离子色谱(ion chromatography, IC) 是高效液相色谱的一种形式, 是分析阴阳离子和小分子极性有机化合物的一种液相色谱方法。离子色谱提供的分离选择性是对广泛使用的液相色谱的有益补充。不同于液相色谱的独特选择性是离子色谱快速发展的推动力。近年来离子色谱技术取得了一些重要进展, 如Reagent-Free系统的面世, 简易阀切换部件的使用, 弱电离有机酸的高灵敏检测, 快速分析色谱柱的研制以及与电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)、氢化物发生-原子荧光光谱仪(HG-AFS) 的联用。同时, 我国在离子色谱仪的硬件研发和生产、仪器的国家标准修订、标准方法和药典制定等方面也取得了可喜的进步。本文介绍了近年来离子色谱技术的重要进展, 概述了我国离子色谱行业近年的研发水平和应用进展。
IC中阴离子分析通常采用碳酸盐(Na2CO3/NaHCO3) 或氢氧根(NaOH或KOH) 淋洗液。碳酸盐淋洗液性质稳定, 易储存, 配制方便, 是早期离子色谱分析的常规淋洗液。但因其不适合用于梯度淋洗, 近年来使用逐渐减少。氢氧根淋洗液的抑制反应产物是水, 背景电导很低(小于2 μS), 且氢氧根的浓度对背景电导影响很小, 很适合作梯度淋洗液。此外, 采用氢氧根梯度淋洗时产生的水负峰非常小, 故可采用大体积进样, 有利于改善分离度和提高检测灵敏度。但氢氧根淋洗液或其固体试剂都极易吸收空气中的CO2, 产生洗脱能力较强的CO32-, 这会导致淋洗液的组成和浓度发生改变, 从而造成基线不稳, 保留时间重现性变差, 甚至会将强保留组分洗脱下来产生鬼峰。可以在线产生OH-的淋洗液发生器(eluent generator, EG) 很好地解决了上述问题, 这是离子色谱技术发展的一项重要突破[1, 2]。该装置可在封闭系统中产生OH-, 避免了因吸收CO2引入的CO32-污染。OH-的浓度通过改变淋洗液发生器的电解电流来调节[3, 4], 与施加电流成正比(可高达100 mmol/L), 与泵输送纯水的流速成反比。EG最大的优势是只需纯水就能在线产生无污染的、浓度准确的氢氧根淋洗液, 且不需使用其他试剂, 分析方法更环保; 同时可消除人工配制溶液以及杂质等因素导致的误差, 提高实验的重现性。EG的另外一个优点是只用一台等浓度泵就可以实现通常使用四元比例阀或2~3个独立的高压泵才可完成的梯度淋洗过程, 大大降低了仪器系统的复杂性和实验成本。
与电导检测器配合使用的抑制器是通过降低淋洗液背景电导以及提高待测离子的电导响应来提高检测灵敏度的。目前, 可连续工作自动再生的电解膜抑制器已经实现商品化并得到广泛使用。其工作原理是通过电解水产生抑制器所需要的H+, 因此纯水是抑制器工作需要的唯一试剂。综上所述, 采用配有EG装置、电解膜抑制器和一台等浓度泵的离子色谱仪, 使用与OH-交换能力强的色谱柱, 纯水作为淋洗液, 等度或梯度淋洗就可以完成复杂样品中的多组分分析。这项技术是离子色谱技术的一个新的里程碑。
样品中某些常见离子含量较高时, 可能超过分离柱的容量或干扰相邻组分的分离。通过独特的简易阀切换装置可使大量的基体离子或高浓度的相邻峰离子在第一次经过分离柱后排入废液, 而目标离子则进入电导检测器之后的浓缩柱。在常用的离子色谱系统中增加一个10通阀和1款浓缩柱(或分离柱的保护柱)。通过阀的切换, 离子色谱的抑制器可将淋洗液(KOH或NaOH) 转变成无洗脱能力的水, 而淋洗液中的目标离子则可保留在连接于电导检测器之后的浓缩柱上。然后, 再次通过阀切换将浓缩柱作为进样环(离子色谱中的Loop), 此后既可以利用第一次使用的分离柱作第二次分析, 也可以选择另一款分离柱, 进行二维分析[5-7]。离子色谱系统只需一个泵、一支分离柱、一支浓缩柱(或分离柱的保护柱) 与一种淋洗液(KOH或NaOH), 在常用的离子色谱系统中增加一个10通阀和1款浓缩柱(或分离柱的保护柱), 即可实现在线基体消除和痕量成分的浓缩富集。这项技术在复杂基体的痕量组分分析中非常有效。浙江大学朱岩教授课题组利用上述技术实现了六氟磷酸钾中杂阴离子的检测、碘离子与碘酸根离子同时检测等多种复杂基体中痕量离子的检测[8-10]。
有机弱酸是药物、食品、环境分析与临床分析中的常见目标物。抑制器的应用使离子色谱成为强酸和强碱分析的主导技术, 但弱电离化合物的分析却是离子色谱面临的难题和挑战。因氢氧根淋洗液在抑制器后呈微酸性(pH 5.2~5.5), 故pKa＞5的弱电离化合物解离不完全, 导致电导检测的灵敏度很低。而弱酸在不同浓度时解离度不同, 使解离呈现非线性, 因此现有技术对弱电离化合物的分析面临困难。虽然使用质谱、蒸发光散射等高灵敏度的通用型检测器可以提高检测灵敏度, 但联用接口的复杂性与昂贵的费用导致其实际应用并不广泛。近年来, 离子色谱的很多研究工作都集中在增加弱电离化合物的电导响应方面, 而双电导检测器和可导入挥发性碱的部件以及电荷检测器的成功开发, 为有机弱酸分析提供了有效手段, 是离子色谱分析的又一重要突破。
2012年Haddad等[11]综述了离子色谱分析弱电离化合物的方法, 其中比较多的报道是采用双电导检测器。即利用第一个抑制型电导检测器实现强酸离子的检测, 然后再设法增加弱酸的离子化程度, 利用第二个电导检测器实现弱酸的间接检测。如:加入碱溶液通过化学反应促进弱酸的离子化, 或连接一个“离子交换反应器”将弱电离化合物置换成强电离化合物。由于这种方法对仪器的要求过高，操作比较复杂, 难以实现商品化, 实际应用受到限制。
2016年Dasgupta等[12, 13]提出了一种更有效的新方法。在KOH淋洗液抑制型电导检测器后, 加上可导入挥发性碱(低pKb (3.0) 与高蒸气压的二乙胺) 的部件(permeative amine introduction device, PAID)。该部件结构简单, 由有套的窄孔Teflon AF膜管组成, 二乙胺在管外部流过, 洗脱液在内管流过。渗透入Teflon AF膜管的二乙胺与管内的洗脱液反应, 将抑制后的洗脱液从酸型转变成相应的铵盐(NR2H+HX→NR2H2++X-)。在PAID之后的第二个电导检测器可检测到第一个抑制型电导检测器不能检测的弱酸HX (pKa≥7.0)。在低电导(5~31 μ S/cm) 的氢氧化二乙胺(DEAOH) 背景下检测X-, 因OH-的电导大于X-, 所检测的X-为负峰。该方法对弱酸的检测灵敏度可低达nmol/L, 且装置简单, 易于商品化。
电荷检测器也是近年来研制出的对弱电解质有相对高响应值的新型离子色谱检测器[14, 15], 是对电导检测器的有效补充。电荷检测器是一种破坏性检测器, 需串联于电导检测器之后, 该检测本质上是对去离子过程中发生的电荷转移进行测量。与电导检测器相比, 电荷检测器对弱电解质有相对高的响应值。因为电导检测器仅对弱电解质的离解部分有响应, 而电荷检测器的去离子化功能可以促使弱电解质进一步电离。弱电解质的离子化程度取决于施加的电场和在检测器中的停留时间。而淋洗液流速(与在检测器中的停留时间呈反比) 对弱酸的影响要远大于对强酸的影响。即使在正常流速下, 电荷检测器对弱电解质的响应信号也强于抑制型电导检测器。
固定相是决定IC选择性的关键因素。新型离子交换固定相的研发一直是离子色谱技术中最具挑战性的目标和热点。为了改善色谱柱的选择性、提高柱效, 市售的分离柱已达数十种。如美国Dionex公司(2010年与Thermo Scientific合并) 已经商品化的阴离子交换柱近40种, 阳离子交换柱近20种, 但这些分离柱通常采用较大颗粒的固定相(7~9 μ m), 很少使用小颗粒(＜2 μ m) 固定相。这是因为IC的流路系统需采用全塑材质聚醚醚酮(poly ether-ether-ketone, PEEK) 才能兼容酸性和碱性淋洗液, 同时IC的EG与抑制器的耐压范围有限, 整个系统不能承受高压。因此, IC使用过程中压力和流速一直限定在比较低的范围内[16], 这也大大限制了小颗粒固定相的使用。
但近年来小粒径固定相的发展很快, 大大提高了分离速度。固定相粒径为3.5~4 μ m、柱长150 mm的分析柱已经商品化。Tosoh公司最近推出TSKgel Super IC-Anion HS色谱柱, 被称为“超高速阴离子分离柱”, 采用了3.5 μ m粒径的固定相，对7种常见阴离子的分离时间小于4 min。Shodex公司最近推出的IC SI-35 4D色谱柱, 固定相为3.5 μ m颗粒的聚乙烯醇, 可在14 min内快速分析常见离子和消毒副产物卤氧酸。目前, Thermo Fisher Scientific公司已有5种商品化填装4 μ m固定相的常用色谱柱[17]。为了配合小颗粒固定相色谱柱, Thermo Scientific Dionex公司2016年推出了Integrion HPIC高压离子色谱系统, 可承受压力升高至41.37 MPa (6 000 psi)。重新设计的淋洗液在线发生器可承受的压力也由20.68 MPa (3 000 psi) 提高到了34.47 MPa (5 000 psi)。
在不增加柱压的前提下, 也可以通过提高淋洗液流速来增加分离速度, 利用整体柱就可以实现高流速淋洗[18]。整体柱的基质材料可采用聚合物(可以在很宽的pH范围内使用), 也可使用硅胶。随着近十年的发展, 用于离子色谱分析的聚合物整体柱已经商品化, 目前已有Thermo Fisher Scientific公司生产出IonSwiftTM色谱柱系列。
离子色谱的常规柱一般为20~25 cm, 若缩短柱长也可以提高分离速度。如柱长为25 cm、固定相粒径为6.5 μ m的常规阴离子分离柱(IonPac AS22) 分析7种常见阴离子需要12 min (流速1.2 mL/min, 柱压＜13.78 MPa (2 000 psi))。若将柱长缩短为15 cm, 7种常见无机阴离子的基线分离仅需4.5 min (流速2.0 mL/min)。Severi等[19]在全球气候变暖研究的阴离子分析中, 用50 mm×4 mm的分离柱快速测定南极冰芯样品中的Cl-、NO3-和SO42-。采用2.5 mmol/L Na2CO3 -0.5 mmol/L NaHCO3淋洗液, 流速2.3 mL/min时, 完成分离只需1 min。对只需检测SO42-的冰芯样品, 将淋洗液浓度调整为4.5 mmol/L Na2CO3 -0.5 mmol/L NaHCO3时, 仅用30 s即可完成分析。
小内径色谱柱是IC研发的另一个热点。微孔型(内径1~2 mm) 和毛细管柱(内径＜0.4 mm) 较常规分离柱具有更高的柱效, 且溶剂的使用量很少。用粒径4 μ m的固定相、长度150 mm的毛细管柱, 流速为25 μ L/min时, 系统压力仅为23.99 MPa (3 480 psi), 分离7种常见阴离子只需2 min。2015年起, 2 mm内径色谱柱的商品化步伐加快。如Metrohm公司已经有4款2 mm内径的色谱柱, 而Thermo Fisher Scientific公司已经将20多款色谱柱扩展到毛细管型(内径0.4 mm)。
与多种样品前处理技术联用可以提升IC检测的灵敏度, 拓展IC的使用范围。例如:利用C18固相萃取柱可以去除饲料中的复杂基质, 实现对甜菜碱的检测[20]。利用高温热水解分解黏土样品, 实现其中的氟、氯、溴和碘含量的同时测定[21]。上述前处理方法可以使IC检测的灵敏度得到大幅度的提高。使用氧弹燃烧炉可实现塑料中卤素含量的分析, 该方法成功地将IC技术引入高分子材料分析领域[22]。
与ICP-MS或ESI-MS联用时, 提供了远高于电导或UV/Vis检测器的灵敏度。在离子色谱柱与ICP-MS的雾化器间, 利用离子色谱的抑制器实现在线除盐, 减少盐在锥口的堆集, 消除淋洗液中的盐对质谱离子喷雾源的影响和对质谱部件的损害。在淋洗液或洗脱液中添加有机溶剂, 增加洗脱液的挥发性来提高检测灵敏度。与ICP-MS联用可用于识别爆炸残留物的特征爆炸物[23], 可用于氯氧化合物与氯离子、金属离子的不同形态(如Fe3+与Fe2+)、多种含氮化合物(硝酸、亚硝酸、硫氰酸盐与氰酸盐等) 的组成分析。最近有多篇离子色谱与质谱联用的报道, 如饮用水消毒副产物卤氧化物的分析、司法检验与环境评价中对爆炸残留物的分析、弱电离化合物的分析等[24, 25]。
与HG-AFS联用, 可有效解决化合物的价态与形态分离问题, 克服电导检测器对这些化合物检测灵敏度低的缺点。近年来, IC-HG-AFS联用已广泛用于砷、硒、汞与铬的价态与形态分析[26-29]。我国的IC-HG-AFS联用仪器比较成熟, 如离子色谱与北京海光仪器有限公司生产的原子荧光光谱仪联用已有很好的应用。
与HPLC相比, IC对离子和极性分子、无吸光基团的有机化合物的分析更有优势, 近年来, IC在生物医药分析中有所拓展。如IC用于体液中的无机和有机离子、糖类、蛋白质、氨基酸等分析, 方法简单高效[30, 31]。Thienpint等[32]报道了其研究工作, 撰写了“离子色谱作为血清中阴阳离子分析的标准方法”的综述[33]。糖类化合物也是现代生命科学研究的热点之一, 而糖类化合物分析也是难点问题。鉴于糖类化合物分子具有电化学活性及在强碱溶液中呈离子化状态, IC分析糖类化合物时, 可以用氢氧化钠为淋洗液, 阴离子交换分离, 脉冲安培检测。对单糖、中性寡糖和唾液酸化的寡糖的分析具有高选择性和灵敏度, 无需柱前和柱后衍生, 可直接测定低至pmol/L浓度的糖, 是很重要的糖类分析方法[34]。
氨基糖苷类抗生素(如庆大霉素、奈替米星、林可霉素和大观霉素等) 由多元环己醇和氨基糖两部分缩合而成, 极性较大, 水溶性好, 用IC分析有较大的优势。这些抗生素含有电化学活性的-OH和-NH2基团, 可采用脉冲安培电化学检测。因脉冲安培检测的金工作电极需在碱性条件下工作, 因此需采用柱后加碱的模式来实现。广谱性抗生素妥布霉素的分子中含有脂肪氨基和羟基, 在碱性条件下解离成阴离子, 也可利用阴离子交换分离。因所使用的碱性淋洗液与脉冲安培电化学检测条件相匹配, 故不需柱后加碱。该方法检出限为7.11 μ g/L[35]。目前《美国药典》(USP) 已经规定了10余个离子色谱阴离子交换分离结合脉冲安培检测(pulsed amperometric detector, PAD) 的方法。而《欧洲药典》(EP) 对该类抗生素的测定多选择C18柱或离子对色谱柱, 也通过分离柱后加碱和脉冲安培检测[36]。
药物中的杂质鉴定是制药工业必不可少的分析工作。IC与HPLC具有不同的分离选择性, 是HPLC法的重要补充, 可明显增加药物中痕量杂质的检出概率[37, 38]。此外, IC在药物赋形剂、双膦酸盐类药物、抗生素和中药分析的应用也很多。如:在HPLC的C18或C8分离柱上难保留、自身无紫外吸收和挥发性低的极性双膦酸盐类药物(帕米膦酸钠、阿仑膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠), 采用阴离子交换分离和电导检测法分析就很有效。《中国药典》(2010版) 第二部收载的帕米磷酸的检测方法与《中国药典》(2015版) 收载的阿仑膦酸检测方法均为阴离子交换分离和电导检测法。这些分子中含有氨基基团, 碱性条件下可直接在金电极上氧化, 可采用积分脉冲安培法检测, 检出限为0.061~0.18 μ g/mL[39]。
分析和阐明中药的复杂化学成分是中药现代研究的关键问题之一。中药的化学成分不仅含有多种有效成分, 而且在加工过程中还可能引入某些有毒物质, 导致其残留, 如二氧化硫残留等。这些物质极性很强, 没有很好的通用分析方法。而IC在中药材及其制剂的元素分析、二氧化硫残留检测、有机酸和糖类化合物含量测定等方面得到了较好的应用。如中草药在加工过程中通常会采用硫黄熏蒸的方法干燥一些根茎类药材, 残留的二氧化硫会造成药材有效成分的损失及人体的不适症状。《中国药典》(2015版) 通则2331中规定的二氧化硫残留测定法中第三法是离子色谱法。
自20世纪80年代IC技术进入中国以来, 至今有30余年的发展历史。我国的IC行业经历了艰难起步阶段(1983年~1988年)、开拓创业阶段(1988年~2000年) 和蓬勃发展阶段(2001年至今)。近年来, 我国已经实现了离子色谱仪的自主研发生产, 取得了多项研究成果。在离子色谱应用中开发了一大批具有实用性的分析方法。从仪器的自主研制到方法的开发应用以及进入《中国药典》, 都标志着我国IC行业的发展和进步。
硬件技术是IC行业发展的基础。经过多年的研发, 我国IC仪器整机设计研制有了突破性的发展, 其整机性能有较大的提高。目前, 青岛盛瀚色谱技术有限公司、青岛普仁仪器有限公司、北京历元电子仪器有限公司等10余家公司可以生产销售国产离子色谱仪, 它们代表了国内离子色谱仪的水平。其中, 关键器部件也有了代表性的研究成果。如:华东理工大学杨丙成教授课题组自主研发的在线淋洗液发生器和平板膜抑制器已经实现了小规模生产。浙江大学朱岩教授课题组围绕阀切换装置做了大量的研究工作, 其自主研发研制的阀切换装置已经完成样机的设计。苏州大学李晓旭副教授课题组一直从事IC与MS质谱联用接口的制作, 期待有所突破。
另一关键部件国产离子色谱柱的研制也受到重视, 用于常见阴离子分离的色谱柱的性能有较大提高。但目前国产的阴离子分离色谱柱只能使用碳酸盐淋洗液, 使用氢氧根淋洗液的色谱柱还没有完全实现商品化。针对有机胺、有机酸、氨基酸和糖类分离的色谱柱目前还处在自主研发的起步阶段。而市售的阴离子分离柱的柱效和选择性与国外进口色谱柱相比还有差距, 柱性能仍需进一步提高。此外, 值得注意的是我国的在线离子色谱监测技术还相对滞后, 但它们对大气环境的快速离子检测十分重要。
总之, 目前我国IC的整机和关键器部件技术虽已取得长足进步, 但相比国际水平还有相当大的差距, 我国IC行业的研发和产业化水平都有待进一步提升。
近几年, 我国计量部门修订了“离子色谱仪检定规程”“国家标准”和“型式评价大纲”。《JJG 823-2014离子色谱仪检定规程》代替了《JJG 823-1993离子色谱仪检定规程》。2013年7月由山东省计量科学研究院牵头修订的“离子色谱仪国家标准”已经进入了待颁布阶段。由中国计量科学研究院牵头起草的“离子色谱仪型式评价大纲”也正在制定中, 有望很快得到颁布。IC仪器计量标准的更新是我国IC行业的一次重大变革, 这将极大地促进我国IC产业的后续发展, 推动我国IC行业缩小与国际水平的差距。
我国在IC的应用方面做了大量技术积累, 很多企业标准、地方标准、行业标准、国家标准中都有涉及。据不完全统计, 在我国2010年至2016年正式公布的国家与行业标准分析方法中, 涉及离子色谱法的多达50余种, 并有相当数量的方法被《中国药典》(2015年) 收录。另外, 还有一些IC法虽然没有被《中国药典》收录, 但是可以作为《中国药典》中规定检测方法的替代方法。例如:采用滴定法测定有效成分乙酰甲基氯化胆碱(methacholine chloride)。按照方法所示, 实验过程中需要使用剧毒试剂乙酸汞, 但这在实际工作中是非常不方便的。使用IC法不需要使用剧毒试剂, 可以直接检测目标物, 而且实验的灵敏度和准确度都优于滴定法。
离子色谱技术的优势在于对阴阳离子、极性分子以及无吸光基团的有机化合物的分析, 在很多应用领域已成为不可替代的方法。目前我国的进口离子色谱仪量大, 使用面广。进口仪器的软硬件水平很高, 应用发展很快。而我国虽在离子色谱的应用研究方面有长达30余年的积累, 但离子色谱仪主要依赖进口。近年来, 随着我国分析仪器行业的发展和国家对自主创新仪器的重视, 国产离子色谱仪的研发也取得显著进步, 并得到较广泛的应用。目前国产离子色谱仪与进口仪器相比还有较大差距, 未来仍需要离子色谱行业的科研人员和企事业研究人员共同努力。
谨以此文纪念牟世芬老师从事离子色谱工作35周年。如有遗漏或不妥, 敬请同仁指正。
2017,
Vol. 35 Issue (3): 223-228
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