled with laser induced fluorescence (LIF) detection, using 4-fluoro-7-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole (NBD-F) as the derivatization reagent. The biogenic amines were derivatized by NBD-F with 50 mmol/L borate buffer solution (pH 8.0) at 75℃ for 25 min. The obtained derivatives of biogenic amines were separated on a packed C18 capillary column with a mobile phase consisting of acetonitrile-ammonium acetate (20 mmol/L, pH 8.0) (75:25, v/v) and the flow rate of 0.03 mL/min. A supplementary pressure of 6.9 MPa and a separation voltage of -8 kV were applied. The limits of detection (LODs, S/N=3) were 0.1-1.0 μg/L, with spiked recoveries of 78.3%-113.9%. The method could be applied to detect biogenic amines in processed and fermented foods. Statistical comparison of the results with those of the reference HPLC method showed good agreement. It reveals some advantages on the sensitivity and analysis speed, which are significant to trace residue analysis of biogenic amines in foods.
Key words: capillary electrochromatography (CEC)     laser induced fluorescence (LIF)     derivatization     biogenic amines     foods    

生物胺(biogenic amines, BAs) 是一类具有生物活性的含氮有机化合物, 广泛存在于肉制品、水产品和其他发酵食品中, 往往在食品腐败和发酵的过程中产生。过量的生物胺尤其是组胺、酪胺及脂肪胺等多种毒性生物胺不仅影响食品质量、引发不良反应, 还可能产生协同效应增强食物的毒性, 损伤神经、心血管系统, 甚至危及生命[1, 2]。食品中生物胺的含量成为评价食品新鲜度的重要指标。因此, 发展简便、灵敏的检测方法对于其风险控制十分必要。

食品中生物胺的分析方法主要有HPLC[3, 4]、CE[5-7]、TLC[8]、酶联免疫法[9]、IC[10]、离子交换色谱法[11]、LC-MS[12]、GC-MS[13]及UPLC[14, 15]等。HPLC、CE结合紫外或荧光检测是目前较为常用的分析技术[16], 如国家标准方法[17]采用HPLC梯度洗脱结合丹磺酰氯衍生化紫外检测分析生物胺, 其操作繁琐, 衍生化步骤耗时长, 且检出限偏高; 而CE分析生物胺时通常需要采用胶束和复杂的缓冲体系以提高分离度[7]。毛细管电色谱(CEC) 法以电渗流、电泳力或结合压力流作为流动相的驱动力, 同时结合了CE的高分辨率与HPLC的高选择性, 具有分离效率高、分析速度快、样品和溶剂消耗少等优点[18], 目前尚未应用于生物胺的分离。CEC法与灵敏度和选择性极强的激光诱导荧光(LIF) 技术结合, 可以显著降低检出限与基质干扰, 满足目标物痕量检测的需求[19]。

由于多数生物胺的紫外吸收较弱, 常需要对其进行化学衍生, 常用的柱前衍生剂有丹磺酰氯[20]、丹酰氯(Dns-C1)、苯甲酰氯、异硫氰酸荧光素[21]、异鲁米诺[22]等；柱后衍生剂有荧光胺、邻苯二醛(OPA)、2, 3-萘基二缩醛(NDA)[23]等。寻找反应快速高效、产物稳定的荧光衍生试剂始终是生物胺色谱分析的关键。4-氟-7-硝基-2, 1, 3-苯并氧杂恶二唑(NBD-F) 作为一类可以衍生伯胺、仲胺的高效苯并呋咱类衍生试剂, 能有效克服常规衍生剂反应时间长、水解产物多的缺点[24], 已被应用于烟草叶[24]和人体体液[25]中胺类的快速衍生。

本文以NBD-F为衍生试剂, 采用CEC-LIF分析技术, 建立了快速分离与定量检测色胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺的分析方法。该方法简单、低耗、灵敏, 可用于加工食品和发酵食品中生物胺含量的检测。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

自组装加压毛细管电色谱系统[26], 包括TriSep-2010型微流控制系统、±30 kV高压电源; 半导体泵浦式激光诱导荧光检测器(λ ex/ λ em=473 nm/530 nm, 中国科学院大连化学物理研究所); Eclipse-荧光分光光度计(美国Varian公司); HB-031金属恒温加热器(上海申能博彩生物科技有限公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

色胺(纯度98%)、酪胺(纯度99%) 购自美国Sigma公司; 组胺(纯度97%) 购自上海百灵威有限公司; 精胺(纯度97%)、亚精胺(纯度99%) 购自美国Alfa Aesar公司。NBD-F (纯度99%) 购自日本东京化成工业株式会社; 乙腈、甲醇为色谱纯; 十水合硼酸钠(Na2B4O7\510H2O)、硼酸(H3BO3)、NaOH、盐酸为分析纯。

分别用乙腈(组胺、酪胺) 和甲醇(色胺、精胺、亚精胺) 配制质量浓度均为1.0 g/L的各生物胺标准储备液, 于-20 ℃避光保存, 使用时用流动相稀释至所需质量浓度。用乙腈溶解并配制10 mmol/L的NBD-F储备液, 于-20 ℃避光保存, 使用时用乙腈稀释至所需浓度。所有缓冲液和样品溶液均经0.22 μm微孔滤膜过滤及超声除气泡。

1.2 样品前处理

酱油和鸡肉肠样品购自福州大学城某大型超市。在文献方法[27]的基础上对样品前处理步骤进行改进。

酱油样品:量取20 mL酱油样品，置于100 mL烧杯中, 加入50 mL饱和氯化钠溶液, 静置5 min, 用1 mol/L NaOH调节溶液pH至11.0, 用20 mL乙酸乙酯萃取, 取上清液, 下层液体用同样方法重新萃取一次, 合并上清液, 用氮气吹干, 残渣用1 mL流动相溶解, 0.22 μm有机滤膜过滤后, 用于荧光衍生和CEC分析。

鸡肉肠样品:称取5 g鸡肉肠样品, 切丁并制成肉糜, 用15 mL 0.05 mmol/L的三氯乙酸超声提取25 min, 共2次, 然后以3000 r/min离心5 min, 取上清液, 残余物用15 mL甲醇超声25 min, 共2次, 然后以3000 r/min离心10 min, 合并上清液。取4 mL上清液用氮气流吹干, 残余物用2 mL 0.05 mmol/L的三氯乙酸溶解, 0.22 μm滤膜过滤, 滤液经衍生后进行CEC分析。

1.3 生物胺的荧光衍生

分别取30 μL 5种生物胺的标准储备液(10 mg/L) 或150 μL前处理后的样品溶液, 加入400 μL硼酸缓冲液(50 mmol/L, pH 8.0)、300 μL含1 mmol/L NBD-F的乙腈溶液, 振荡混匀, 于75 ℃避光衍生化25 min。反应结束后待其冷却至室温, 加入100 μL 2 mol/L的HCl终止反应, 然后漩涡振荡1 min, 即得荧光衍生化样品。另取550 μL硼酸缓冲液(50 mmol/L, pH 8.0), 加入300 μL含1 mmol/L NBD-F的乙腈溶液, 在相同条件下进行衍生化, 作为试剂空白。衍生化样品用流动相稀释至所需浓度, 用于CEC分析。

1.4 色谱条件

色谱柱:C18毛细管电色谱填充柱(75 μm i.d., 375 μm o.d.，总长50 cm, 有效长度20 cm, 填充3 μm ODS, 苏州环球色谱责任有限公司); 等度洗脱; 流动相:乙腈-乙酸铵缓冲液(20 mmol/L, pH 8.0)(75 : 25, v/v); 流速:0.03 mL/min; 分离电压:-8 kV; 辅助压力:6.9 MPa (1000 psi)。

2 结果与讨论
2.1 荧光衍生方法的优化

NBD-F可在温和条件下快速标记一级胺、二级胺, 从而生成强荧光产物, 且副产物少。生物胺结构中的氨基是主要的衍生位点(见图 1), 本实验考察了NBD-F的荧光衍生化反应情况, 并优化了生物胺的荧光衍生化条件。

图 1 NBD-F衍生生物胺反应的示意图 Fig. 1 Schematic diagram of derivatization of biogenic amines with NBD-F NBD-F: 4-fluoro-7-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole; R: CnH2n+1 or benzene.
2.1.1 衍生介质条件的选择

在弱碱性条件下考察了不同衍生介质(硼酸盐、甲酸盐和磷酸盐) 对生物胺衍生化反应的影响。结果表明, 以硼酸盐为衍生介质时, NBD-F的衍生化效率较好, 其衍生芳香胺(色胺) 和杂环胺(组胺、酪胺) 产物的荧光响应优于脂肪胺(精胺、亚精胺)。故选择硼酸盐作为衍生介质。

考察了衍生介质的浓度(20~100 mmol/L) 对生物胺衍生产物荧光强度的影响。随着硼酸盐缓冲液浓度的升高, 衍生产物的荧光迅速增强, 在50 mmol/L时, 荧光强度达到最高, 随后由于过多的硼酸盐会在一定程度上抑制反应，引起衍生试剂残留物和水解产物增多，荧光响应略有下降，但保持相对稳定, 说明衍生化反应基本完全。故将衍生介质的浓度设为50 mmol/L。

进一步考察了衍生介质的pH值(5.0~10.0) 对荧光衍生反应效率的影响。生物胺衍生产物的荧光强度随着衍生介质pH值的升高先逐渐增大后呈下降趋势, 在pH 8.0时达到最大值, 说明衍生化反应的转化率在pH 8.0时达到最高。因此将衍生介质的pH值设为8.0。

2.1.2 衍生时间的选择

荧光衍生时间决定了衍生化反应的完成程度, 影响荧光产率。本实验考察了衍生时间(5~40 min) 对生物胺衍生产物荧光强度的影响。结果表明, 随着衍生化反应时间的增加, 生物胺NBD-F衍生产物的峰面积先增大后略有下降, 衍生时间在25 min时, 峰面积达到最大, 说明衍生化反应基本达到完全。因此将衍生化反应时间设为25 min。

2.1.3 衍生化温度的选择

本实验考察了衍生化温度(50~80 ℃) 对生物胺衍生产物荧光强度的影响。结果表明, 随着衍生化温度的升高, 衍生产物的荧光强度逐渐增加, 当衍生化温度达到75 ℃时, 荧光强度达到最大值; 进一步提高衍生化温度, 荧光分子与溶剂分子相互碰撞淬灭的概率增加, 可导致溶液中荧光分子的荧光量子产率降低。因此最终将衍生化温度设为75 ℃。

2.2 毛细管电色谱分离条件的优化

NBD-F在水溶液中水解可能产生NBD-OH等杂质[21], 使色谱分离产生一定困难。本实验为避免荧光试剂、水解产物等对色谱分离的干扰, 进一步详细优化了毛细管电色谱的分离条件。实验选择了乙酸铵作为流动相缓冲液, 可屏蔽ODS固定相表面残留的硅羟基, 相较于其他缓冲体系, 其电导率较低, 有利于疏水模式下生物胺的电色谱分离。

2.2.1 缓冲液pH值的选择

5种生物胺的pKa值均大于9.5, 当缓冲液的pH值小于pKa时, 其衍生物主要呈中性或者部分质子化。实验表明, 碱性环境更有利于生物胺的荧光响应, 而偏酸性介质中色谱分离过程将出现更多的副产物, 且荧光响应也相对较小。当缓冲液的pH为6.0~7.0时, 5种生物胺带正电, 其衍生产物的电泳与电渗流方向相同, 保留时间较小, 但pKa较接近的酪胺、亚精胺和精胺(pKa 9.6~9.9) 难以分离; 提高pH值至8.0时, 可以使亚精胺、精胺和酪胺分子趋近于电中性, 其衍生产物基于在固定相上的保留强弱而分离; 进一步增加pH到9.0时，部分带正电的组胺(pKa 12.02) 和色胺(pKa 13.45) 衍生产物迁移加快，二者反而不能完全分离；随着pH达到10.0以上, 部分带负电的酪胺、亚精胺和精胺衍生产物迁移速度明显变慢, 同时带正电的组胺和色胺衍生产物保留时间相应减小，导致其无法达到基线分离。综合考虑荧光效率、分析速度和分离度, 最终将缓冲液的pH值设为8.0。

2.2.2 缓冲液浓度的选择

考察了采用10~25 mmol/L乙酸铵(pH 8.0)-乙腈溶液(25 : 75, v/v) 的流动相时, 生物胺衍生产物的色谱分离情况。当乙酸铵浓度为10 mmol/L时, 衍生试剂及水解产物对待测物没有干扰, 但5种生物胺衍生产物的分离度与荧光响应均较小; 当乙酸铵浓度增至20 mmol/L时, 生物胺衍生产物的分离度明显增加, 峰面积也随之增大; 当乙酸铵浓度为25 mmol/L时, 由于盐浓度较高，产生的焦耳热较大，导致目标化合物的色谱峰展宽。因此将乙酸铵的浓度设为20 mmol/L。

2.2.3 有机改性剂比例的选择

考察了流动相中乙腈的比例(60%~90%, v/v) 对生物胺衍生产物分离效果的影响。如图 2所示, 5种目标分析物在含60%(v/v) 乙腈的流动相中即可分离, 但亚精胺、精胺和酪胺响应较低; 随着乙腈比例的增加, 目标分析物的保留时间逐渐减小。极性最低、氨基数目最多的亚精胺和精胺的衍生产物虽然在反相色谱柱上有较强保留, 但其在pH 8.0条件下呈质子化状态, 在电泳作用与电渗流的综合影响下出峰较早; 而含杂环的组胺和色胺由于具有共轭π键和取代基效应, 衍生产物的保留时间随着乙腈比例的增大而降低。当乙腈比例为75%(v/v) 时, 5种生物胺衍生产物达到完全分离, 响应较大，峰形较好, 且与衍生试剂基质峰分离良好; 当进一步增加乙腈比例时, 虽然可以提高分析速度, 但是生物胺衍生产物的荧光响应明显减小。因此将乙腈的比例设为75%(v/v)。

图 2 不同乙腈比例下生物胺衍生产物(10 mg/L) 的CEC谱图 Fig. 2 Capillary electrochromatography (CEC) chromatograms of biogenic amine derivatives (10 mg/L) by different percentages of ACN Mobile phase: acetate buffer (20 mmol/L, pH 8.0)-acetonitrile (ACN); applied voltage: -8 kV; supplementary pressure: 3.7 MPa; pump flow rate: 0.03 mL/min. 1. spermidine; 2. spermine; 3. tyramine; 4. tryptamine; 5. histamine.
2.2.4 辅助压力的选择

本实验通过调节微流控单元中的反压阀, 改变施加在毛细管柱端的辅助压力(3.7、5.6、6.9和8.5 MPa), 考察5种生物胺衍生产物的分离情况。结果表明, 当辅助压力由3.7 MPa逐渐升至6.9 MPa时, 5种生物胺衍生产物的分析时间由21 min缩短至12 min, 而分离度变化不大; 当辅助压力由6.9 MPa增至8.5 MPa时, 衍生试剂及其水解峰对亚精胺色谱峰产生干扰。因此最终将辅助压力设为6.9 MPa。

2.2.5 分离电压的选择

本实验考察了不同分离电压(0~12 kV) 下, 生物胺衍生产物的分离效果(见图 3)。结果表明, 未施加分离电压时, 分析物的分析时间较长且色谱响应较低; 当施加-6 kV的分离电压时, 分析物的保留时间明显缩短, 尤其是精胺、酪胺和色胺, 甚至与组胺的相对流出次序发生变化; 当分离电压为-8 kV时, 各物质达到基线分离, 响应较大, 且基本不受衍生试剂及其水解产物干扰; 当施加过高的分离电压(＞-10 kV) 时, 基线噪声增大, 分析物与衍生试剂的基质峰分离度下降。因此本实验将分离电压设为-8 kV。

图 3 不同分离电压下生物胺衍生产物(20 mg/L) 的CEC谱图 Fig. 3 CEC chromatograms of biogenic amine derivatives by different applied voltages (20 mg/L) Mobile phase: acetonitrile-acetate buffer (20 mmol/L, pH 8.0) (75 : 25, v/v); supplementary pressure: 6.9 MPa; pump flow rate: 0.03 mL/min. Peaks 1-5 are the same as in Fig. 2.
2.2.6 流动相流速的选择

在0.01~0.10 mL/min范围内, 随着流动相流速的减小, 5种生物胺衍生产物的分离度增加, 峰高和峰面积也显著提高, 保留时间基本不变；但流速减小至0.02 mL/min时，色谱峰产生峰展宽效应，导致分离度有所降低。综合考虑分离度、灵敏度, 最终将流动相流速设为0.03 mL/min。

在最优色谱条件下对5种生物胺衍生产物进行等度洗脱, 5种目标物可在12 min内实现完全分离, 分析时间较传统的HPLC法更短(30 min)[17, 28], 柱效高达5×104~1.5×105块/m。说明建立的方法具有分析速度快, 柱效高等优势。

2.3 线性关系和检出限

将不同质量浓度的生物胺混合标准溶液进行荧光衍生及CEC-LIF分析, 考察方法的线性关系和检出限(LOD, S/N=3)(见表 1)。结果表明, 5种生物胺衍生产物的峰面积(y) 与各生物胺的质量浓度(x, μg/L) 呈良好的线性关系, 相关系数(r2) 均大于0.99, 检出限为0.1~1.0 μg/L, 可满足生物胺的残留限量检测要求。该方法的LOD较文献报道的CE-LIF[18]、CE-MS[29]和HPLC-MS/MS[30]低1~2个数量级, 与HPLC-FLD及采用富集技术的HPLC-UV的检测水平相当[16]。

表 1 5种生物胺的线性范围、回归方程、相关系数(r2) 和检出限 Table 1 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), and limits of detection (LODs) of the five biogenic amines (BAs)

目前食品中生物胺的国家标准方法[17]衍生和分离需1 h, 检出限为100 μg/L。相比之下, 本文所建立的方法无需梯度洗脱程序, 衍生化效率高, 检出限更低, 兼具高选择性和高灵敏度, 可排除大量非荧光杂质的干扰, 对于食品中生物胺污染监测具有良好的适用性。

2.4 稳定性与精密度

将生物胺衍生化产物于4 ℃下保存, 每30 min进样分析, 结果表明, 衍生产物的荧光强度在2.5 h内稳定, 放置时间过长导致衍生试剂水解产物形成, 干扰分析。为保证实验结果的可靠性, 所有样品均在衍生反应后2.5 h内完成分析。

在最优条件下, 测得5种生物胺衍生产物峰面积的RSD为0.9%~5.5%(n=5), 说明衍生化反应的重复性良好。对不同浓度(1.0×10-8、1.0×10-7和1.0×10-6 mol/L) 的NBD-F衍生化生物胺进行CEC-LIF分析, 连续测定7天, 每天进样3次, 测得5种生物胺衍生产物保留时间的日内RSD和日间RSD分别为0.7%~2.6%和1.1%~6.3%, 峰面积的日内RSD和日间RSD分别在0.9%~6.5%和2.1%~8.4%。

2.5 回收率

利用本实验建立的CEC-LIF分析方法进行加标回收率试验, 同时以NBD-F为衍生试剂, 开展了HPLC-FLD方法的对照试验(LOD为1.5~3.0 μg/L)。采用CEC-LIF法在3个添加水平(80、200和400 μg/L) 下测得鸡肉肠和酱油样品中生物胺的加标回收率为78.3%~113.9%(见表 2、表 3); 采用HPLC时, 加标回收率为70.4%~117.3%, 二者RSD均小于10%。方法准确度和精密度均符合残留分析要求。在置信度为95%时, 以0.05为显著性水平, Paired t-test结果中P均大于0.05, 显示两种方法间无显著性差异。

表 2 酱油样品中5种生物胺的含量和加标回收率(n=3) Table 2 Contents and recoveries of the five BAs in spiked soy sauce samples (n=3)

表 3 鸡肉肠样品中5种生物胺的含量和加标回收率(n=3) Table 3 Contents and recoveries of the five BAs in spiked chicken sausage samples (n=3)
2.6 实际样品分析

在最优条件下对实际鸡肉肠和酱油样品进行含量测定, 同时与HPLC-FLD法进行比较, 结果见表 2、表 3。两种方法在鸡肉肠中均测出亚精胺、精胺和组胺, 在酱油样品中测出亚精胺、精胺、酪胺和组胺且测得含量较为接近, 均未超出国际上对同类食品的限量要求。其中，实际酱油样品的毛细管电色谱图见图 4。

图 4 (a) 实际酱油样品和(b) 加标酱油样品中5种生物胺衍生产物的CEC图 Fig. 4 CEC chromatograms of the five biogenic amine derivatives in (a) a soy sauce sample and (b) a spiked soy sauce sample Spiked level: 10 mg/L spermidine, spermine and tryptamine, 2 mg/L tyramine and histamine; mobile phase: acetonitrile-acetate buffer (20 mmol/L, pH 8.0) (75 : 25, v/v); applied voltage: -8 kV; supplementary pressure: 6.9 MPa; pump flow rate: 0.03 mL/min. Peaks 1-5 are the same as in Fig. 2.
3 结论

本文以NBD-F为衍生试剂, 结合低成本的半导体激光诱导荧光检测器, 建立了生物胺的快速衍生及毛细管电色谱的分析方法, 实现了色胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺衍生产物的快速分离与定量分析。该方法成功应用于加工肉制品和发酵食品中生物胺含量的分析, 相较于HPLC法, 具有操作简便、分析速度快、溶剂消耗量少及仪器成本低等优点, 可为生物胺限量标准的全面建立提供科学依据。

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