样品前处理是通过提取、除杂、浓缩等步骤,将目标物与复杂样品基质分离开来,以提高检测灵敏度的一种样品处理方法。作为整个样品检测中最耗时的一个环节,样品前处理关系着整个分析方法的优劣,直接影响分析结果的准确度和精密度。固相萃取(solid-phase extraction,SPE)由于其形式多样、操作简单、对环境友好、易实现自动化、有机溶剂用量少、回收率和富集倍数高等优点,目前已被公认为使用大型仪器分析检测前对样品进行预处理的首选方法。固相萃取利用固体吸附剂来吸附液体样品中的目标物,使其与样品基质分离,然后再对吸附剂进行洗脱或加热解吸附,避免了很多传统萃取中两相不相容的缺点,实现了分离与富集目标物的目的。但是,大部分SPE吸附剂对目标物呈非特异性吸附,这无疑增加了萃取和洗脱的复杂程度,从而极大地限制了其在样品前处理领域的广泛适用。为解决该问题,近年来科研工作者提出具有选择性萃取能力的免疫吸附剂^[1],但该吸附剂合成周期长、成本高、稳定性差且不适用于有机溶剂体系。分子印迹聚合物(molecular imprinted polymers,MIPs)具有构效预定性、特异识别性及适用广泛性的优点,且制备简单、成本低廉、稳定性好,因此已经成为现代SPE的研发热点。本文介绍了近年来分子印迹固相萃取技术在样品前处理中的应用进展,包括分子印迹固相萃取(molecular imprinted solid phase extraction,MISPE)小柱、分子印迹整体柱(molecular imprinted monolithic column,MIPMC)、磁性分子印迹(magnetic molecularly imprinted polymers,MMIPs)、分子印迹膜(molecular imprinted membrane,MIM)和分子印迹中空纤维(molecular imprinted hollow fiber,MIHF)等技术。

SPE小柱是从层析柱发展而来的一种用于萃取、分离、浓缩的样品前处理装置。将MIPs作为SPE小柱填料形成MISPE小柱,不仅可以有效提高SPE小柱对目标物的选择性吸附及富集能力,还有利于对非目标物的去除。因此,MISPE小柱成为近年来样品前处理领域的一个研究热点。

我们课题组^{[2, 3]}以丙烯酰胺为功能单体,以二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂,制备了分别以原儿茶酸和奇壬醇为模板分子的两种MIPs,并将它们作为吸附剂分别填充于SPE小柱中,形成MISPE萃取小柱。经高效液相色谱检测,该MISPE小柱可分别从中药千年健和豨莶草提取物中有效萃取出目标化合物原儿茶酸和奇壬醇,从而为中药有效成分的选择性萃取提供了一种有效的新途径。

Takuya等^[4]将由替代模板法制得的舒必利MISPE小柱应用于液相色谱-质谱法检测河水中的舒必利,结果表明该MISPE小柱对目标物表现出高选择性和高回收率。Yin等^[5]分别以3种倍半萜内酯化合物为模板分子,通过沉淀聚合制备得到相应的3种MIPs,将它们作为SPE小柱填料,用于模板分子在中药木香中的选择性萃取。另外,该研究还论证了模板分子的构型是MIPs对其进行选择性识别的关键因素,为后续MIPs模板分子的选择提供了理论指导。

整体柱(monolith)又称为棒状柱,是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相,其内部具有便于液体流动的微米级穿透孔,又具备方便溶质传质的纳米级中孔,解决了填充色谱柱空间占用率低、传质速率慢、柱负压高、色谱拖尾严重等问题,具有渗透率高、易改性和传质速率快的优点,所以被誉为第四代色谱固定相。基于分子印迹的选择性识别特性,将其与整体柱结合,构成新型的分子印迹整体柱固相萃取技术,并将其应用于复杂样品的前处理中,是分子印迹固相萃取发展的重要方向。

Adali-Kaya等^[6]通过光引发在室温条件下实现了原子转移自由基聚合(atom transfer radical polymerization,ATRP),得到可分别对睾酮和(S)-普萘洛尔进行选择性萃取的MIPMC。该研究将面式-三(2-苯基吡啶)合铱配合物[fac-Ir(ppy)₃,ppy=2-phenylpyridine]作为新型ATRP引发剂用于室温条件下的光引发聚合,不但克服了MIPs制备过程中常用的甲基丙烯酸等酸性单体不适宜ATRP反应的缺点,拓宽了用于制备MIPs的ATRP反应中功能单体和模板分子的选择范畴,同时还避免了传统ATRP反应中高温条件对于模板分子和功能单体预聚物稳定性的影响。

Lin等^[7]制备了一种分子印迹毛细管整体柱,用于糖蛋白辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)的选择性萃取。他们首先将毛细管内壁乙烯基化,然后注入含有功能单体乙烯基苯硼酸、引发剂偶氮二异丁腈的双致孔剂(环己醇和乙二醇)混合溶液,于75 ℃反应12 h。再将模板分子HRP溶液通过微量注射泵以0.005 mL/min的速度往毛细管内连续注入2 h后,继续以同样速度将含有多巴胺(dopamine,DA)和过硫酸铵的混合溶液连续注入15 min。然后将该管于4 ℃存放12 h后洗脱模板分子,即得HRP印迹的MIPMC。将该整体柱用于人血清样品中HRP的选择性吸附与富集,对洗脱样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果表明该MIPMC对糖蛋白具有优秀的选择性吸附能力,可作为一种样品前处理方法用于糖蛋白组学分析。

MMIPs兼具MIPs的高选择性和磁性材料可借助外界磁场实现快速分离的双重优点,使针对目标物的萃取和分离变得简单易行,因而被广泛应用于样品前处理领域。

在MMIPs中,Fe₃O₄纳米粒子因其毒性低、制备简单而成为最常用的磁性载体。我们课题组^[8]采用化学共沉淀法,制备得到超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子,并用两性修饰剂聚乙二醇对其进行表面改性后,采用悬浮聚合的方法制备得到以土大黄苷为模板分子的MMIPs。在以4种中成药为实际样品的高效液相色谱检测中,该MMIPs对土大黄苷表现出良好的选择性吸附能力,且可在外界磁场存在的条件下从样品溶液中快速分离,避免了传统印迹方法的离心、过滤等步骤,为具有复杂基质的中药样品提供了一种可行便捷的前处理方法。

通过正硅酸乙酯在碱性条件下的水解,在Fe₃O₄纳米粒子表面包覆一层SiO₂,既提高了磁性载体的亲水性,又为其表面功能化提供了更多可能。我们课题组^{[9, 10, 11]}采用Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子作为磁性载体,通过3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的水解,将磁性载体表面双键化后成功制备了3种MMIPs,并将其作为磁性固相萃取吸附剂,建立了葡萄酒中白藜芦醇、中药保健品中西地那非、中药金盏花中槲皮万寿菊的高效液相色谱分析新方法。

近年来,将新型聚合方法与传统MMIPs相结合的相关研究不断涌现,为提高聚合反应的可控性,有效控制印迹产物的粒径分布做出了突出的贡献。Zou等^[12]通过ATRP反应在室温条件下获得了粒径分布在450~650 nm、亲水性良好的MMIPs,建立了复杂样品中广谱抑菌剂磺胺甲嘧啶的高效液相色谱分析新方法。Gai等^[13]将2-溴异丁酰溴作为ATRP引发剂接枝在磁性载体Fe₃O₄@NH₂表面,然后以牛血清白蛋白为模板分子,以N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和甲胺基丙级甲基丙烯酰胺为功能单体,以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,于室温条件下完成聚合,洗脱掉模板分子后即得牛血清白蛋白印迹的MMIPs。与传统方法制得的MMIPs相比,该MMIPs在混合蛋白质样品和实际血清样品中皆对模板分子表现出更为优越的选择性吸附性能,为蛋白质组学中低丰度蛋白质的萃取提供了新思路。

MIM始于20世纪90年代,它集膜分离的条件温和、操作简单、易于连续化和分子印迹的高选择性等优点于一体,被广泛应用于样品分析领域,为针对目标物的大通量、专一性识别萃取提供了有力支撑。

Jia等^[14]在玻碳电极表面制得一层MIM用于胆固醇的电化学检测。该课题组首先以金纳米粒子和碳纳米管修饰玻碳电极表面,以增加其表面粗糙度进而增加印迹位点的数目,然后以胆固醇为模板分子,通过循环伏安法在电极表面电聚合制备得到胆固醇印迹的MIM。此方法操作简单,可控性高,胆固醇的LOD和LOQ分别低至3.3×10^-14和1×10^-9 mol/L。Kor等^[15]通过间苯二胺的自聚反应,在金电极表面构筑了以呋塞米为模板分子的MIM,在药剂和人尿液的电化学检测中对呋塞米表现出优异的选择性吸附能力。

受到贝类高吸附性能的启发,Wu等^[16]成功制备得到新型多组分纳米金属有机-分子印迹复合膜(multi-component metal-organic nanocomposite imprinted membrane,MMO-MIM)。首先通过DA在聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜表面自聚形成pDA@PVDF膜,再借助氟钛酸铵的水解在pDA@PVDF膜表面引入纳米级的TiO₂膜。随后,以间甲酚为模板分子,在pDA@PVDF膜表面通过溶胶-凝胶过程得到间甲酚印迹凝胶。洗脱掉模板分子后,得到对间甲酚具有选择性吸附能力的新型MMO-MIM。该方法的所有过程都在室温条件下进行,所用试剂温和环保,且得到的MMO-MIM呈多层结构,具有良好的抗污能力。经高效液相色谱检测表明,该方法制得的MMO-MIM对间甲酚表现出优秀的选择性识别能力。

中空纤维固相萃取因其可集采样、萃取、浓缩为一体,有机溶剂用量少、环境友好、成本低廉并易与仪器联用等优点,目前已被广泛应用于复杂样品的前处理中。虽然中空纤维具有以上诸多优点,但其不具备对目标物的选择性分离性能,因此将分子印迹技术与中空纤维萃取相结合,提高中空纤维的选择性识别能力,必将成为未来样品前处理领域的一个重要方法。

Moein等^[17]利用溶胶-凝胶法制备得到MIHF用于人尿液及血浆中的马尿酸的液相色谱-二级质谱联用检测,该方法的LOD和LOQ分别低至0.3和1.0 nmol/L。Ye等^[18]在石墨烯表面原位制得DA印迹聚合物后,通过超声将其固定在中空纤维的孔壁中,得到氧化石墨烯增强分子印迹中空纤维(GO-MIP/HF),并结合高效液相色谱-二极管阵列检测器,证明该GO-MIP/HF对人血清和注射用盐酸中的DA具有高选择性识别能力。

随着科技的不断进步,分析化学面临的样品成分日渐复杂,样品的前处理在整个样品分析中的角色也越来越重要。分子印迹固相萃取因其选择性高、稳定性好、适用性广、存在形式灵活多样等优点,在样品前处理中发挥着重要作用。分子印迹固相萃取技术今后的研究应主要集中于以下几个方面。

(1)拓展应用领域。目前分子印迹固相萃取主要针对刚性小分子,对于体积大、构象多样、功能基团复杂的生物大分子的萃取研究进展比较缓慢。然而,以肿瘤标志物等为代表的低丰度生物大分子与生命过程息息相关,以其为目标物的分析过程所面临的样品基质更为复杂,因此分子印迹固相萃取不断革新,发展适用性更好的新型功能单体和聚合方法用于生物大分子分析的样品前处理,这是今后分子印迹固相萃取技术发展的重要目标。

(2)扩展对模板分子的检测手段。传统分子印迹固相萃取中主要依靠紫外分光光度计、高效液相色谱和质谱等方法对已洗脱掉的模板分子进行检测。但模板分子的洗脱通常需要在严苛环境下进行,该过程难免对一些模板分子造成构象变化等损伤。因此,如何利用现代仪器分析技术,在避免洗脱的情况下对模板分子进行检测,是未来分子印迹固相萃取发展的一个重要方向。

(3)探索更加先进的分子印迹固相萃取方法。近年来材料学发展迅猛,多种先进、简单的可控聚合方式应运而生,将其应用于分子印迹固相萃取材料的制备,其必将对分子印迹固相萃取材料的制备和应用做出突出贡献。另外,发展多功能、多响应的新型分子印迹固相萃取材料也对样品前处理技术的发展有着重要意义。