在过去的几十年里, 获得高纯度的光学对映体一直是人们关注的热点问题, 特别是在医药、生物、农业和环境等领域[1]。在数量繁多的对映体分离方法中, 高效液相色谱(HPLC)法因适用性强、操作简便、快速高效等优点占据主导地位。通过人工合成构建的新型手性固定相(CSP)在手性固定相的研究中得到了越来越多的应用[2], 其中, 刷型手性固定相因原料简单易得, 结构修饰简单, 手性分离性能优越, 得到了极大的发展。
氨基酸是一类重要的天然手性源, 通过氨基酸的衍生已经得到了许多分离性能优异的手性选择剂[3-8]。脯氨酸作为一种独特的氨基酸, 已被Pirkle等[9-11]、周华等[12]应用于手性拆分领域。Huang等[13-15]合成了一系列基于脯氨酸二肽和寡肽骨架的手性固定相, 这些固定相比单脯氨酸衍生手性固定相具有更好的手性分离选择性。Wu等[16-18]将脯氨酸衍生物作为手性侧链, 合成了一系列具有类肽结构的手性固定相, 通过不同的结构组合, 获得了手性中心多变、功能基团丰富的具有优良手性选择性的固定相。这些研究表明脯氨酸手性结构的连接方式是影响固定相手性选择性的重要因素。
将分子围绕某一个轴旋转, 如果旋转180°后能够与原化合物重合, 那么就说该化合物具有C2对称性, 而具有C2对称性的手性化合物在手性催化和手性分离等研究领域有重要的应用。在手性催化方面, Kagan等[19]提出:若与中心金属离子络合的手性配体具有C2对称轴, 则反应物从任何一边靠近金属离子, 它所接触的手性环境都是一样的, 正是配体的这种对称性减少了反应的可能途径, 提高了其立体选择性。一些同时含有手性和C2对称元素的化合物已成功地被Jin等[20-22]应用于催化不对称Aldol反应、Michael加成反应等, 获得了高对映体过量值(e. e.值), 而这些手性催化剂同样是强有力的手性选择剂的备选。在手性分离方面, Mikes等[23]以联萘基磷酸(BPA)为手性选择剂合成出第一种C2对称型手性固定相, 用来分离螺旋烃。Feibush等[24-27]合成了几种C2对称型手性固定相, 分别用来分离杂环类、胺和邻位衍生的苯甲酰氨基醇。2016年, Yu等[28]以苯乙醇胺为连接剂, 合成出几种新型的C2和C3对称型手性固定相, 其分离性能相比于常规的直接衍生的固定相有了很大提升。本研究以脯氨酸为手性源, 构建了一类新型的C2对称型的手性固定相, 探讨了此类固定相的分离优势, 并分别考察了手性侧链末端苯环上的取代基团和温度对其分离选择性的影响, 探讨当脯氨酸衍生物的手性单元和对称因素结合起来能否带来分离的提升。
高效液相色谱仪(配有515 HPLC泵、7725i手动进样器、标准1500柱温箱和2489紫外/可见光检测器)、ACQUITY UPLCTM-Quattro Micro MS(ESI+)液相色谱-质谱联用仪、ACQUITY UPLC BEH C8柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)(美国Waters公司); 液相色谱装柱机(大连思谱公司); Bruker AVANCE 500 MHz核磁共振仪(德国Bruker公司); Elementar Vario EL Ⅲ元素分析仪(德国Elementar公司); 不锈钢HPLC空柱管(150 mm×4.6 mm, 德国Max Stevenson公司)。
球形硅胶(粒径5 μm, 孔径10 nm, 比表面积300 m2/g)(日本Fuji Silysia); 丙烯胺盐酸盐(纯度98%)、N, N-二环己基碳二亚胺(DCC, 纯度99%)、巯丙基三乙氧基硅烷均购自上海麦克林生化科技有限公司; L-脯氨酸(纯度99%)、苯胺(纯度99%)、对氯苯胺(纯度99%)、对甲苯胺(纯度99%)、3, 5-二氯苯胺(纯度98%)、3, 5-二甲基苯胺(纯度99%)和氯乙酰氯(纯度98%)购于阿拉丁试剂(上海)有限公司; 色谱级溶剂甲酸(FA)、二乙胺(DEA)、正己烷、乙醇和异丙醇等均购自美国百灵威公司。手性样品(analytical reagent (AR) 1~AR 31) 购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司或根据相关文献(AR 11~AR 19[29], AR 21~AR 25[30])合成, 其结构式如图 1所示, 分为对称型和非对称型两大类。其他试剂均为国产分析纯。
用1, 3, 5-三叔丁基苯测得死时间t0为2.0 min, 检测波长为220 nm, 柱温为20 ℃, 流动相流速为0.8 mL/min, 对映体质量浓度为1 g/L, 进样量为1 μL。
固定相CSP 1~CSP 6的合成路线如图 2所示:以L-脯氨酸为起始原料, 经过氯乙酰化后再与带有不同取代基的苯胺进行酰胺缩合得到3a~3e, 一步反应能分别得到单侧链取代的手性选择器4a和双侧链取代的手性选择器5a~5e, 视投料配比决定主产物收率。手型选择器4a和5a~5e再分别与γ-巯丙基三乙氧基硅烷修饰的硅胶经自由基加成反应得到固定相CSP 1~CSP 6。最后将其置于20 mL甲醇中匀浆, 以甲醇为顶替液在50 MPa下填装于不锈钢柱管(150 mm×4.6 mm)中。
固定相合成过程中各中间体用核磁共振和质谱进行结构表征。
固定相的合成过程中, 一些关键的化合物中间体的核磁数据和质谱(MS-ESI)数据如下所示, 经过对核磁和质谱数据的分析可以确定化合物的结构式, 核磁数据中δ值有交叠的未进行归属(以下数据中各化学位移所对应的H用斜体表示)。
手性选择剂4的1H NMR(400 MHz, CDCl3)(δ值)数据:9.56(s, 1H, CONH), 7.53(dd, J=15.3, 8.0 Hz, 2H, Ph-H), 7.26(dd, J=9.7, 6.1 Hz, 2H, Ph-H), 7.04(t, J=7.4 Hz, 1H, Ph-H), 5.96~5.78(m, 1H, CH2=CHCH2), 5.27~5.01(m, 2H, CH2=CHCH2), 4.79(d, J=7.6 Hz, 1H, CH2CHOC), 3.57~3.47(m, 1H, CHHCH2CH2CH), 3.46~3.33(m, 3H), 3.30(d, J=6.0 Hz, 2H), 2.91(d, J=28.6 Hz, 1H, CH2=CHCHH), 2.25~2.13(m, 2H, CH2CH2CH2CH), 2.07~1.98(m, 1H, CH2CHHCH2CH), 1.91~1.77(m, 1H, CH2CHHCH2CH)。MS-ESI数据:[M+H]+ m/z 287.9。
手型选择剂5a的1H NMR(400 MHz, CDCl3)(δ值)数据:10.38~9.47(m, 2H, CONH), 8.00~7.70(m, 1H, Ph-H), 7.59~7.31(m, 4H, Ph-H), 7.22~7.11(m, 3H, Ph-H), 6.99(dt, J=27.4, 7.5 Hz, 2H, Ph-H), 5.98~5.35(m, 1H, CH2=CHCH2), 5.20~4.92(m, 2H, CH2=CHCH2), 4.82~4.53(m, 2H, 2×CH2CHOC), 3.72~3.54(m, 4H), 3.52~3.33 (m, 6H), 2.17~1.92(m, 8H)。MS-ESI数据:[M+H]+ m/z 517.7。
手性选择剂5b的1H NMR(400 MHz, CDCl3)(δ值)数据:9.60~8.93(m, 2H, CONH), 7.13 (d, J=36.0 Hz, 4H, Ph-H), 6.76~6.51(m, 2H, Ph-H), 6.02~5.61(m, 1H, CH2=CHCH2), 5.22~4.96(m, 2H, CH2=CHCH2), 4.80~4.45(m, 2H, 2×CH2CHOC), 3.65~3.50(m, 6H), 3.40(ddd, J=23.0, 15.1, 8.4 Hz, 4H), 2.34~2.26(m, 2H), 2.20(d, J=12.2 Hz, 12H, 4×CH3), 2.07~1.96(m, 3H), 1.91~1.82(m, 3H)。MS-ESI数据:[M+H]+ m/z 574.3。
手性选择剂5c的1H NMR(400 MHz, CDCl3)(δ值)数据:9.94~9.20(m, 2H, CONH), 7.92~7.32(m, 4H, Ph-H), 7.13~6.85(m, 2H, Ph-H), 6.04~5.68(m, 1H, CH2=CHCH2), 5.30~5.05(m, 2H, CH2=CHCH2), 4.75~4.35(m, 2H, 2×CH2CHOC), 3.75~3.61(m, 3H), 3.59~2.90(m, 7H), 2.59~2.11(m, 3H), 2.07~1.82(m, 5H)。MS-ESI数据:[M+H]+ m/z 656.1。
手性选择剂5d的1H NMR(400 MHz, CDCl3)(δ值)数据:10.36~9.13(m, 2H, CONH), 7.67~7.30(m, 4H, Ph-H), 7.08~6.93(m, 4H, Ph-H), 5.99~5.35(m, 1H, CH2=CHCH2), 5.07(ddd, J=41.2, 25.5, 16.5 Hz, 2H, CH2=CHCH2), 4.78~4.37(m, 2H, 2×CH2CHOC), 3.69~3.51(m, 4H), 3.49~3.36(m, 4H), 3.34~3.12(m, 2H), 2.27~2.17(m, 8H), 2.00~1.80(m, 6H)。MS-ESI数据:[M+H]+ m/z 546.3。
手性选择剂5e的1H NMR(400 MHz, CDCl3)(δ值)数据:10.64~9.18(m, 2H, CONH), 7.82~7.52(m, 1H, Ph-H), 7.39(t, J=11.5 Hz, 3H, Ph-H), 7.19(dd, J=20.8, 7.9 Hz, 4H, Ph-H), 6.02~5.33(m, 1H, CH2=CHCH2), 5.11(ddd, J=31.6, 26.8, 19.0 Hz, 2H, CH2=CHCH2), 4.78~4.39(m, 2H, 2×CH2CHOC), 3.74~3.48(m, 6H), 3.40(ddd, J=37.3, 23.8, 9.9 Hz, 4H), 2.14-1.83(m, 8H)。MS-ESI数据:[M+H]+ m/z 586.2。
手性固定相CSP 1~CSP 6的元素分析结果及键合量在表 1中列出。
C2对称型CSP 2和相对应的单取代的CSP 1的结构如图 2所示, 两个固定相均含有相同的脯氨酸衍生单元。选取31种手性对映体来评价两种固定相, 这些手性对映体的结构式如图 1所示, 分为C2对称型和非对称型两大类。样品的手性色谱拆分结果在表 2列出。
与单取代刷型手性固定相CSP 1相比, C2对称型手性固定相具有更优异的分离性能和适用范围。如图 3所示, C2对称型CSP 2能分离31种手性对映体中的30种, 其中16种能够得到基线分离, 而CSP 1只能拆分其中的11种手性对映体, 仅有4种能够基线分离。
对于所选取的C2对称型手性对映体(AR 1~AR 10), 绝大多数样品在CSP 2上的手性分离因子都要高于CSP 1, 仅有AR 9例外, 表明C2对称型手性固定相分离对称型手性对映体的优势突出。例如, AR 1在CSP 2上的分离因子为1.30, 而其在CSP 1上的分离因子为1.13(见图 4a)。样品中其他非对称型的手性对映体(AR11~AR31) 除了AR 15, 都能在CSP 2上得到很好的拆分, 而CSP 1仅对其中的11个对映体具有拆分能力, 例如AR 27在CSP 2上能够很好分离, 在CSP 1上几乎无选择性(见图 4b)。这些结果表明C2对称型手性固定相无论从能够拆分的手性样品数量还是从手性分离选择性方面上都比单取代的手性固定相更具优势。
造成以上两种固定相分离结果差异的原因可能有两个:(1) 对于C2对称型手性固定相, 手性分子无论从任何一边与固定相表面固载的手性选择剂作用时, 它所接触的手性环境都是一样的, 减少了手性分子与固定相之间的非手性选择作用, 提高了立体选择性; (2)C2对称型手性固定相的两条双取代手性链在与手性分子结合过程中可能存在协同效应, 使能够分离的手性对映体的范围更大, 能够分离的手性对映体的种类更多。
通过改变固定相末端取代基团的类型和数目, 对末端苯环上取代基的电子效应和空间位阻对固定相分离选择性的影响进行考察。CSP 2~CSP 6对31个手性对映体的分离情况见图 3。苯环上无取代基的固定相能够分离的对映体数量是最多的, 不同取代基对固定相手性选择性的影响不同, 有些取代基团的引入能够提高固定相对某一对映体的分离选择性, 例如AR 28在CSP 6上得到了很好的分离(见图 5a), 同样AR 7在CSP 4上的分离也得到了提升, 这可能与其手性固定相手性侧链末端Cl取代苯环较强的诱导效应有关。CSP 3和CSP 4对AR 10几乎没有表现出分离能力, 而该样品在CSP 5和CSP 6上的Rs分别达到1.85和1.36(见图 5b)。考虑到样品分子具有较大的体积, 空间位阻效应可能对分离起了更大的作用。
总之, 手性侧链末端苯环上的取代基团通过影响分析物与固定相之间的氢键作用、π-π作用、偶极-偶极作用、空间位阻作用等改变样品的色谱保留行为, 对于具体的样品结构, 每种作用力参与手形识别过程的贡献度各不相同, 因而带来分离的差异。
许多研究都表明温度对手性分离特性有重要的影响, 本文以手性对映体AR 30为例, 考察不同温度下AR 30在CSP 1和CSP 2上的保留因子(k)和分离因子(α)的变化规律(见图 6a)。
随着温度由30 ℃升至50 ℃, CSP 1对AR 30的k和α均下降, ln α和温度的倒数1/T之间呈线性关系, 如图 6b所示, 而固定相对分析物的k、α与1/T之间的关系满足Van’t Hoff方程, 表明在温度变化过程中CSP 1的手性拆分机理基本保持不变。然而随着温度的上升, C2对称型的CSP 2对AR 30的α呈现出先上升然后下降的趋势, 其ln α和1/T之间呈非线性关系, 严重偏离了Van’t Hoff方程, 说明其分离机理在温度变化过程中可能发生了改变。
与之相似的是张华等[31]、Yao等[32]报道了联萘酚在涂敷型淀粉衍生物手性固定相Lux Amylose-2上分离时, 随着温度的升高对映异构体洗脱顺序反转的现象。其中, 温度效应和溶剂效应对该对映体的分离造成很大影响。结合本研究所观察到的现象, 温度变化过程中, AR 30在固定相CSP 2上的分离同样出现了反常的热力学行为, 可能的原因如下:(1) CSP 2固定相的两条手性链由于空间距离足够接近, 双链之间通过诸如氢键作用、π-π作用、偶极-偶极作用等相互作用形成一定的构象, 随着温度的升高, 构型会发生变化。例如温度升高会削弱链之间氢键的相互作用, 在某个温度下, 形成更有利于与AR 30其中一个手性对映体结合的构象。(2) Jonsson等[33]、Fornstedt等[34]在应用外切葡萄糖苷酶(CBH I)型手性固定相分离普萘洛尔时, 观察到随温度升高α反常增大的现象, 产生这种异常的热力学行为的原因可能是在手性识别过程中, 包裹在由两条手性侧链形成的空穴间溶剂分子的规整度大范围降低。
总之, 这种不寻常的热力学行为表明了C2对称型手性固定相与单链取代的手性固定相有很大的不同, 这种独特的手性分离机理值得进一步探索。
以L-脯氨酸为手性源, 制备了一系列双链取代的C2对称型手性固定相。通过与单链取代的手性固定相进行对比, 无论在手性选择范围还是分离选择性方面, C2对称型的手性固定相都要明显优于单侧链的手性固定相; 文章同时对末端取代基的电子效应和空间位阻作用对固定相的手性选择性的影响进行了考察; 与单链取代的手性固定相相比, C2对称型手性固定相对某些手性对映体的分离因子随温度的变化不遵循Van’t Hoff方程, 随温度的升高表现出先增大后下降的趋势, 对产生该反常的热力学原因进行了探讨。该类固定相的合成方法简便, 易于进行后续的结构修饰, 通过氨基酸的类型或者其他手性链的结构单元进行优化, 具有进一步的拓展空间。
2017,
Vol. 35 Issue (7): 703-711
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