色谱  2017, Vol. 35 Issue (4): 427-431   PDF    
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严丽娟
李文斌
洪煜琛
吴敏
徐敦明
林立毅
顾春燕
液相色谱-大气压化学电离串联质谱法测定婴幼儿配方奶粉中的维生素D
严丽娟1 , 李文斌2 , 洪煜琛1 , 吴敏1 , 徐敦明1 , 林立毅1 , 顾春燕2     
1. 厦门出入境检验检疫局技术中心, 福建 厦门 361026;
2. 北京迪马科技有限公司, 北京 100029
收稿日期：2016-10-12
基金项目：福建省自然科学基金项目（2016J01071，2014J01057）；长三角科技合作项目（15395810100，16395810100）
通讯联系人：徐敦明, Tel:(0592)7250900, E-mail:xudm@xmciq.gov.cn
摘要：建立了婴幼儿配方奶粉中维生素D的液相色谱-大气压化学电离串联质谱（LC-APCI-MS/MS）分析方法。样品经正己烷和甲基叔丁基醚混合溶液提取，ProElut VDC固相萃取柱净化，Kinetex C18色谱柱分离，采用大气压化学电离（APCI）源、正离子扫描和多反应监测（MRM）模式对维生素D2和维生素D3进行检测，内标法定量。结果表明维生素D2和维生素D3在5~5000 μg/L范围内均具有良好的线性关系，检出限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg。在5、10和100 μg/kg添加水平下，维生素D2和维生素D3的回收率为85.2%~105.3%，相对标准偏差为4.7%~8.1%。该方法简便准确，灵敏度高，适用于婴幼儿奶粉中维生素D的测定。
关键词： 液相色谱-大气压化学电离串联质谱     维生素D     婴幼儿配方奶粉    
Determination of vitamin D in infant formula using liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry
YAN Lijuan1, LI Wenbin2, HONG Yuchen1, WU Min1, XU Dunming1, LIN Liyi1, GU Chunyan2     
1. Technology Center of Xiamen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361026, China;
2. Beijing Dikma Technologies Inc., Beijing 100029, China
Foundation item: Natural Science Foundation of Fujian Province (Nos. 2016J01071, 2014J01057); Yangtze River Delta Science and Technology Cooperation Project (Nos. 15395810100, 16395810100)
Abstract: A method using liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry (LC-APCI-MS/MS) was developed for the determination of vitamin D in infant formula. The milk powder sample was extracted with hexane and tert-butyl methyl ether followed by clean-up with ProElut VDC cartridge. The LC separation was performed on Kinetex C18 column (100 mm×4.6 mm, 2.6 μm) by a gradient elution using water and acetonitrile as the mobile phases with a flow rate of 1.0 mL/min. Identification of vitamin D2 and vitamin D3 was achieved by APCI-MS/MS using multiple reaction monitoring (MRM). The quantification analysis was performed by internal standard method. The calibration curves showed a good linearity in the range of 5-5000 μg/L. The limits of detection (LODs) for vitamin D2 and vitamin D3 in the formula were 2 μg/kg. The limits of quantification (LOQs) for vitamin D2 and vitamin D3 in the formula were 5 μg/kg. The average recoveries of vitamin D from milk powder spiked at 5, 10 and 100 μg/kg levels were between 85.2% and 105.3%, and the relative standard deviations were between 4.7% and 8.1%. The simple, accurate and sensitive method is suitable for the determination of vitamin D in infant formula.
Key words: liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry (LC-APCI-MS/MS)     vitamin D     infant formula    

维生素D为固醇类衍生物, 是一种重要的脂溶性维生素。维生素D参与人体内分泌系统对骨骼和无机盐的代谢调节, 对于人体健康有诸多益处, 具有预防佝偻病和调节人体钙吸收的作用, 还能起到有效治疗软骨病的功效。维生素D是一种激素的前体, 可由人体皮肤合成, 合成量具有波动性, 维生素D家族成员中最重要的成员是维生素D2(麦角钙化醇) 和维生素D3(胆钙化醇)。在阳光充足的情况下, 人体自身可以合成维生素D3。婴幼儿是维生素D缺乏的潜在高危人群, 维生素D缺乏易患佝偻病, 引起生长迟缓和骨骼变形, 童年时保证摄入足够的维生素D能降低成年后患骨质疏松症的风险。婴幼儿奶粉中维生素D允许使用的添加形式为维生素D2或维生素D3[1]。

目前乳制品中维生素D的检测过程通常是先将样品进行皂化处理, 然后用有机溶剂进行液液萃取, 采用液相色谱法[2-7]或液相色谱-质谱联用法[8-14]分析。由于样品中维生素D含量低, 基质干扰严重, 且前处理过程繁琐, 维生素D损失较大, 很难对维生素D进行准确的定性和定量检测。本文改进了婴幼儿配方奶粉中维生素D的测定方法, 样品未经皂化, 直接提取, 然后通过ProElut VDC固相萃取柱净化, 用高效液相色谱-串联质谱法进行测定, 同位素内标法定量, 有效地降低了基质干扰, 操作过程简单, 为婴幼儿奶粉中维生素D的检测提供了更为简便有效的方法。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1290高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司); QTRAP 6500质谱仪, 配有大气压化学电离 (APCI) 源 (美国AB SCIEX公司); 硅胶、N-丙基乙二胺 (PSA)、弗罗里硅土 (Florisil) 和ProElut VDC (2 g/12 mL) 固相萃取柱 (北京迪马公司)。Allegra 64R型高速冷冻离心机 (美国Beckman Coulter公司); 旋涡混合器 (德国IKA公司); N-1000旋转蒸发仪 (日本EYELA公司); Fotector-06自动固相萃取仪 (厦门睿科公司); 自动氮吹浓缩仪 (美国Capiler Life Sciences公司); UV-2450紫外分光光度计 (日本岛津公司); CP225D电子分析天平 (德国Sartorius公司)。

甲醇、乙腈、无水乙醇、正己烷、乙酸乙酯和二甲基亚砜均为色谱纯 (美国Merck公司); 甲基叔丁基醚和柠檬酸均为分析纯 (国药集团化学试剂有限公司)。维生素D2(纯度99.1%) 和维生素D3(纯度99.9%) 标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司, 同位素内标d3-维生素D3(纯度97%) 购自美国IsoSciences公司。Phenomenex Kinetex C18色谱柱 (100 mm×4.6 mm, 粒径2.6 μm) 购自美国菲罗门公司。实验用水由Milli-Q系统 (美国Millipore公司) 制得。

准确称取适量标准品, 分别用无水乙醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中。维生素D2和维生素D3标准储备液配制后需要通过紫外吸光值进行校正, 具体步骤同GB 5413.9-2010附录A。移取各标准储备溶液, 用无水乙醇稀释成质量浓度为10.0 mg/L的混合标准中间溶液, 于-18 ℃下避光保存。根据需要用乙醇逐级稀释, 配成适当质量浓度的混合标准溶液, 现用现配。

1.2 样品前处理

称取2.0 g样品于50 mL离心管中, 加入15 μ L 10 mg/L d3-维生素D3内标, 再加入5 mL质量分数为20%的柠檬酸水溶液, 充分混匀, 加入8 mL二甲基亚砜和10 mL甲醇, 振荡提取5 min。然后加入15 mL正己烷-甲基叔丁基醚 (1:1, v/v), 振荡提取5 min, 以6 000 r/min的速度离心2 min, 收集上清液。再向残渣中加入10 mL正己烷-甲基叔丁基醚 (1:1, v/v), 重复提取一次, 合并上清液。最后将上清液在35 ℃下减压蒸馏至近干, 加入5 mL正己烷, 待净化。

自动固相萃取流程:依次用10 mL乙酸乙酯和10 mL正己烷活化ProElut VDC固相萃取柱, 待净化液过柱后, 弃去流出液; 依次加入10 mL正己烷和10 mL乙酸乙酯-正己烷 (1:9, v/v) 淋洗, 弃去流出液; 再加入20 mL乙酸乙酯-正己烷 (1:9, v/v) 洗脱, 收集流出液。将洗脱液在35 ℃下减压蒸馏至近干, 用甲醇定容至1 mL, 经0.22 μm滤膜过滤后, 供液相色谱-质谱分析。

1.3 液相色谱与质谱条件
1.3.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex Kinetex C18色谱柱; 柱温:35 ℃; 流速:1.0 mL/min; 进样量:5 μ L; 流动相:水 (A相) 和乙腈 (B相)。梯度洗脱程序:0~4.0 min, 90%B; 4.1~8.0 min, 100%B; 8.1~12.0 min, 90%B。

1.3.2 质谱条件

离子源:APCI; 扫描方式:正离子扫描; 检测方式:多反应监测 (MRM); 喷雾气 (GS1) 压力:448 kPa; 气帘气 (CUR) 压力:207 kPa; 碰撞气 (CAD): medium; 离子源温度:350 ℃; 电流 (NC): 3.0 μ A; 入口电压 (EP): 10 V; 出口电压 (CXP): 10 V; 驻留时间 (dwell time): 50 ms。MRM监测离子对、化合物保留时间、去簇电压 (DP) 和碰撞能量 (CE) 等参数列于表 1。

表 1 MRM扫描模式下维生素D2和维生素D3的质谱参数 Table 1 MS parameters of vitamin D2 and vitamin D3 in MRM scan mode
2 结果与讨论
2.1 提取溶剂的选择

通常使用包被技术来提高婴幼儿配方奶粉中添加的维生素D的抗氧化性能, 但这也给维生素D的提取和检测带来了较大的难度。文献[5]报道的破壁技术主要有酶解法、酸水解法、皂化法和有机溶剂法。酶解法和皂化法需要的实验时间长, 过程繁琐, 而维生素D本身不稳定, 不宜用酸水解法。由于二甲基亚砜具有极强的穿透性, 加入柠檬酸水溶液和二甲基亚砜作为破壁溶液, 可破坏维生素D外层的包被物质, 加速维生素D的溶出, 同时加入甲醇以提高奶粉样品和破壁溶液的互溶性, 以正己烷和甲基叔丁基醚混合溶剂作为提取试剂, 可获得满意的回收率。

2.2 固相萃取条件的优化

比较了硅胶、PSA、弗罗里硅土 (Florisil)、ProElut VDC等固相萃取柱, 发现硅胶、PSA、Florisil等固相萃取柱对奶粉样品的净化效果不佳, 不能去除奶粉中的油脂和其他干扰物。ProElut VDC固相萃取柱由PSA和硅胶两种吸附剂按照一定的比例分层填装而成。PSA吸附剂通过弱阴离子交换作用和氢键作用吸附样品中的有机酸类、蛋白质、油脂和碳水化合物等杂质, 实现样品的净化, 同时通过金属螯合作用, 吸附提取液中微量的重金属, 可对样品基质进一步净化。硅胶吸附剂通过弱阳离子交换作用和氢键作用, 吸附样品中的蛋白质等含碱性基团的化合物, 同时硅胶表面的硅羟基可与维生素D2和维生素D3形成氢键, 在一定极性的有机溶剂洗脱条件下, 实现样品与杂质的分离净化。

比较了体积分数为5%、10%和20%的乙酸乙酯正己烷作为淋洗液和洗脱液对维生素D回收率的影响。试验发现, 当乙酸乙酯的体积分数低于10%时, 维生素D均不能被完全洗脱下来; 而当乙酸乙酯的体积分数高于10%时, 旋蒸瓶中会出现油, 并且在淋洗步骤就已经把维生素D洗脱下来, 导致回收率偏低, 因此最终使用10 mL体积分数为10%的乙酸乙酯正己烷淋洗, 再用20 mL体积分数为10%的乙酸乙酯正己烷洗脱。

2.3 质谱条件的优化

脂溶性维生素极性较小, 没有质子化位点, 较难在溶液中形成质子化的离子或去质子化离子, 在电喷雾电离 (ESI) 模式下的检测灵敏度较差, 因此本试验采用APCI模式检测维生素D, 可获得较高的灵敏度。采用针泵连续进样, 在正离子模式下, 分别对0.1 mg/L维生素D2和维生素D3标准溶液进行一级质谱扫描, 确定较强的峰[M+H]+为其母离子, 优化各母离子的去簇电压。然后分别对其子离子进行二级质谱扫描, 选择丰度较高、干扰较小的两对子离子为定性离子, 丰度最高的离子作为定量离子, 然后优化其碰撞能量。优化后的质谱参数见表 1。

2.4 线性范围和检出限

取质量浓度为5、50、500、1 000和5 000 μg/L的系列混合标准溶液进行测定, 以维生素D与同位素内标色谱峰的峰面积比值为纵坐标，以系列混合标准溶液的质量浓度为横坐标 (单位μg/L)，分别绘制维生素D2、维生素D3的标准曲线。如表 2所示, 在5~5 000 μg/L范围内, 维生素D2和维生素D3的质量浓度与对应的峰面积比值呈现良好的线性关系, 相关系数均大于0.999。在空白奶粉样品中添加混合标准溶液, 分别以3倍和10倍信噪比来确定方法的检出限和定量限, 维生素D2和维生素D3的检出限为2 μg/kg, 定量限为5 μg/kg。本方法测定维生素D的线性范围宽, 灵敏度高。图 1为优化的色谱和质谱条件下, 维生素D2和维生素D3混合标准溶液和实际奶粉样品的MRM色谱图。

表 2 维生素D2和维生素D3的线性范围、线性方程、相关系数 (r)、检出限和定量限 Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of vitamin D2 and vitamin D3

图 1 (a) 维生素D2和维生素D3混合标准溶液和 (b) 实际奶粉样品的MRM色谱图 Fig. 1 MRM chromatograms of (a) vitamin D2 and vitamin D3 mixed standard solution (b) and real formula sample
2.5 回收率试验

在空白奶粉样品中分别添加5、10和100 μg/kg维生素D2和维生素D3混合标准溶液, 按本文所述方法进行提取、净化和测定, 每个添加水平重复3次。如表 3所示，维生素D2和维生素D3的平均回收率为85.2% ~105.3%, 相对标准偏差为4.7% ~8.1%。该方法可获得较满意的回收率和精密度。

表 3 空白奶粉中添加维生素D2和D3的平均回收率及精密度 (n=3) Table 3 Average recoveries and precisions of vitamin D2 and D3 spiked in blank milk powder (n=3)
2.6 实际奶粉样品的测定

取3个不同品牌婴幼儿配方奶粉样品, 按照上述方法处理样品并测定, 计算待测样品溶液中维生素D2和D3的浓度。各奶粉样品中均未检出维生素D2, 维生素D的测定结果见表 4。

表 4 婴幼儿配方奶粉样品中维生素D2和D3的测定结果 Table 4 Testing results of vitamin D2 and D3 in infant formula
3 结论

本实验建立了婴幼儿配方奶粉中维生素D的测定方法, 可操作性强, 采用固相萃取小柱净化的方法, 大大缩短了分析时间, 并具有较好的回收率和重复性, 有较高的实际应用价值。对比GB 5413.9-2010, 本方法不需要两台液相色谱完成维生素D的净化和检测, 用PrElut VDC固相萃取柱代替国标中的硅胶色谱柱进行净化, 简化了前处理步骤, 降低了检测成本, 并能有效去除油脂等杂质, 保证了实验结果的准确性。

参考文献
[1] GB 14880-2012
[2] GB 5413.9-2010
[3] Blanco D, Fernandez M P, Gutierrez M D. Analyst, 2000, 125(3): 427. doi: 10.1039/a909027d
[4] Kaushik R, Sachdeva B, Arora S, et al. Food Chem, 2014: 151, 225.
[5] Zhao R, Xue Y, Wu G H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2008, 26(1): 113.
赵榕, 薛颖, 吴国华, 等. 色谱, 2008, 26(1): 113.
[6] Zhang Y H, Qibule H, Jin Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(3): 291.
张艳海, 其布勒哈斯, 金燕, 等. 色谱, 2015, 33(3): 291. doi: 10.3724/SP.J.1123.2014.11009
[7] Zhang Y H, Zhu X Y, Cao G Z, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41(5): 771.
张艳海, 朱晓艳, 曹国洲, 等. 分析化学, 2013, 41(5): 771.
[8] Trenerry V C, Plozza T, Caridi D, et al. Food Chem, 2011, 125(4): 1314. doi: 10.1016/j.foodchem.2010.09.097
[9] Heudi O, Trisconi M J, Blake C J. J Chromatogr A, 2004, 1022: 115. doi: 10.1016/j.chroma.2003.09.062
[10] Cao H, Chen X Z, Wang J, et al. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2012, 33(4): 232.
曹慧, 陈小珍, 王瑾, 等. 质谱学报, 2012, 33(4): 232.
[11] Kwak B M, Jeong I S, Lee M S, et al. Food Chem, 2014: 165, 569.
[12] Huo Y M, Wang J, Duan W Z, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2016, 35(3): 327.
霍艳敏, 王骏, 段文增, 等. 分析测试学报, 2016, 35(3): 327.
[13] Gomes F P, Shaw P N, Whitfield K, et al. Anal Chim Acta, 2015, 891: 211. doi: 10.1016/j.aca.2015.08.017
[14] Zhao K X, Lou T T, He J, et al. Journal of Instrmental Analysis, 2015, 34(12): 1372.
赵孔祥, 娄婷婷, 何佳, 等. 分析测试学报, 2015, 34(12): 1372.