高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定面粉中7种荧光增白剂


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	李蓉

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	张宪臣

	胡仪光

	高永清

李蓉¹ , 何春梅^1,2 , 薄艳娜^1,3 , 张朋杰¹ , 张宪臣¹ , 胡仪光¹ , 高永清²

1. 中山出入境检验检疫局, 广东中山 528400;
2. 广东药科大学, 广东中山 528458;
3. 暨南大学包装工程研究所, 广东珠海 519070

收稿日期：2016-10-11

基金项目：国家质检总局科技计划项目（2015IK260）；广东省省级科技计划项目（2014A040401011）；中山市社会公益重大专项（2015B2295）

通讯联系人：李蓉,Tel:(0760)88830078,E-mail:lirong828@126.com; 高永清,Tel:(0760)88207955,E-mail:yongqingg@163.com

摘要：建立了高效液相色谱-三重四极杆质谱（HPLC-MS/MS）测定面粉中7种荧光增白剂（FWAs）的分析方法。在样品中加入30 mL乙酸乙酯，超声提取10 min，离心后在40℃下氮吹浓缩，用乙腈定容后，上机检测。选用Phenomenex Kinetex C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）分离，以0.1%（v/v）甲酸-乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子（ESI）源，在正离子、多反应监测（MRM）模式下进行扫描，外标法定量。7种荧光增白剂在各自范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，检出限（S/N=3）为0.50~2.65 μg/kg，定量限（S/N=10）为1.60~8.80 μg/kg；在3个添加水平下的平均加标回收率为64.8%~117.5%，相对标准偏差（n=6）为0.9%~14.4%。该方法操作简单、回收率高、精密度好，适于面粉中7种荧光增白剂的测定。

关键词：高效液相色谱-三重四极杆质谱荧光增白剂面粉

Determination of seven fluorescent whitening agents in flour by high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry

LI Rong¹, HE Chunmei^1,2, BO Yanna^1,3, ZHANG Pengjie¹, ZHANG Xianchen¹, HU Yiguang¹, GAO Yongqing²

1. Zhongshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhongshan 528400, China;
2. Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528458, China;
3. Institute of Packaging Engineering, Jinan University, Zhuhai 519070, China

Foundation Item: Science and Technology Plan Project of General Administration of Quality Supervision Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (No. 2015IK260); Science and Technology Plan Project of Guangdong Province of China (No. 2014A040401011); Social Public Welfare Major Project of Zhongshan City (No. 2015B2295)

Abstract: A method for the determination of seven fluorescent whitening agents (FWAs) in flour by high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was developed. The samples were extracted with ethyl acetate. Then the extracts were centrifuged, concentrated, diluted with acetonitrile and analysed by HPLC-MS/MS. The analysis was carried out on a Phenomenex Kinetex C₁₈ column (100 mm×2.1 mm, 2.6 μm) by gradient elution with (A) 0.1% (v/v) formic acid in acetonitrile and (B) water. Electrospray ionization (ESI) source was operated in the positive mode using multiple reaction monitoring (MRM) scanning mode. The results were quantitated by external standard method. The results indicated that the method had good linear relationships with correlation coefficients (r) not less than 0.99. The limits of detection (LODs) were 0.50-2.65 μg/kg and the limits of quantitation (LOQs) were 1.60-8.80 μg/kg. The average recoveries (n=6) at three spiked levels were in the range of 64.8%-117.5%, and the relative standard deviations (RSDs) were in the range of 0.9%-14.4%. The method has the advantages of simple operation, high recovery and good precision. It is suitable for the simultaneous determination of the seven FWAs in flour.

Key words: high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (HPLC-MS/MS) fluorescent whitening agents (FWAs) flour

荧光增白剂(FWAs),或称为白色染料,是一种能吸收不可见的紫外光再激发出可见的蓝色或蓝紫色荧光的复杂有机化合物^{[1, 2]}。FWAs因具有优异的增白性,被广泛应用于纺织、洗涤剂、造纸、颜料、油漆及塑料领域^[3]。FWAs具有潜在的致癌性^[4],近年来有不少商贩向食品中违法添加FWAs以掩盖食品发黄或不新鲜的品相,如果长期食用含有FWAs的食品,将对人体健康产生严重危害。我国在《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》中规定了FWA393、FWA184和FWA236在部分塑料中的最大使用量^[5],同时限制了FWA393、FWA184的特定迁移量(SML),分别为0.05 mg/kg和0.6 mg/kg,与欧盟的“限制和(或)规范”一致^[6]。国家质量监督检验检疫总局制定的《食品用纸包装、容器等制品生产许可实施细则》中规定“生产过程中不得使用荧光增白剂”^[7];卫生部为保障消费者健康,发布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》,明确指出添加在面粉中的荧光增白物质为违法添加的非食用物质。

目前有关检测纸制包装材料^[8-13]、食品接触塑料材料^{[3, 4, 12-15]}、洗涤剂^{[16, 17]}、纺织品^{[18, 19]}中FWAs的报道中，主要采用分光光度法^[14]、液相色谱法^{[16, 19]}和高效液相色谱-三重四极杆质谱(HPLC-MS/MS)法^[20]。分光光度法难以对多种荧光增白剂进行准确定性;液相色谱法抗干扰能力和灵敏度较差,对于复杂基质的检测,无法保证结果的准确性。HPLC-MS/MS法对复杂样品中的目标化合物具有高分离、高选择性和高灵敏度的优点。本文建立了高效液相色谱-三重四极杆质谱同时测定面粉中7种FWAs(化学结构式见图 1)的分析方法,实验证明所建方法快速简便,准确度高,灵敏度和精密度好,可有效检测面粉中7种荧光增白剂的含量。

图 1 7种荧光增白剂的结构式 Fig. 1 Chemical structures of the seven fluorescent whitening agents (FWAs)

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Triple Quad 5500高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(美国Sciex公司); 1875D超声波清洗器(美国CREST公司); EYELA MMV-1000W振荡器(日本RIKAKIKAI公司); CP2250天平(德国Sartorius公司); 0.22μm有机相滤膜(上海安谱公司)。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷(色谱纯,德国默克公司);三氯甲烷、丙酮、正己烷(色谱纯,中国赛默飞世尔科技有限公司);四氢呋喃、甲酸(色谱纯,上海安谱公司);甲苯(分析纯,广州化学试剂厂);实验用水为Milli-Q制备的超纯水。FWA135(纯度99.0%)、FWA140(纯度98.0%)、FWA162(纯度95.0%)、FWA184(纯度98.0%)、FWA185(纯度98.0%)、FWA367(纯度98.0%)、FWA393(纯度98.0%)7种荧光增白剂标准品均购自上海安谱公司。实验用面粉购于当地市场、超市和粮油店。

1.2 标准溶液的配制

用三氯甲烷配制质量浓度为1 000mg/L的7种FWA标准储备液;用甲醇稀释成所需质量浓度的7种FWA混合标准溶液和标准工作液,于4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

准确称取1 g试样(精确至0.01 g)置于50 mL聚丙烯离心管中,加入30 mL乙酸乙酯,涡旋30 s后,振荡10 min,于25 ℃超声提取10 min,冷却至室温,以4 500 r/min离心5 min,取6 mL上清液于40 ℃水浴中氮吹至干,用乙腈定容至1 mL,过0.22 μm有机相滤膜,待测。

1.4 色谱条件

色谱柱:Phenomenex Kinetex C₁₈柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm);流动相:(A)0.1%(v/v)甲酸-乙腈,(B)水。梯度洗脱程序:0～1.0 min,10%A; 1.0～15.5 min,90%A; 15.5～20.0 min,10%A。流速:0.3 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:10 μL。

1.5 质谱条件

离子源:电喷雾离子(ESI)源;正离子模式;离子源温度:450 ℃;电喷雾电压:5 500 V;雾化气(GS1,N₂)压力:310 kPa (45 psi);辅助雾化气(GS2,N₂)压力:345 kPa (50 psi);碰撞气(CAD,N₂)压力:48 kPa (7 psi);气帘气体(CUR,N₂)压力:241 kPa (35 psi);碰撞室出口电压(CXP): 14 eV;多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表 1。

表 1 7种荧光增白剂的质谱参数 Table 1 Mass parameters of the seven FWAs

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

由于7种待测物在C₁₈柱上的保留时间较长,需要在纯有机相下才可完成洗脱分离,因此,为使流动相体系在纯有机相时间段仍可保持在一个稳定的酸性环境,分别采用0.1%(v/v)甲酸-乙腈和0.1%(v/v)甲酸-甲醇作为有机流动相,考察7种FWAs色谱峰的峰形和响应强弱。结果表明,7种FWAs在两种有机流动相中的仪器响应值无显著性差异,但0.1%(v/v)甲酸-甲醇作为有机流动相时,FWA393出现拖尾峰;而采用0.1%(v/v)甲酸-乙腈时,各目标化合物的峰形均较好。因此最终选择0.1%(v/v)甲酸-乙腈作为流动相中的有机相。7种FWAs混合标准溶液的选择离子色谱图见图 2。

图 2 7种FWAs混合标准溶液的选择离子色谱图 Fig. 2 Selected ion chromatograms of the seven FWAs in a mixed standard solution FWA135,FWA140,FWA162 and FWA393: 32μg/L; FWA184,FWA185 and FWA367: 64 μg/L.

根据待测物的性质,比较了Phenomenex Kinetex C₁₈(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和Phenomenex Kinetex C₁₈(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)色谱柱对分离效果的影响。结果表明,采用1.7 μm的色谱柱时,FWA135的色谱峰出现拖尾现象;采用2.6 μm的色谱柱时,全部目标化合物均可获得较好的峰形。因此,本方法确定选用Phenomenex Kinetex C₁₈(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)色谱柱。

2.2 提取条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

本实验比较了甲醇、乙腈、四氢呋喃、三氯甲烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、甲苯作为提取溶剂时,自制阳性面粉(空白面粉中加入适量的混合标准溶液)中7种FWAs的回收率(见图 3)。采用三氯甲烷时,提取液呈浑浊状态,溶剂提取难度大;采用二氯甲烷时,面粉中7种FWAs的回收率均低于60%;采用丙酮时,阳性面粉中FWA184和FWA367的回收率低于60%;采用甲醇和四氢呋喃时,FWA393的回收率极低;采用正己烷和甲苯时,FWA367的回收率极低;采用乙腈和四氢呋喃时,FWA140和FWA184的回收率高于120%;采用乙酸乙酯时,自制阳性面粉中7种FWAs的回收率为73.1%～118.6%。因此,本实验选用乙酸乙酯作为提取溶剂。

图 3 不同提取溶剂对7种FWAs回收率的影响 Fig. 3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the seven FWAs

2.2.2 提取温度的选择

准确称取1.0 g自制阳性面粉,加入10 mL乙酸乙酯、超声提取20 min,在氮吹温度为30 ℃的条件下,比较不同的超声温度(25、35、45和55 ℃)对7种FWAs回收率的影响。如图 4所示,7种FWAs的回收率随着温度的上升而逐渐下降。因此,本实验最终将超声温度设为25 ℃。

图 4 不同超声温度对7种FWAs回收率的影响 Fig. 4 Effect of different ultrasonic temperatures on the recoveries of the seven FWAs

2.2.3 提取时间的选择

本实验考察了不同提取时间(10、20、30、40 min)对7种FWAs回收率的影响(见图 5)。当超声时间为10 min和20 min时,7种FWAs的回收率均较高且差别不大;当超声时间为30 min时,FWA367和FWA393的回收率均低于60%;当超声时间为40 min时,FWA185和FWA393的回收率均低于60%。因此,最终将超声提取时间设为10 min。

图 5 不同超声时间对7种FWAs回收率的影响 Fig. 5 Effect of different ultrasonic times on the recoveries of the seven FWAs

2.2.4 提取溶剂体积的选择

准确称取1.0 g自制阳性面粉,在超声温度25 ℃、时间10 min,氮吹温度30 ℃的条件下,考察不同体积(10、20、30、40 mL)的提取溶剂对7种FWAs回收率的影响(见图 6)。不同的提取溶剂体积对FWA135、FWA140和FWA162的回收率影响不大,FWA367和FWA393在提取溶剂体积为30 mL时,回收率较好。故最终将提取溶剂体积设为30 mL。

图 6 不同提取溶剂体积对7种FWAs回收率的影响 Fig. 6 Effect of different volumes of extraction solventson the recoveries of the seven FWAs

2.2.5 氮吹温度的选择

本实验考察了不同氮吹温度(30、40、50和60 ℃)对7种FWAs回收率的影响(见图 7)。不同氮吹温度下,FWA135、FWA140和FWA162的回收率差异不大,而氮吹温度为40 ℃时,FWA184、FWA185、FWA367和FWA393的回收率较高。因此最终将氮吹温度设为40 ℃。

图 7 不同氮吹温度对7种FWAs回收率的影响 Fig. 7 Effect of different nitrogen blowing temperatures on the recoveries of the seven FWAs

2.3 线性范围、检出限和定量限

在优化的条件下,以7种目标化合物的峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X,μg/L)绘制标准曲线,7种FWAs在各自范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.99。方法的检出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)结果见表 2。该方法线性关系良好，灵敏度高。

表 2 7种FWAs的线性范围、线性方程、相关系数(r)、检出限及定量限 Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (r),limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the seven FWAs

2.4 回收率和精密度

在阴性样品基质中进行10、50、100 μg/kg 3个添加水平的加标回收率试验,每个添加水平重复6次,7种FWAs的回收率和精密度结果见表 3。3个添加水平的平均回收率为64.8%～117.5%,相对标准偏差为0.9%～14.4%,表明方法具有良好的准确度和精密度。

表 3 面粉中7种FWAs的加标回收率和相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the seven FWAs spiked in flour (n=6)

2.5 实际样品分析

从市场、超市、粮油店随机购买21批不同种类的面粉,在最优条件下进行样品处理和色谱分析。如表 4所示,在实际面粉样品中,FWA135、FWA184、FWA185和FWA393均有检出,其中FWA184和FWA185检出频率最高。其中典型阳性样品的总离子流色谱图见图 8。

表 4 实际面粉样品中7种FWAs的含量 Table 4 Contents of the seven FWAs in real flour samples

图 8 实际样品中FWAs的总离子流色谱图 Fig. 8 Total ion chromatogram of FWAs in a real sample

实际样品中检出荧光增白剂的原因可能为:样品包装材料中的荧光增白剂发生迁移;样品在生产过程中接触到的管道、容器等可能用含有荧光增白剂的洗涤剂清洗过;不法商家为了达到增白目的而违法添加了荧光增白剂。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱-三重四极杆质谱检测面粉中7种荧光增白剂的分析方法。该方法简单、快速、高效,可满足日常监测的需求,适于大批量面粉中7种荧光增白剂的定性和定量分析。

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