截止至2016年12月31日, 以“capillary electrophoresis”或“capillary isoelectric focusing”或“micellar electrokinetic chromatography”或“CE-MS”为标题, 排除“capillary electrochromatography”、排除“microchip ”、排除“capillary monolithic column”主题进行检索, 期刊论文共458篇。特别值得一提的是加拿大Ottawa大学的Jeffrey Keillor和Maxim Berezovski于2016年在Nature Chemical Biology发表了论文Simultaneous analysis of enzyme structure and activity bykinetic capillary electrophoresis-MS (doi: 10.1038/nchembio.2170)。该工作建立了毛细管电泳-紫外检测-离子淌度-质谱 (CE-UV-IM-MS) 一体化检测方法。利用动力学毛细管电泳和紫外检测可分离分析人谷氨酰胺转胺酶TG2的两种构象异构体, 并可监测两种构象的分布和转换。并将毛细管电泳紫外检测与离子淌度质谱联用, 同时实时检测了小分子配体对两种构象分布和酶活性的影响。该工作首次实现了一次实验同时完成蛋白质的构象和活性分析。本年度分析化学学科最有影响力的杂志Analytical Chemistry发表 22篇CE论文, 与前两年基本持平; Electrophoresis发表 99篇CE论文, 远高于去年的65篇。其他重要分析化学期刊发表CE论文数分别为Journal of Chromatography A 40篇、Journal of Separation Science 6篇、Talanta 21篇、Analytical Chimica Acta 21篇、Analyst 6篇, 各杂志论文数有波动, 但文章总数基本持平。本文针对新的和重要的CE技术应用领域, 分别从药物及天然产物、医学及临床检验、食品及农产品、生物分子、手性分析、环境监测、组学研究、CE-MS联用技术、其他化合物和离子检测等方面进行分类介绍。
CE分析检测药物或天然产物主要包括合成药物、蛋白药物及植物有效成分。
合成药物的分析检测包括不同剂型中有效药物成分检测:应用胶束电动毛细管色谱法 (MEKC) 检测肽类药物戈舍瑞林, 可在30 min内将其与修饰的戈舍瑞林分离; 应用毛细管区带电泳法 (CZE) 和MEKC对抗菌药物制剂中的抗菌物质进行鉴定, 结果显示洛美沙星、达氟沙星等药物应用CZE分析效果较好, 而呋喃唑酮、呋喃西林等药物则应用MEKC分析效果较好; 应用CZE测定6种抗帕金森药物成分, 在背景缓冲液中加入环糊精可以同时检测6种药物; CZE一次运行中多次进样实现了药物中利多卡因的高通量分析, 与单次进样相比精密度接近, 可有效加快药物质量检测的速度; 应用CZE法同时定量检测药物中的二甲双胍和维格列汀, 可在5 min内完成两组分检测, 且与HPLC检测法相比没有明显统计学差异; 应用CZE检测抗高血压药物阿替洛尔和比索洛尔, 研究了不同pH、离子强度、电压和温度对检测结果的影响; 应用MEKC检测4种抗偏头痛药物盐酸曲他维林、咖啡因、扑热息痛和安乃近, 利用动态pH连接法即样品缓冲液为pH 2.15、电泳缓冲液pH 9.3时, 11 min内即可对4种药物进行有效分离; MEKC检测氢氯噻嗪、伊贝沙坦、比索洛尔和氯噻嗪, 可在8 min内同时检测出市售药物中的4种组分, 并研究了十二烷基硫酸钠 (SDS) 浓度、分离缓冲液浓度、温度和电压对4种组分分离效果的影响。合成药物的分析检测还包括实际样本中的合成药物检测:单滴微萃取在线毛细管电泳联用可测定尿样中的非甾体类抗炎药物, 实际样品检测限范围为1.0~2.5 mg/L, 回收率为82%~115%;采用CZE与大体积进样和极性切换方法, 结合加速溶剂萃取测定水产品中喹诺酮类和磺胺类药物, 能有效监测水产品中的抗生素残留; 应用MEKC测定人尿液中的β-受体阻滞剂, 日间精密度与日内精密度均低于20%, 重现性良好; 应用CZE对脑脊液中儿茶酚胺荧光衍生物进行在线富集和高灵敏检测, 检出限达到20 pmol/L。CE还可用于研究药物相互作用:利用毛细管在线反应可针对人类免疫缺陷病毒1型 (HIV1) 病毒的gp41核心结构筛选融合抑制剂, 从100多种中药提取物中筛选出了能够明显抑制病毒感染性的病毒抑制剂; 应用亲和毛细管电泳 (ACE) 研究了β-环糊精-药物复合物中药物的释放传递, 结果表明β-环糊精与细胞膜的亲和力大于与药物分子的亲和力, 有利于药物释放进入靶细胞; 利用CZE检测各类药物剂型中抗凝血酶成分的二聚体构象, 该方法可有效分离自然态、休眠态及二聚体形态的抗凝血酶成分。建立CE新方法可同时检测多种合成药物:应用CZE偶联非接触式电导检测器可快速检测苯海拉明、吡哆醇和8-氯茶碱, 每小时可进样20次; CZE结合LED (发光二极管) 诱导荧光检测可测定阿霉素和柔红霉素的含量, 可在15 min内检测出两种物质, 且精密度高, RSD小于2%。
蛋白药物的有效质控方法对蛋白药物的安全性评价至关重要。利用CE分析蛋白药物包括:CZE可在25 min内分析胰岛素药剂中的4种主要鱼精蛋白肽; CZE检测单克隆抗体含量的RSD＜5%, 可用于单克隆抗体的质量检测; 毛细管等电聚焦 (CIEF) 可表征单克隆抗体特定区域的电荷异质性, 用SpeB将单克隆抗体IgG水解成LC、Fd、Fc/2 3个结构片段, 应用CIEF检测各个片段的等电点, 该方法可表征单克隆抗体各结构域的电位。
CE用于天然产物的成分分析包括:CZE定量检测栓藤提取物中酚类抗氧物; MEKC-UV检测中药材总芹菜素的含量; 应用CZE筛选及评估天然产物中具有抗氧化功能的生物碱, 可有效评估复杂样本的抗氧化功能; 应用CZE法可从多糖和天然提取物中筛选神经氨酸酶抑制剂等。
毛细管电泳在医学及临床检验中的应用包括患者的病理检测、疾病诊断、疾病机理分析及体内代谢物分析等。分析对象是体液或组织中的药物、疾病相关标志物和离子等。
病理检测包括:使用冷却装置将患者呼出的气体凝结成液体样本, 应用CZE检测样本中美沙酮含量, 可以有效监测美沙酮在体内的代谢情况, 调整用药量; 收集清洗皮肤的双蒸水分别用CZE和电位滴定法检测皮肤中的抗氧化物抗坏血酸、尿酸和谷胱甘肽, 检测范围为1~300 μmol/L, 该文应用CE进行皮肤中抗氧化物质的测定, 与传统电位滴定法相比更加快捷灵敏; CZE同时检测唾液中的硫氰酸根离子、亚硝酸根离子和硝酸根离子, 检出限为3.1~4.9 μg/L, 3种离子为体内新陈代谢的终端产物, 快速检测此3种离子有助于分析体内代谢情况; 应用毛细管电泳连接激光诱导荧光检测器 (CE-LIF) 介导的荧光放大信号法可检测血浆总胆固醇, 检出限达到纳摩尔级; CZE结合固相萃取测定人尿液中的毒品可卡因、可待因、美沙酮和美施康定, 实际样品的检出限范围为20~50 μg/L, 该方法有可能用于其他生物样本的检测, 进而分析药物代谢情况; 应用CZE检测螺内酯口服片剂、口服胶囊和复方冲剂的药物含量, 还能同时检测尿液中的螺内酯及其代谢物坎利酮从而确定该药物的生物利用度。
疾病诊断包括:利用在线免疫亲和磁珠固相萃取结合CE-MS可检测血清甲状腺素, 对甲亢或甲状腺萎缩等疾病做出诊断; 应用聚合酶链式反应 (PCR) 结合毛细管凝胶电泳 (CGE) 检测口腔细菌牙龈卟林单胞菌、齿垢密螺旋体和福赛斯坦纳菌, 日间精密度为0.6~2.3%, 可应用于临床检测口腔细菌; CZE连接非接触式电导检测器检测接受重量训练计划的摔跤运动员唾液中的5种阳离子 (Ca2+、Na+、Cl-、K+和Mg2+) 和2种阴离子 (NO3-和SCN-), 该方法可同时检测唾液中的阴阳离子, 根据训练过程中各阴阳离子浓度变化证明与体内激素氢化可的松分泌有相关性; 分析人乳头瘤病毒的完整病毒样颗粒, 10 min内即可完成检测, 且迁移时间的RSD＜2%。
疾病机理分析包括:设计的微流控芯片中包括固相萃取、PCR和CGE 3个模块, 血液样品经过固相萃取和PCR形成不同碱基数的Y染色体基因片段, 再经CGE检测各DNA片段的含量从而得出样本中是否含有Y染色体的结论, 该方法仅需1 μL全血即可在60 min内完成检测; 在对中国孕妇进行血红蛋白基因突变筛查中, 应用CZE定量检测血液中异常血红蛋白的含量来进行诊断; 应用便携式CE仪利用CZE连接非接触电导检测小体积生物液体如血液中的阴阳离子, 仅需10 μL可同时检测Ca2+、Cl-、NO3-、NO2-、SO42-和SCN-, 该方法可用作疾病诊断或研究体内新陈代谢情况; 聚乙烯醇微泡是一种新型的血管造影剂, 应用CZE可分析人血浆中的聚乙烯醇微泡, 结果发现聚乙烯微泡与血浆主要蛋白质如血清白蛋白均无结合, 故可直接对全血中的聚乙烯醇微泡进行定量检测, 并可以回收利用, 研究表明聚乙烯微泡是良好的血管造影剂。
体内代谢物分析包括:应用CZE检测血清中的代谢物, 在电泳缓冲液中加入质量分数为5%的γ-环糊精, 可同时检测4种外消旋氨基链烷醇基衍生物的立体异构体, 检出限为141.2~141.7 μg/L; CZE连接非接触电导检测人脑脊液中的硝酸盐, 电泳过程中通过正负电极变换使样品富集, 提高了检测灵敏度, 信噪比比未富集时增强了60倍; MEKC-MS检测大麻素及其代谢产物, 首次将全氟酸作为表面活性剂, 电泳缓冲液成分为150 mol/L氢氧化铵、75 mol/L全氟酸和体积分数为10%的丙二醇, 可在30 min内检测出15种大麻素衍生物及代谢物; CZE连接非接触电导检测吸烟者和非吸烟者唾液中的硫氰酸盐水平, 发现吸烟者唾液中硫氰酸盐水平显著升高, 该方法日内精密度和日间精密度分别为0.7%~1.7%和2.4%~6.4%, 回收率为72%~141%;应用MEKC检测头孢吡肟在患者血清中的含量, 通过分析1 000个患者血液样品, 发现血清药物含量在1.0~131.7 mg/L间, 该数据可为临床用药监测提供参考; 去铁胺和去铁酮是治疗地中海贫血病患者因输血引起的铁过载的主要药物, 应用MEKC可在10 min内检测血清中的去铁胺和去铁酮, 该方法可用于检测药物代谢情况并辅助指导临床用药剂量。
近几年食品安全问题越来越受到重视, CE用于食品安全和农产品检测的方法逐年增多。食品安全检测中主要包括食品添加剂、食品中某些组分或有害成分的检测。农产品检测包括农药残留物和农产品有效成分检测。
食品添加剂检测包括:无表面活性剂的微乳液增强中空纤维液相微萃取结合MEKC检测在饮料和尿液中的邻苯二甲酸酯类; MEKC快速测定膳食补充剂四吲哚化合物; MEKC同时测定11种食品添加剂, 40 min内即可同时检测出咖啡因、阿力甜、阿斯巴甜、纽甜、脱氢乙酸、山梨酸、田菊糖、奎宁、苯甲酸、糖精、安赛蜜等常用食品添加剂, 检出限范围为0.25~2.5 mg/L, 回收率范围为81.6%~115%; CZE检测功能性食品中的西布曲明和酚酞。
食品特定组分检测包括:磁珠固相萃取葡萄酒中的锌、铜、锰、镉与1, 10-临菲咯啉形成的络合物, 应用CZE可在17.5 min内同时检测出4种络合物; CZE同时检测蜂蜜和牛奶中的甘露醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖, 应用石墨烯-钴微球混合糊电极可在9 min内检测出这5种碳水化合物; 应用PCR结合CGE检测犬类罐头食品中肉类的品种, 可在15 min内检测出是否含有与商品包装标注相符合的肉类品种如牛肉、猪肉、羊肉和鸡肉; MEKC可在12 min内检测能量和运动饮料中水溶性维生素包括维生素C、B1、B2、B3、B5、B6、B12等。
有害成分检测包括:应用CZE同时检测鱼类产品中硝酸盐和亚硝酸盐; 场放大进样CZE测定饮料和湖水中的α-萘酚和β-萘酚; 无胶筛分毛细管电泳鉴别高危海产品中的血清型霍乱弧菌; 使用聚多巴胺作为毛细管涂层, 应用CZE测定牛奶中的三聚氰胺等。
农残检测包括:应用蒙脱石磁性分子印迹聚合物选择性萃取结合CZE检测牛乳样品中残留的氟喹诺酮类药物; 超声波辅助分散液体微萃取-扫描MEKC和色谱法检测药用植物中有机磷农药检测; 应用MEKC可在5 min内检测出蜂蜜中三嗪类除草剂, 扑草净、莠灭净、特丁净、莠去津和西马津这5种除草剂的检出限可达到7.85、7.85、5.37、5.21和8.50 μg/L; 基于广谱适配体的CZE检测有机磷农药成分, 应用荧光标签CdTe/DcS核壳量子点 (QD) 与适配体 (aptamer) 碱基互补序列寡核苷酸 (AMO) 发生酰胺化反应, 形成复合物QD-AMO, QD-AMO与aptamer孵育通过碱基互补形成复合物DQ-AMO-aptamer, 加入待测农药后有机磷成分与aptamer特异性结合, DQ-AMO-aptamer减少而DQ-AMO增加, 应用CZE检测DQ-AMO-aptamer和DQ-AMO的含量从而得出有机磷含量, 该方法检测甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧化乐果的检出限分别为0.2、0.1、0.17和0.23 μmol/L。
农产品有效成分分析包括:电泳缓冲液中加入质量分数为2%的羟丙基甲基纤维素, CZE可直接检测果蔬中Ca2+、K+、Na+和Mg2+; 应用CZE检测葡糖胺化合物, 在背景溶液中加入Cu2+, 它与葡萄糖胺化合物形成稳定复合物解决了葡萄糖胺自身紫外吸收低的问题, 因此, 在236 nm的检测波长下, 可在20 min内同时检测N-(1-脱氧左旋糖-1-烃基)-缬氨酸、N-(1-脱氧左旋糖-1-烃基)-亮氨酸、N-(1-脱氧左旋糖-1-烃基)-甲硫氨酸、N-(1-脱氧左旋糖-1-烃基)-谷氨酸和N-(1-脱氧左旋糖-1-烃基)-丙氨酸5种葡萄糖胺化合物; MEKC检测了92种来自中国和日本不同产地绿茶中的儿茶素类化合物的含量, 包括儿茶素、表没食子儿茶素和表儿茶素没食子酸酯, 结果显示日本绿茶中各类儿茶素含量近似, 而中国各产地的儿茶素含量显著不同, 且日本绿茶中的儿茶素含量整体低于中国绿茶。
CE检测生物大分子如蛋白质、核酸、糖类等具有优势, 同时也广泛用于生物小分子或代谢中间产物的检测。
蛋白质的检测包括:纽约血红蛋白是一种变异血红蛋白[β113(G15) al→Glu, GTG→GAG], 可在地中海贫血病人的血液中检测到, 应用CZE可在6 min内检测到全血样品中的变异血红蛋白, 该方法比HPLC更灵敏; 糖蛋白的唾液酸化程度决定了重组糖蛋白的溶解性、生物活性和血浆半衰期等性质和重要指标, 应用CIEF检测细胞培养过程中唾液酸蛋白的含量, 可以有效监测重组蛋白的产量和安全性; α-突触核蛋白与帕金森症密切相关, 将α-突触核蛋白经异硫氰酸荧光素或Chromeo P503荧光标签修饰后, 应用CGE连接激光检测器可快速检测该蛋白质, 建立表征和定量检测该蛋白质的方法有助于帕金森病的相关研究; 95%的临床多发性硬化症患者脑脊液中均能检测出IgG, 此项指标指示了神经中枢系统鞘内炎症, 应用CIEF分别检测患者和正常人的脑脊液和血液, 发现患者的脑脊液在等电点7.7~10区间的信号强度显著高于血液的信号强度, 而正常人的血液和脑脊液在此等电点区间内的信号强度没有明显差异, 该方法可用于快速诊断多发性硬化症; CZE-UV可检测商品白蛋白和IgG的纯度, 还可同时检测人血液中的白蛋白和IgG的含量, 与欧洲药典中凝胶电泳法相比, 该方法操作更方便, 且效率更高, 检测效果更好; 应用微透析连接CZE可测定脂肪细胞3T3-L1对支链氨基酸的摄取和释放, 异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸和下游代谢物丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸是脂肪细胞脂肪生成的重要指标, 将细胞破碎后应用微透析获取氨基酸, 再应用CZE在线反应连接荧光标签, 可在30 s内检测出全部氨基酸, 实验结果对深入了解脂肪代谢有重要意义; 应用on-line CE可进行胰蛋白酶水解赖氨酸聚合多肽的柱上反应, 并可同时检测反应后的产物, 还可分析多个参数如进样体积、反应物浓度和反应时间等对胰蛋白酶水解效果的影响; 应用on-line CE进行羧肽酶水解肽段的柱上反应, 并对水解产生的各类氨基酸同时进行分离检测, 该方法可用于检测多肽的氨基酸成分; 应用CZE检测小分子对蛋白质间相互作用的影响, 抗凋亡蛋白Bcl-XL与配体BH3形成蛋白质-配体复合物, 当抑制剂ABT-263存在时, 配体BH3峰面积升高, 同时蛋白质-配体复合物峰面积降低, 表明蛋白质-配体复合物的形成受阻, 该方法可研究影响蛋白质-蛋白质相互作用的抑制剂。
核酸的检测包括:应用CZE检测酿酒酵母中三磷酸腺苷 (ATP) 和其代谢产物二磷酸腺苷 (ADP)、一磷酸腺苷 (AMP) 和环磷酸腺苷 (cAMP), 可于40 min内检测出4种腺嘌呤核苷酸的含量, 从而分析酿酒酵母菌的新陈代谢情况; 应用CZE检测核酸染料Hoechst33258、SYBR Green Ⅰ和SYBR Green Ⅱ对PCR反应的抑制作用, 结果发现Hoechst33258完全抑制PCR反应, SYBR Green Ⅰ和SYBR Green Ⅱ在低浓度下对PCR反应有促进作用; 应用聚乙烯醇涂层熔融石英毛细管, 采用CGE模式可对siRNA进行分离, 该方法不仅能分离不同碱基数的siRNA, 还能分离相同碱基数的有不同二级结构或不同修饰的siRNA; 将羟乙基纤维素聚合物作为背景添加剂, 应用CGE模式可分离不同非编码区碱基数为100~10 000 nt的长链RNA; miRNA是一类单链微小非编码区RNA, 在肿瘤患者的血清和组织液中均可检测到特定miRNA, 仅需900 μL血液即可应用CZE-MS检测肿瘤患者血清中的5条标志性miRNA, 该方法无需富集或PCR步骤, 可用于检测肿瘤标志物; 应用CZE表征随机单链DNA (ssDNA) 库与肿瘤细胞的相互作用, 通过ssDNA和ssDNA-细胞复合物峰面积变化判断核酸与细胞的亲和力, 可用于辅助全细胞适配体筛选; 三硝基苯腺苷和肌苷是中枢神经系统的生物活性物质, 二者均能在pH 9.5的缓冲液中与三硝基苯磺酸形成复合物, 因三硝基苯磺酸可用LIF直接检测, 故应用CE-LIF可直接检测三硝基苯腺苷和肌酐含量, 该方法可用来检测血液或脑脊液样本中的三硝基腺苷和肌酐; CGE可快速鉴定念珠菌, 临床常见念珠菌为29种, 对137名患者感染血液进行前处理后再做PCR扩增, 检测结果显示鉴定出26种念珠菌; 利用动力学毛细管电泳法 (KCE) 分析了影响适配体亲和力测定的溶液条件, 将血小板衍生因子蛋白与适配体孵育后进样, 在电泳过程中加2 068.42 Pa气压推动, 所测定的PDGF蛋白与适配体的解离常数与之前报道类似, 但若使用pH 7.4 Tris-HCl作为电泳缓冲液, 所测定的解离常数则高出一个数量级, 结果证明测定蛋白质与适配体亲和力时, 电泳缓冲液需选择相同的筛选溶液, 电泳缓冲液与筛选缓冲液相同则亲和力接近, 与筛选缓冲液不同则亲和力下降; 应用CZE分别筛选糖蛋白RNase B和碱性磷酸酶的适配体, 使用磁珠-链亲和素结合蛋白与核酸库孵育后应用CZE进行分离, 4轮筛选可筛出适配体; 利用PCR结合CZE法, 可检测鹿茸特征基因序列, 以达到鉴定的目的, 建立了随机扩增多态性DNA的毛细管电泳图谱。
糖类和小分子的检测包括:应用CZE可在10 min内检测小鼠大脑组织和血液中的生物胺类化合物多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素, 检出限为0.42~0.57 μg/L; 来自美国、欧洲和亚洲的20家研究机构应用CGE-LIF检测N-多聚糖标准品, 结果表明该方法重现性很好; CZE可定量检测C3-、C6-磷酸酯淀粉; CZE可快速同步分离透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和肝素; CZE可检测人全血提取物中的色氨酸、谷胱甘肽和尿酸; 应用CZE检测亚硒酸钠诱导凋亡SMOL/LC-7721细胞裂解液中的谷胱甘肽。
CE可用于手性拆分, 如氨基酸或小分子、药物分子的对映体分离以及手性拆分剂的比较和评价。
氨基酸及小分子手性分析包括:使用两种新型手性拆分剂乳糖酸和D-木糖-硼酸可拆分十四氨基醇的对映体; CZE对葡萄酒中的酒石酸和苹果酸进行手性拆分, 电泳缓冲液中加入手性拆分剂100 mol/L D-奎尼酸、10 mol/L二价铜离子和0.5 mol/L三价铝离子, 可在8 min内同时分离两对对映体; 应用MEKC可完全分离10种手性氨基酸。
药物分子对映体手性分析包括:β-受体阻滞剂是治疗心血管系统疾病的药物, β-受体激动剂是治疗哮喘病的药物, 两类药物均为临床常见药物, 其手性对映体对药物安全性产生很大影响, 应用非水毛细管电泳 (NACE) 可在25 min内拆分6种β-受体阻滞剂和8种β-受体激动剂的手性对映体, 有助于检测临床药物的安全性; 使用硫酸-环糊精作为手性拆分剂可拆分27种西酞普兰类似物的对映体, 其中26种对映体可在20 min内完全分离; 应用CZE可拆分头发中氯胺酮和去甲氯胺酮的手性对映体, 方法对于体内毒物检测有重要意义。
手性拆分剂评价包括:应用CZE评价了几种β-环糊精衍生物的手性拆分能力, 在手性拆分剂螺环离子液体中分别加入几种β-环糊精衍生物, 结果显示均能提高拆分能力; 应用CZE比较3种离子液TMA-L-Hyp、TMA-l-Arg和TMA-l-Ile与β-环糊精混合后的手性拆分能力, 结果发现三者均比单独使用β-环糊精时的拆分效果好; CZE检测金鸡纳生物碱类对映体, 使用羟基-β-环糊精作为手性拆分剂, 30 min内可同时检测到奎宁、奎丁、辛可宁和辛可尼定4对手性对映体, 该方法可用于检测金鸡纳树皮和奎宁注射液中的4种手性对映体。
毛细管电泳法可以对未经前处理的污染水体直接进样, 从而快速检测水体中的抗生素、激素或药物以及重金属离子。CZE法可在10 min内同时检测5种水样中四环素类抗生素四环素、美他霉素、金霉素、土霉素和多西霉素, 检出限为67~167 ng/L; MEKC可检测废水净化厂水体中甾体类化合物含量, 20 min内同时检测出雄激素、雌激素和孕激素, 检出限为0.05~1.06 mg/L; 双通道CZE可同时检测水样中的药物, 每个通道中采用不同的电泳缓冲液, 通道1(36 mol/L Tris-乳酸缓冲液, pH 8.0, 添加0.5 mol/L羟丙基-β-环糊精) 可同时检测布洛芬、双氯芬酸钠、苯扎贝特、酮洛芬和甲芬那酸, 通道2(25 mol/L组氨酸, 25 mol/L 3-(N-吗啉) 丙磺酸, pH 6.5, 添加1 mol/L羟丙基-β-环糊精) 可同时检测苯海拉明、美托洛尔和阿替洛尔, 双通道的检测结果与HPLC标准方法比无明显差异; 基于罗丹明的荧光探针常用来检测汞离子, 但自然界水体中的K+、Ag+、Ca2+、Mg2+等金属离子容易对汞离子的检测产生干扰, 使用纳米二氧化硅共价连接罗丹明作为毛细管涂层, 应用CZE-LIF可在15 min内对自然水体中的Hg2+、K+、Ag+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Ni2+、Cd2+、Pb2+和Zn2+离子进行分离, 并且对汞离子的检测灵敏度远高于其他离子, 该方法可有效检测自然水体中的汞离子; CZE可在6 min内同时检测出水中化合物一氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸和醋酸; CZE连接非接触式电导检测器可检测水中的溴酸根离子, 检测限为0.12 μg/L。
CE-MS是近年来CE技术中发展最快的前沿技术。其相关研究主要在联用仪器的接口改进和在实际样品检测的应用。
联用仪器接口的改进包括:应用3D打印研磨工具制备纳米喷雾点用于CE-MS连接处; 无护套的金属鲁棒性和高灵敏度的样品定量涂布发射器接口; 自对准负压混合液的电喷雾接口等。
实际样品检测包括:应用CE-UV-IM-MS模式检测谷氨酰胺转氨酶TG2的结构和酶活性, 在线孵育TG2、底物和小分子抑制剂AV5, 随着AV5浓度增加, 产物TG2-O增加而产物TG2-C减少, 通过抑制剂浓度的梯度增加即可计算出酶活性; 应用CE-ESI-MS检测细胞中甲基化嘧啶, 最低可检测到20个细胞中125 pg核酸提取物中的甲基化嘧啶的含量; 应用CE-MS检测单克隆抗体IgG的完整性, 可在35 min内检测到聚糖酶、游离轻链和去糖基化IgG, 该方法可用于单克隆抗体的质量检测; 应用CE-ESI-MS检测并鉴定尿中的氨基酸; 应用CE-ESI-MS分析糖肽, 加入富氮气体可以提高检测灵敏度和重复性; 以逆电迁移扩散梯度电泳 (电解质迁移方向与pH分布相反) 建立毛细管电泳与质谱检测联用的新方法检测水中磺胺类药物磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺嘧啶, 检测限为0.75~0.84 μg/L; 应用CE-UV/CE-MS在可再生原料加工的下游监测发酵产生的乳酸有机杂质; MEKC-MS检测固相萃取后的海水中的抗生素青霉素G、苯唑西林、氨苄西林氯唑西林、磺胺喹恶啉、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲基嘧啶, 回收率为85%~110%, 检出限为0.002~0.011 μg/L。
化合物检测包括:应用CZE-LIF可检测细胞的内巯基化合物, 使荧光探针TMPAB-o-M与细胞裂解液中含巯基分子结合, 可在11 min内检测出细胞内的谷胱甘肽、γ-氨基丁酸、半胱氨酸和高半胱氨酸4种巯基化合物; MEKC可在10 min内检测焦糖色素中3种咪唑衍生物 (2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-四羟基丁基咪唑), 检出限达到33.4~60.4 μg/L; 应用CZE测定尼卡巴嗪中2-羟基-4, 6-二甲基吡啶的pKa; 以石墨烯量子点作为添加剂, 应用CZE模式可在18 min内检测7种肉桂酸类衍生物; 应用CZE结合非线性激光可检测孔雀石绿和结晶紫, 该方法无需荧光标签和抗体, 采用523和635 nm双波长同时检测, 孔雀石绿和结晶紫的检出限分别为8.3×10-11和6.9×10-10mol/L; MEKC检测疏水阳离子化合物依米丁、士的宁和奎宁, 样品缓冲液的浓度为电泳缓冲液中的9倍, 使用负电压进行场放大富集, 提高了检测灵敏度; CZE测定20种香豆素衍生物的酸解离常数pKa, 使用胺涂层毛细管, 检测了各化合物在缓冲液pH 4.16~9.10范围的迁移时间, 根据公式计算出20种香豆素类衍生物的pKa; 应用CZE检测比格犬血浆中的喹硫平, 4 min内即可完成喹硫平和内标米氮平检测, 分别在比格犬给药后0、10、20、30、45 min和1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h采血, 检测血液中喹硫平含量并绘制药物浓度-时间曲线, 该方法有用于药代动力学分析的潜力。
离子检测包括:CZE分离工业样品中两种重要的碱性介质聚阴离子铌和钽 (HxNb6O19x-8和HxTa6O19x-8), 应用10 mol/L氢氧化锂和35 mol/L醋酸锂作为电泳缓冲液, 两种离子可在2.5 min内分离; CZE连接非接触式电导检测器可同时检测矿石中和抗腐蚀涂层样品的14种稀土元素 (La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu), 电泳缓冲液中加入精氨酸和β-羟基异丁醇, 20 min内可检测出14种稀土元素, 检出限为0.24~4.7 mg/L; ACE模式可研究牛碳酸酐酶与各金属离子结合的动力学稳定性, 碳酸酐酶是一种金属酶, 酶中心位点与金属离子结合并且金属离子可以发生替换, 应用乙二胺四乙酸 (EDTA) 作为金属替换剂来检测碳酸酐酶与Co、Ni、Cu、Zn和Cd的亲和力, 发现Zn与碳酸酐酶亲和力最强。
2016年国际、国内举办的学术会议中与CE相关的主要会议有7个, 其中国际会议有5个, 国内会议有2个 (见表 1)。
其中CE与其他技术联用的报告居多。包括毛细管电泳与质谱联用如CE-ESI-MS、CE-ESI-TOF-MS、CE-C4D-ESI-MS、液相微萃取 (SDME) 与CE-MS在线偶联、超敏感CE-LIF/MS等。此外, 还有顶空-管内微萃取-CE (HS-ITME-CE)、HPLC与CZE联用、微透析与CE联用、微流控芯片-CZE联用等。
CE在生命科学领域的应用包括研究蛋白质、核酸、糖类、细菌及细胞代谢产物。(1) 蛋白质的研究包括:高通量测定蛋白质、分析蛋白质水解产物、蛋白质-蛋白质相互作用、测定治疗性蛋白质纯度、分析重组蛋白质纯度、研究蛋白质的聚集、基于尺寸的电泳分离法评估治疗性蛋白质、表征白藜芦醇和β乳球蛋白之间的相互作用、两种Fc融合蛋白的体内代谢研究、CE-MALDI-MS/MS-MS分析粉蝶科蝴蝶的繁殖蛋白、CE-MS增强对脱酰胺肽的分离和表征、CE-MS对蛋白质脱酰胺和异构化的分析以及对完整蛋白质的分析、分析完整单克隆抗体、对mAb (单克隆抗体) 及相关产品进行结构表征、通过使用CSE-CZE-MS的SDS-毛细管筛选电泳质谱表征分离抗体的杂质、使用CIEF分析同工酶电荷差异与等电点、单克隆抗体的CIEF跨平台可比性研究、应用iCIEF (imaging CIEF) 研究抗体-药物共轭体等。(2) 核酸的研究包括:如定量检测核苷酸和核苷、液相色谱和毛细管电泳微尺度分析结合分析治疗性寡核苷酸、CZE在高盐浓度下对序列依赖DNA进行分离、利用CE-LEDIF与CE-SELEX (指数富集配体系统进化技术) 筛选核酸适配体等。其中CE-SELEX方法中, 探究了CZE、ACE、CIEF等多重模式的CE应用等。(3) 糖类的研究包括:如对α1-酸性糖蛋白的糖型分析、对N-聚糖的分析、CE-ESI-MS分析生物药物的糖基和糖蛋白质组学、CE-MS在复杂聚糖分析中的研究、应用CE-MS和CE-CE-MS对聚糖和完整蛋白质分析等。(4) 细菌及细胞代谢产物的研究包括:分析小分子代谢物、无鞘液毛细管电泳-质谱法用于阴离子代谢物分析、无鞘液CE-MS研究代谢组组学、基于超弱光子发射生物化学变化的代谢组学研究、CE-MS系统用于单细胞分析等。
CE在医药方面的研究报告主要包括药物分析和临床检测。(1) 药物分析包括:分析主要药物成分、利用亲和毛细管电泳促进药物研发、表征药物递送系统不同阶段的纳米分子组装体、全面表征NISTmAb相关材料支持的生物制药分析技术的开发、使用放大方法优化CZE对生物药物的电荷异质性检测、微流体毛细管电泳-电喷雾装置分析生物制药材料、监测抗体-药物偶合物中的片段水平、使用多毛细管CE高通量分析抗原特异性以及疫苗诱导抗体的糖基化、生物治疗药物和疫苗的开发等。(2) 临床检测包括:如新型CE-nanoESI/MS界面快速分析血浆中的右丙氧芬、在线微透析毛细管电泳检测体内支链氨基酸等。
其他关于CE的报告包括:毛细管电泳和量子力学密度功能理论用于表征铵和碱金属离子的生物肽复合物、通过泰勒分散分析结合CE表征纳米分子实体的尺寸和电荷、双链DNA变性剂-疏水性阳离子四丁基铵 (TBA+) 与相关序列的一系列小发夹的相互作用、ACE测定钾-二苯并-18-冠醚-6络合物在水-有机溶剂中的稳定常数、测定唾液酸化糖缀合物的pKa、应用CE研究水溶液中形成复杂平衡的U (Ⅵ)-羟脯氨酸磷酸盐系统、应用CE作为分子间相互作用动力学研究的瞬时分析方法、实验设计 (DOE) 对iCIEF方法的开发的影响等。
毛细管电泳仪和毛细管电泳技术的发展相依而生, 互相促进。毛细管电泳技术的广泛应用是毛细管电泳仪研发和生产的原动力。自1937年Tiselius发明U型管电泳装置至今已有80年历史。1981年Jorgenson和Lukacs使用细内径毛细管为载体, 发明了高效快速的毛细管电泳装置。1988年贝克曼公司 (Beckman, 现为SCIEX公司) 生产的第一台商用毛细管电泳仪问世。随着生物技术的发展和毛细管电泳应用的专业化需要, 毛细管电泳仪的概念也得到拓展。目前, 既有简单的单通道毛细管电泳仪, 也有4通道、8通道、16通道、32通道甚至96通道等多通道阵列毛细管电泳仪, 甚至还有微流控芯片电泳仪。本文前述的毛细管电泳技术的应用主要使用单通道毛细管电泳仪。
目前, 国内外市场上普遍使用的单通道毛细管电泳仪主要是原Beckman公司和Agilent公司的产品。Lumex公司的毛细管电泳仪在俄罗斯及部分欧洲国家占据一定的市场份额。其他品牌的毛细管电泳仪多在个别实验室使用, 尚未形成规模化用户群。毛细管电泳相关仪器及部件的生产厂家见表 2。我国毛细管电泳仪的研制起步并不晚, 1994年由北京新技术研究所 (后为北京宾达英创科技有限公司) 研发了国内第一台毛细管电泳仪——1229型毛细管电泳仪。随后有其他厂家实现了毛细管电泳仪的研发和生产, 如北京华阳利民仪器有限公司 (原北京彩陆科学仪器有限公司) 研制的CL1010、CL1020、CL1030、CL1040型毛细管电泳仪, 上海通微分析技术有限公司自主研发生产的qSepTM-3010型全自动定量毛细管电泳仪, 北京凯奥科技发展有限公司生产的UC7010、FC7020、DC7030型毛细管电泳仪, 北京睿科仪器有限公司生产的CEi-SP20型毛细管电泳仪, 天津市兰力科化学电子高技术有限公司的LKCE-7200型全自动LED诱导荧光毛细管电泳仪, 中国科学院长春应用化学研究所与西安瑞迈分析仪器公司的毛细管电泳电化学微型综合分析仪。但是, 1994年至今20多年, 我国并没有高质量的仪器产品具备占有国内市场的优势。
毛细管电泳技术是现代微量分离分析技术, 其高分辨、快速、低成本和多模式在复杂的生物样品以及一些特殊分析中具有突出优势, 如:在单克隆抗体药物质控分析和欧洲药典中制定了一些CE方法。但是, 我国毛细管电泳仪主要依赖进口, 这在一定程度上限制了毛细管电泳技术在国内相关领域的应用。目前, 国产毛细管电泳仪与进口仪器相比还有很大差距。近年来随着我国分析仪器行业的发展和国家对自主创新仪器的重视, 毛细管电泳仪的研发也取得一些进步。可以预见, 随着生物医药行业和生物技术领域的快速发展, 生物分析中对毛细管电泳仪的需求将快速增加。毛细管电泳仪国产化的实现仍需要广大科研人员和企事业研发人员的共同努力。
以上内容难免有遗漏和不妥之处, 请广大学界同仁及应用从业人员批评指正。
2017,
Vol. 35 Issue (4): 359-367
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