蛋白质末端和丰富的末端修饰直接参与和调节蛋白质的各项生理功能[1-3]。例如, 蛋白质N末端的氨基酸种类与蛋白质的半衰期密切相关[4]; 蛋白质的C末端作为一种重要的特征识别分子, 参与蛋白质复合体的形成、蛋白质导向、蛋白质亚细胞器锚定等众多生物过程[5]; 蛋白质N末端的信号肽切除、乙酰化、谷氨酸环化等, 与蛋白质的定位、稳定性、活性等相关[6]; 蛋白质C末端的糖基磷脂酸肌醇修饰可将蛋白质锚定于膜的脂质层[7]; C末端碱性氨基酸的剪切和酰胺化与肽类激素和神经肽的活化相关[5]。而且, 蛋白质的末端具有较高的序列特异性, 仅仅对末端少数几个氨基酸的序列测定就可以实现对大多数蛋白质的可靠鉴定[8]。对酵母蛋白质数据库的统计分析表明, 蛋白质N末端和C末端5个氨基酸残基序列分别对于84%和94%的蛋白质是特异的[9]。因此, 蛋白质末端肽的特异性分析不仅有助于同源蛋白质异构体的分辨[5, 10, 11], 而且可以显著降低蛋白质组样品的复杂程度, 有利于低丰度蛋白质的鉴定[12]。由于末端肽的序列具有高度特异性, 而且通常位于蛋白质的表面[13], 因此末端肽还可以作为蛋白质的抗原决定基来合成相应的抗体, 实现对具有重要生物意义且缺乏商品化抗体的低丰度蛋白质的选择性富集和生物学验证[14]。此外, 蛋白质的限制性水解是生物体内最常见的翻译后修饰之一, 在信号传导、细胞凋亡、癌症发生发展等众多生理和病理过程中发挥重要作用[15]。蛋白质的水解促使蛋白质产生新的末端(neo末端), 因此蛋白质neo末端的测定有助于解释蛋白水解相关的生物过程, 并实现蛋白酶作用底物和位点的识别。
综上所述, 蛋白质的末端包含丰富的结构和功能信息。因此, 近年来蛋白质末端的研究受到了越来越广泛的关注。传统的基于Edman降解和烷基化反应的蛋白质N末端和C末端测序仅适用于单一蛋白质的分析[16-18]。随着软电离生物质谱的不断发展, 基于串联质谱技术的蛋白质末端分析也随之孕育而生。其中, “top-down”策略可对蛋白的全序列进行分析, 然而受限于有限的质谱解析能力和分析通量, 其难以应用于复杂体系的分析。“bottom-up”策略为蛋白质组末端提供了一种高灵敏度和高通量的分析手段。但是, 生物样品中蛋白质组分复杂, 丰度动态范围广, 而且“bottom-up”策略产生的大量非末端肽严重干扰了末端肽的鉴定。因此, 发展蛋白质组末端肽的富集方法对于蛋白质末端组的研究至关重要。基于此, 本文对近年来报道的蛋白质末端肽分离富集策略及其在蛋白酶作用底物和位点研究中的应用进行了综述。
N末端肽的富集策略可分为正向富集和反向富集。正向富集通过在蛋白质N末端引入富集靶标, 利用靶标的捕捉对蛋白质的N末端肽进行富集。反向富集则通过非N末端肽的去除实现N末端肽的富集[19]。
基于胍基化反应的选择性, Norioka等[20]采用胍基化反应对蛋白质侧链的氨基进行封闭, 进而在蛋白质的N末端α -氨基上引入含生物素的标签。标记的蛋白质经过酶解后, 利用亲和素与生物素之间的亲和作用, 将带有生物素的N末端肽进行选择性的富集。然而生物素与亲和素间的强相互作用会导致捕获的N末端肽难以解离, 从而影响N末端肽的回收率。针对此问题, Salvesen等[21]采用含二硫键和生物素的标签对蛋白质N末端α -氨基进行标记, 基于生物素与亲和素的相互作用对N末端肽进行捕获, 通过二硫键的还原断裂实现N末端肽的温和释放(见图 1a)。Qian等[22]则采用含巯基的标签对蛋白质N末端α -氨基进行标记, 通过二硫键交换反应将N末端肽捕获于固相材料上, 最后将二硫键还原, 释放N末端肽。
基于Edman降解的特性, Xu等[23]采用异硫氰酸苯酯对蛋白质进行修饰, 使蛋白质的N末端α -氨基和侧链氨基同时发生异硫氰酸苯酯标记; 发生异硫氰酸苯酯修饰的N末端在三氟乙酸的作用下发生酰胺键的断裂, 使蛋白质丢失一个氨基酸, 暴露出新的N末端α -氨基; 通过暴露的α -氨基特异性地在蛋白质的N末端引入含二硫键和生物素的标签; 标记的蛋白质酶解后, 通过亲和素功能化材料捕获带有生物素标签的N末端肽, 去除其余肽段, 还原二硫键, 释放捕获的N末端肽(见图 1b)。
枯草蛋白酶BPN (bacterial proteinase novo) 同时具有酰胺键水解活性和催化肽段合成的酯酶活性，经P225A/S221C (225位的脯氨酸突变为丙氨酸/221位的丝氨酸突变为半胱氨酸) 改造的枯草蛋白酶BPN (subtiligase) 的酰胺键水解活性大幅度下降，但仍保留较高的酯酶活性。Wells等[24]利用subtiligase的酯酶活性, 发展了一种蛋白质N末端α -氨基绝对选择性标记方法。该方法的原理为:subtiligase与肽段底物形成的硫代酸酯中间体在蛋白质N末端α -氨基的作用下发生氨解, 从而将肽段底物引入蛋白质的N末端; 该肽段底物含有一段TEV (tobacco etch virus) 蛋白酶的剪切序列, 并在尾部含有一个生物素基团; 标记的蛋白质酶解后, 采用亲和素固载材料对带有生物素基团的N末端肽进行捕获, 通过TEV蛋白酶对肽段底物的剪切释放捕获的N末端肽(见图 1c)。酶催化的绝对特异性使基于subtiligase的富集方法具有选择性高、可信度高、快速简便等优点。但是该方法通常需要大量的初始样品量(50~100 mg), 不适合微量样品的蛋白质N末端组分析。
虽然以上所述正向富集能够实现蛋白质N末端的选择性富集, 但是生物体内大部分蛋白质的N末端α -氨基发生了内源性的修饰(真核生物中80%蛋白质的N末端α -氨基发生了乙酰化[15]), 阻碍了富集靶标的引入。因此, 采用正向富集策略往往无法获得全面的N末端信息。反向富集则为蛋白质组N末端肽的全面分析提供了一种新思路。N末端肽反向富集的常规流程是:将蛋白质上所有自由氨基进行封闭; 酶解蛋白质, 非N末端肽重新带上一个自由氨基, N末端肽不含自由氨基; 通过非N末端肽的自由氨基对非N末端肽进行捕获, 残留于溶液中的即为N末端肽。
利用材料表面所带的功能基团与氨基的化学反应, 可以将非N末端肽直接键合在氨基反应活性材料上, 通过材料的分离去除非N末端肽。已有多种材料被报道用于非N末端肽的去除, 包括N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖[25]、溴化氰活性琼脂糖[26]、异氰酸树脂[27]、醛基功能化材料[28]等[29, 30]。氨基反应活性材料虽然能快速简便地将非目标肽段去除, 但是受限于固-液反应效率的不足, 非目标肽段难以被去除完全。
利用液-液反应的高效率, 人们发展了一系列基于亲和基团标记的反向富集策略。该策略采用带有亲和基团的功能化试剂对非N末端肽进行标记, 通过亲和基团与相应亲和材料的相互作用对非N末端肽进行去除。例如, Beynon等[12]对非N末端的自由氨基进行生物素标记, 通过生物素与亲和素的亲和作用去除非N末端肽; Mommen等[31]采用磷酸化试剂对非N末端肽的氨基进行磷酸化标记, 带上磷酸根的非N末端肽采用二氧化钛颗粒进行去除。
由于大量非N末端肽的存在, 上述基于氨基反应活性材料和亲和基团标记的富集方法需要使用大量的功能化材料去除非N末端肽, 导致N末端肽段严重的非特异性吸附损失。Gevaert等[33]发展了一种基于对角线色谱的N末端肽富集方法, 称为COFRADIC (combined fractional diagonal chromatography)。该方法首先将蛋白质N末端氨基和侧链氨基乙酰化。蛋白质酶解后, 使用反相色谱对肽段混合物进行分离, 并收集级分。然后, 采用2, 4, 6-三硝基苯磺酸等疏水基团对分级后各组分进行衍生, 并对各个级分进行第二次色谱分离。非N末端肽由于带上疏水基团, 在第二次反相色谱上的保留显著增强, 从而与N末端肽分离(见图 1d)。Zahedi等[34]则发展了一种基于强阳离子交换的对角线色谱。该方法基于对角线色谱的原理, 采用强阳离子交换色谱对肽段混合物进行分级, 并对非N末端肽进行乙酰化修饰, 以改变非N末端肽的电荷数目, 使非N末端肽在强阳离子色谱上的保留减弱, 从而在第二次强阳离子交换色谱中与N末端肽分离。基于对角线色谱的N末端肽分离策略虽然避免了功能化材料的引入, 然而分离过程繁琐, 耗时耗力, 而且较多的样品纯化过程导致了样品的损失。Overall等则[35]发展了一种基于水溶性高分子聚合物的反向去除方法, 称为TAILS (terminal amine isotopic labeling of substrates)。该方法通过合成一种醛基功能化的高分子聚合物, 利用醛基与氨基的反应将非N末端肽连接于聚合物链上, 采用超滤膜分离聚合物, 从而去除非N末端肽(见图 1e)。由于聚合物的醛基含量高且水溶性好, 因此非N末端肽得到了高效的去除, 且减少了N末端肽的非特异吸附。Schilling等[32]基于氨基与醛基的Schiff碱还原反应, 使非N末端肽带上4个磺酸根, 磺酸根标记的非N末端肽采用强阳离子交换色谱去除。但是该方法会造成弱碱性N末端肽的丢失。本研究组[36]则发展了一种基于疏水基团标记的蛋白质N末端肽富集方法, 称为HYTANE (hydrophobic tagging-assisted N-termini enrichment)。该方法通过氨基与醛基的Schiff碱还原反应, 使非N末端肽标记上两条C16链, 基于双C16链与C18材料的强烈相互作用, 可以在常规的样品除盐过程中对非N末端肽进行简便快速的共去除。
相比于蛋白质N末端, 蛋白质C末端的分析技术一直处于落后状态, 其主要原因为:1) 羧基的反应活性较低, 从而难以对C末端或非C末端肽进行高效率的标记; 2) 侧链羧基和C末端α -羧基的反应活性相近, 难以实现选择性的标记; 3) C末端肽羧基端缺乏碱性氨基酸, 因此离子化效率低, 二级碎裂谱图质量差, 导致其质谱鉴定效率低。目前所发展的C末端肽富集方法同样可分为正向富集和反向富集[37], 以下将对C末端肽的富集策略进行详述。
羧肽酶Y是一种从蛋白质或肽段羧基端开始逐个切除氨基酸的外切酶, 它不仅具有酶切活性, 同时具有转肽酶活性, 可以催化C末端α -羧基上胺类化合物的引入。Xu等[38]发现在强碱性条件下, 羧肽酶的酶切活性被抑制, 但仍保持转肽酶活性。基于此性质, 采用羧肽酶在强碱性条件下酶促蛋白质C末端α -羧基上生物素基团的标记, 并通过生物素和亲和素的相互作用, 实现C末端肽的捕获。虽然该方法可以实现C末端羧基的特异性标记, 但是对C末端的氨基酸有偏向性; 采用该方法从大肠杆菌提取蛋白质中鉴定到了76条C末端肽。
恶唑酮化学是一种能够特异性对蛋白质或肽段C末端α -羧基进行衍生的反应, 其机理为:在甲酸和乙酸酐的存在下, 蛋白质C末端的α -羧基能与γ位的羰基形成恶唑酮五元环; 但是, 天冬氨酸和谷氨酸侧链上的羧基由于其γ位不存在羰基, 所以无法形成恶唑酮五元环结构; 恶唑酮五元环能够迅速与五氟苯酚反应形成相对稳定的酯类中间体; 在有机胺类化合物的存在下, 五氟苯酚能够被取代, 酯类中间体转化为酰胺类产物, 从而将胺类化合物高特异性地标记于蛋白质或肽段C末端的α -羧基上。基于恶唑酮化学, Lu等[39]采用一端带有生物素, 另一端带有精氨酸的双功能试剂对蛋白质C末端的α -羧基进行特异性标记, 标记的蛋白质经酶解后, 利用链霉亲和素与生物素的亲和作用实现C末端肽的特异性富集。该方法对末端氨基酸不同的C末端都具有普适性; 利用该方法从腾冲嗜热厌氧菌提取蛋白质中鉴定到了183条C末端肽。
Chait等[40]基于Lys-C (lysyl endopeptidase) 的酶切特性发展了一种脱水胰酶辅助去除非C末端肽的富集方法。脱水胰酶是一种不具备催化活性的胰蛋白酶, 但仍保留结合肽段羧基端赖氨酸或精氨酸的能力。采用Lys-C酶解蛋白质时, 除C末端肽, 其余肽段的羧基端均为赖氨酸。借助脱水胰酶对肽段羧基端赖氨酸的亲和能力, 其余肽段可被固载脱水胰酶的磁珠捕获, 通过磁珠的分离从而实现C末端肽的富集。虽然该方法快速简便, 但是脱水胰酶价格高昂、难以获取, 因此难以得到广泛应用。Tsunasawa等[41]同样基于Lys-C的酶切特性发展了一种C末端肽反向富集方法。该方法的原理为:蛋白质经Lys-C酶切后, C末端肽带有α -氨基, 非C末端肽同时带有α -氨基和赖氨酸侧链ε -氨基; 采用(N-琥珀酰亚胺基氧代羰基甲基) 三(2, 4, 6-三甲氧苯基) 溴化膦(TMPP) 选择性封闭α -氨基后, C末端肽不再含有自由氨基, 非C末端肽剩余一个自由氨基; 借助苯异硫氰酸酯树脂上的反应基团与氨基的化学反应, 使非C末端肽键合于树脂上, 通过树脂的分离去除非C末端肽(见图 1f)。由于该方法基于氨基的高反应活性, 因此具备高效的非C末端肽去除效率。然而, 残留的TMPP试剂难以去除, 而且TMPP试剂本身具有很强的质谱响应, 将大大抑制肽段的质谱信号。随后, 该研究小组[42]基于以上流程, 采用转胺作用代替TMPP对α -氨基进行封闭。但是转氨作用对不同的氨基酸有歧视效应, 而且存在难以避免的副反应。本研究组[43]则采用选择性的二甲基化反应对α -氨基进行封闭, 进而对非C末端肽的自由氨基进行磷酸根标记, 通过二氧化钛与磷酸根的相互作用实现非C末端肽的高效去除。采用该方法, 我们从大肠杆菌提取蛋白质中鉴定到了474条C末端肽。由于胰酶酶切产生的C末端肽不带碱性氨基酸, 而非C末端肽在末尾带有碱性氨基酸赖氨酸和精氨酸。因此, 相对于非C末端肽, C末端肽在强阳离子交换(SCX) 柱上的保留较弱。此外, 乙酰化N末端肽的α -氨基的正电性被乙酰基团封闭, 因此, 相比于其他肽段, 乙酰化N末端肽在SCX柱上同样具有较弱的保留能力。基于此, 可采用SCX对胰酶酶切产生的C末端肽和乙酰化N末端肽进行预富集。Gevaert等[44, 45]基于所发展的对角线色谱法, 结合SCX预富集, 进一步实现了C末端肽和N末端肽的分离。该方法首先将蛋白质N末端氨基和侧链氨基乙酰化。经胰酶酶解后, 使用SCX将含有较少正电荷的N末端肽和C末端肽与其他中间肽段初步分离。随后, 使用反相色谱对预富集组分进行分离并收集级分。对肽段上的氨基进行疏水基团修饰后, 将每个级分分别进行第二次反相色谱分离。N末端肽由于不含氨基故在第二次反相色谱上的保留时间不变。C末端肽由于修饰上疏水基团, 在第二次反相色谱上的保留发生偏移, 从而与N末端肽分离开。虽然基于蛋白酶酶切特性的C末端肽富集方法可以实现C末端肽的有效富集, 然而该方法仅适用于一种酶切方式, 导致很多过短和过长的末端肽难以被质谱鉴定。
Overall等[46]发展了一种基于羧基反应的C末端肽富集方法, 称为C-TAILS。C-TAILS的具体过程为:首先采用二甲基化封闭蛋白质上的氨基, 随后采用乙醇胺通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS) 缩合反应封闭所有羧基; 蛋白质经酶切后, 非C末端肽重新带上一个自由羧基, 而C末端肽不含自由羧基; 将肽段的氨基再次进行二甲基化封闭后, 采用含有丰富氨基的高分子聚合物与羧基进行缩合反应, 使非C末端肽键合在高分子聚合物链上; 最后采用超滤膜对高分子聚合物进行去除, 实现非C末端肽的去除(见图 1g)。研究者采用该方法从大肠杆菌提取蛋白质中鉴定到了240条C末端肽。由于羧基的反应活性较低, 因此C-TAILS策略中非C末端肽的去除效率有待进一步提高。Zhang等[47]进一步对C-TAILS进行了优化。传统的C-TAILS采用二甲基化对蛋白质的氨基进行标记, 从而封闭了胰酶对赖氨酸的酶切。因此, C末端肽可能带有多个赖氨酸, 赖氨酸的正电性使肽段的带电数增多, 不利于基于碰撞诱导解离(CID) 机理的质谱分析。Zhang等[47]采用乙酰化代替二甲基化对赖氨酸的正电性进行封闭, 以改善C末端肽段的质谱鉴定效率。此外, 部分C末端肽可能不含有碱性氨基酸, 因此仅带一个正电荷, 通过不排除+1价离子的质谱扫描方式可使C末端肽的鉴定数目进一步提高。另外, 该工作还对C-TAILS的流程进行了优化, 例如提高反应试剂浓度, 纯化高分子聚合物, 采用含30%(v/v) 乙腈的溶剂回收疏水肽段等。通过以上系统的优化, 使C-TAILS的C末端肽鉴定数目提高了75%, 从大肠杆菌提取蛋白质中鉴定到了422条C末端肽。此外, Tholey等[48]也对C-TAILS进行了改进, 通过采用N, N′-二甲基乙二胺代替乙醇胺对羧基进行封闭, 使C末端肽的带电数提高, 并结合电子转移解离(ETD) 模式对多电荷肽段进行分析, 但是ETD的鉴定效果仍难以媲美传统的CID。此外, 该工作还结合了多酶酶切, 以获得性质互补的C末端肽, 从而使C末端的鉴定覆盖度进一步提高。通过以上改进, 作者[48]从大肠杆菌提取蛋白质中鉴定到了424条C末端肽。
蛋白质水解不仅是代谢循环和能量生成的必要过程, 而且是一种重要的翻译后修饰, 参与调节DNA复制、细胞增殖, 以及炎症、关节炎、心血管疾病发生发展等众多生理学和病理学过程[15, 49, 50]。与其他翻译后修饰一样, 相比于转录和翻译, 蛋白质的水解能够更快速地对蛋白质的活性和功能进行调节。因此, 蛋白质水解是响应性生物过程的重要枢纽之一, 包括凝血和炎症响应等[51]。生物体内的蛋白质水解由蛋白酶调控, 因此蛋白酶作用机制的研究, 包括活性位点的结构和功能, 以及底物网络的相互作用等, 能够为蛋白质水解相关生理病理过程的阐释提供重要信息。
传统的蛋白酶作用位点和底物的测定方法主要有噬菌体展示技术、肽微阵列和肽库、凝胶电泳技术。噬菌体展示技术[52]可对蛋白酶的最佳作用序列进行鉴定, 然而无法提供准确的剪切位点信息, 需要进一步采用肽微阵列或肽库[53, 54]对蛋白酶的特异剪切位点进行测定。该方法的不足之处在于仅测定蛋白酶对底物一级结构的依赖, 无法综合考虑底物的二级结构对蛋白酶活性的影响。针对此问题, 基于蛋白质水解后分子量的变化发展了一系列基于二维凝胶电泳的蛋白酶底物鉴定方法, 例如双向差异荧光凝胶电泳[55]和对角线电泳[56]。然而, 对角线电泳无法测定生理状态下蛋白酶的底物特异性。此外, 二维凝胶电泳存在重复性、通量和灵敏度不足的问题。针对此问题, Cravatt等[57]结合蛋白质组学技术建立了一种基于一维十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 的蛋白酶底物分析平台, 称为PROTOMAP (protein topography and migration analysis platform)。该方法采用SDS-PAGE对蛋白酶作用样品和对照样品在相邻泳道进行分离后, 将胶条切割成多个条带, 胶内蛋白质进行胶上酶解, 酶解产物采用LC-MS/MS进行分析, 并通过蛋白质所对应的谱图数对蛋白质进行定量。相对于对照样品, 当蛋白酶作用样品中蛋白质的量下调, 且在低分子量的条带中被鉴定, 即认为该蛋白质发生了水解。基于凝胶电泳的方法虽然可以对蛋白酶的作用底物进行鉴定, 但是难以获取蛋白酶的作用位点信息。PROTOMAP虽然可以通过蛋白质水解片段的序列鉴定作用位点, 但是蛋白质片段序列的鉴定覆盖度有限, 且存在大量背景肽段的干扰, 难以获取蛋白酶作用位点的全面信息。
由于蛋白质的水解会使蛋白质片段暴露出一个新的末端, 通过此末端的信息便可以对蛋白酶的作用底物和位点进行定位。因此, 近年来蛋白质末端组学的研究逐渐成为蛋白质组学的一个重要分支, 并为蛋白酶底物和位点的鉴定提供重要技术支撑。例如, 针对传统合成肽库方法存在步骤繁琐、耗时耗力、通量低等不足, Overall等[58]采用蛋白质末端组技术, 发展了快速简便的蛋白酶剪切位点鉴定方法。该方法采用蛋白质组的酶解产物作用肽库, 将肽库的氨基进行封闭后, 采用蛋白酶处理肽库, 发生剪切的肽产生一个新的N端, 通过此N端的生物素标记捕获相应底物。通过底物序列的质谱分析, 便可获取蛋白酶作用的特异性序列以及位点信息。该方法在肽库中鉴定到了558个Glu-C蛋白酶(endoproteinase Glu-C) 的剪切位点, 超过98%的剪切位点与已知Glu-C剪切位点一致。将该方法进一步应用于金属蛋白酶2位点的分析, 鉴定到了超过1 200个剪切位点。此外, 该方法还被应用于HIV (human immunodeficiency virus)-1蛋白酶、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase 7、组织蛋白酶K、组织蛋白酶G、弹性蛋白酶以及凝血酶剪切位点的测定。Keller等[59]采用TAILS N末端肽富集策略对基质金属蛋白酶10的底物进行鉴定, 并结合iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation) 八重标定量技术对不同时间点的N末端肽进行定量, 测定了金属蛋白酶10的动力学曲线。Overall等[60]同样采用TAILS N末端肽富集策略结合iTRAQ八重标定量技术比较了不同组织蛋白酶家族敲除样品间N末端肽的差异, 鉴定到了139个组织蛋白酶家族的底物, 其中56%~83%的底物发生了完全的降解, 并发现了该家族各成员的作用底物有较大的差异。Gevaert等[44]采用COFRADIC N末端富集策略结合SILAC (stable isotope labeling with amino acids in cell culture) 同位素标记比较了颗粒酶B作用样品和对照样品N末端肽的差异, 鉴定到了颗粒酶B的622个作用位点和498个底物。此外, 该方法还对C末端肽进行了富集, 从而鉴定到了羧肽酶A4的16个作用位点。Wells等[24]采用基于酶促标记的N末端肽富集策略比较了化疗药物诱导的细胞和正常细胞中N末端的差异, 鉴定到了caspase蛋白酶的333个作用位点以及292个底物。此外, Wells等[61]进一步对不同药物诱导以及不同细胞类型的凋亡过程中caspase的底物进行了研究, 鉴定到了超过500个底物蛋白质, 并发现caspase的底物蛋白质种类对细胞和药物种类有一定的依赖性。
蛋白质末端组的研究为我们提供了更全面的蛋白质一级结构信息, 并帮助我们了解蛋白质末端在各项生命活动中发挥的重要生物学功能。此外, 末端组学的不断发展也加速了蛋白质降解组学等领域的研究进程。蛋白质末端肽富集方法的开发为蛋白质末端组的研究奠定了基础。然而, 不同于磷酸化和糖基化等翻译后修饰[62, 63], 蛋白质的末端不具备特异性的富集靶标, 需要人为地于末端/非末端引入富集/去除靶标, 从而使蛋白质末端肽的富集流程较为繁琐, 因此提高末端肽的富集通量, 以满足临床样品的高通量检测是末端肽富集的发展方向之一。另外, 由于仅具有合适长度的末端肽才可被质谱鉴定, 因此结合多种酶切方式以获得性质互补的末端肽, 并提高除胰酶外其他酶切方式的质谱鉴定效率, 对于提高末端肽鉴定的覆盖度至关重要。羧基反应活性较低一直是制约C末端组发展的一大瓶颈, 因此发展具有高效、无副反应、条件温和等优点的羧基标记方法将为C末端肽富集新方法的发展提供新的机遇。此外, C末端肽通常由于缺乏碱性氨基酸而难以鉴定, Overall等[64]发现的胰蛋白酶镜像酶(LysargiNase) 酶解可以使C末端肽于氨基端带上碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸, 以及Lu等[39, 65]利用恶唑酮法可以使C末端标记上精氨酸, 以上方法与C末端肽富集策略的结合将进一步促进C末端组的全面分析。简言之, 蛋白质末端组学新技术新方法的不断发展对于蛋白质结构和功能, 以及蛋白质水解相关生物过程的全面诠释具有重要意义。
2017,
Vol. 35 Issue (3): 229-236
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