色谱  2017, Vol. 35 Issue (7): 719-723   PDF    
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秦美玲
柴爽爽
马有宁
高欢欢
张涵彤
何巧
基于QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定稻米中嘧草醚和双草醚残留
秦美玲, 柴爽爽, 马有宁, 高欢欢, 张涵彤, 何巧    
中国水稻研究所, 农业部稻米及制品质量监督检验测试中心, 农业部稻米产品质量安全风险评估实验室, 浙江 杭州 310006
收稿日期：2017-02-27
基金项目：国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP2016001001）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2014RG006）
通讯联系人：马有宁, Tel:(0571)63348941, E-mail:11116088@zju.edu.cn
摘要：采用改良的QuEChERS-液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，建立了稻米中嘧草醚和双草醚残留量的检测方法。样品经酸化乙腈提取，由十八烷基键合硅胶（C18）吸附剂净化。以0.1%（体积分数）甲酸水（含5 mmol/L乙酸铵）-乙腈为流动相进行梯度洗脱，经ZORBAX SB C18色谱柱实现目标化合物的基线分离。采用电喷雾正离子（ESI+）模式扫描，动态多反应监测（dynamic MRM）技术定性分析，外标法定量。结果表明：在稻米基质中，嘧草醚和双草醚在各自的线性范围内线性关系良好（r2≥0.996）；嘧草醚和双草醚的检出限（LOD）分别为0.8和3 μg/kg。在3个添加水平下，嘧草醚和双草醚的平均回收率分别为76.6%~85.6%和73.0%~86.7%，相对标准偏差（RSD）分别为0.9%~3.4%和1.2%~5.5%（n=6）。该方法简便、快速、灵敏，适用于稻米中嘧草醚和双草醚的同时分析。
关键词：QuEChERS    液相色谱-串联质谱    嘧草醚    双草醚    稻米    
Determination of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium residues in rice by liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on QuEChERS
QIN Meiling, CHAI Shuangshuang, MA Youning, GAO Huanhuan, ZHANG Hantong, HE Qiao    
Rice Product Quality Inspection and Supervision Center, Ministry of Agriculture, Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Rice, Ministry of Agriculture, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China
Foundation item: National Agricultural Product Quality Safety Risk Assessment Project (No. GJFP2016001001); Central Public Welfare Scientific Research Basic Business Expenses Special Funds for Scientific Research Projects (No. 2014RG006)
Abstract: A method was developed for the determination of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium residues in rice by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) coupled with modified QuEChERS. The samples were extracted with acidified acetonitrile, and then purified by octadecylsilane bonded silica (C18) adsorbents. The analytes were separated on a ZORBAX SB C18 column through a gradient elution using 0.1% (v/v) aqueous formic acid aqueous containing 5 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile as mobile phases. Positive electrospray ionization (ESI+) was used. Qualitative work was performed using selected dynamic multiple reaction monitoring (dynamic MRM) mode. Quantization was performed using external standard method. The results showed good linearities of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium with correlation coefficients (r2) not less than 0.996. The limits of detection (LODs) of the method were 0.8 μg/kg for pyriminobac-methyl, and 3 μg/kg for bispyribac-sodium. The mean spiked recoveries of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium at three spiked levels were 76.6%-85.6% and 73.0%-86.7%, respectively, and the relative standard deviations (RSDs) of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium were 0.9%-3.4% and 1.2%-5.5%, respectively. This method is simple, rapid, sensitive, and suitable for the simultaneous determination of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium in rice.
Key words: QuEChERS     liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)     pyriminobac-methyl     bispyribac-sodium     rice    

我国是世界上最大的稻米生产国之一, 全国三分之二以上人口以稻米为主食[1, 2]。稻田杂草严重影响水稻的产量, 可使水稻减产达56%~70%[3, 4]。嘧草醚和双草醚作为新型的高效除草剂, 对防治水田稗草、疣草有特异的高活性, 且对水稻品种的选择性高达90%以上[5, 6]。嘧草醚和双草醚主要通过抑制乙酰乳酸合成酶的合成, 干扰细胞分裂, 从而杀死杂草[7, 8]。两种除草剂具有高效、广谱、用量极低的特点, 被广泛用于水稻生产, 但其在水稻中的残留对人类健康的危害和环境污染日益成为人们关注的焦点。日本、韩国规定嘧草醚和双草醚在稻米中的最大残留限量分别为0.05和0.1 mg/kg[9], 而我国尚未制定相关限量标准。因此, 建立高效、快速的残留检测方法尤为迫切, 该类方法可为我国限量制定和稻米安全评估提供参考依据。

嘧草醚和双草醚残留的仪器检测方法主要有气相色谱(GC)法[10]、气相色谱-质谱(GC-MS)法[11]、高效液相色谱(HPLC)法[12-15]、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[16-23]。单一的色谱分析法选择性低, 定性和定量能力差, 不符合农药残留检测技术的发展方向。LC-MS/MS灵敏度高, 分离能力好, 是农药残留检测的首选方法。目前, 嘧草醚和双草醚的样品前处理过程步骤繁琐, 吸附剂种类多, 且同时检测稻米中这两种除草剂残留的方法报道较少, 如Sung等[21]使用超声波辅助萃取-分散固相萃取吸附剂乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和石墨化炭黑(GCB)净化的前处理方法; Saha等[18]使用液液萃取和PSA、十八烷基键合硅胶(C18)、GCB 3种分散固相萃取吸附剂净化相结合的样品前处理技术。本实验基于LC-MS/MS技术, 采用酸化乙腈提取, C18分散固相萃取吸附剂净化, 简化了操作步骤, 节约了成本, 为同时测定稻米中嘧草醚和双草醚的残留提供了一种分析方法。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

SL1200快速液相色谱仪配自动进样器、6410B三重四极杆质谱仪附电喷雾离子(ESI)源(美国Agilent公司)、高速分散机(德国IKA公司)、Primo R离心机(美国ThermoFisher公司)、涡旋混合器(德国IKA公司)、分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)、Milli-Q Advangtage A10超纯水系统(美国Millipore公司)。

乙腈(色谱纯, 德国Merck公司)、甲酸(色谱纯, 美国Tedia公司)、乙酸铵(分析纯, 美国Fluka公司)、无水硫酸镁(MgSO4, 分析纯, 美国Sigma-Aldrich公司)、氯化钠(分析纯, 上海试四赫维化工有限公司)、PSA和C18填料(粒径40.0 μm, 美国瓦里安公司)、ZORBAX SB C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, 美国Agilent公司)、嘧草醚(纯度99.0%)和双草醚(纯度99.0%)标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司)。实验用水为Milli-Q高纯水。

1.2 标准溶液的配制

准确称量嘧草醚和双草醚标准品各10.0 mg于10.0 mL容量瓶中, 用乙腈溶解并定容至刻度, 配制成质量浓度为1 000.0 mg/L的标准贮备液, 密封放置于-20 ℃冰箱中保存。用初始流动相溶液将其稀释成相应的标准工作溶液。

1.3 样品前处理过程
1.3.1 样品提取

准确称取稻米粉末样品5.0 g于250 mL聚丙烯塑料离心管中, 加入20.0 mL超纯水, 静置30.0 min, 加入25.0 mL 0.5%(体积分数, 下同)甲酸-乙腈, 置于高速分散机中, 以10 000 r/min的转速匀浆2.0 min, 分别加入10.0 g MgSO4和1.0 g NaCl, 低速(5 000 r/min)匀浆1.0 min后, 以5 000 r/min的转速离心5.0 min。

1.3.2 样品净化

取5.0 mL上清液于15 mL离心管中, 加入1.2 g MgSO4和150 mg C18吸附剂, 涡旋混合器上振荡1.0 min, 以4 000 r/min的转速离心3.0 min, 取上清液, 过0.22 μm有机滤膜, 滤液供LC-MS/MS测定。

1.4 色谱条件

色谱柱:ZORBAX SB C18色谱柱; 进样量:5.0 μL; 柱温:35 ℃; 流动相:A相为0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵), B相为乙腈; 流速:0.3 mL/min。采用梯度洗脱程序:0~2.0 min, 5%B; 2.0~7.0 min, 5%B~90%B; 7.0~10.0 min, 90%B; 10.0~10.1 min, 90%B~5%B; 10.1~15.0 min, 5%B。

1.5 质谱条件

ESI源, 正离子模式; 离子源温度:350.0 ℃; 毛细管电压:4 kV; 碰撞气(氮气)流速:12.0 L/min; 去溶剂温度:250.0 ℃; 雾化器压力:310.0 kPa; 数据采集:动态多反应监测(dynamic MRM); 质谱采集频率:500 ms/cycle。其他参数见表 1。

表 1 嘧草醚和双草醚的质谱分析参数 Table 1 MS parameters of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium
2 结果与讨论
2.1 样品提取体系的选择

嘧草醚和双草醚的化学结构中均含有易水解的官能团, 尤其在碱性条件下更易解离, 从而降低嘧草醚和双草醚在有机相中的溶解度。因此在样品的提取体系中加入少量的酸以抑制嘧草醚和双草醚的解离, 从而提高这两种除草剂在提取溶剂中的溶解度。

本试验以稻米为研究对象, 在10.0 μg/kg嘧草醚和40.0 μg/kg双草醚的加标水平下, 分别考察了在乙腈提取液中添加体积分数为0、0.2%、0.5%、1%、2%和5%的甲酸对嘧草醚和双草醚回收率的影响, 结果见图 1。当乙腈中加入的甲酸体积分数为0.2%时, 两种除草剂的提取回收率无显著提高; 随着加入的甲酸体积分数逐渐增加至0.5%时, 两种化合物的提取回收率分别为90.4%和95.1%, 达到最佳; 而当甲酸的体积分数超过0.5%时, 两种化合物的回收率均大于85.0%。为节约甲酸用量, 选用0.5%甲酸-乙腈作为稻米中嘧草醚和双草醚的前处理提取剂。

图 1 不同提取体系下嘧草醚和双草醚的提取效率(n=3) Fig. 1 Extraction efficiencies of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium by different extraction systems (n=3)
2.2 分散固相萃取吸附剂种类和用量的选择

分散固相萃取技术在QuEChERS方法的净化步骤中因操作简便、准确度高应用广泛, 而PSA和C18是该技术中常用的吸附净化材料。PSA作为阴离子交换吸附剂, 能吸附有机酸和极性杂质, 而C18对非极性化合物吸附性较强, 可去除甾醇类和烯烃类干扰物[24]。因吸附剂的种类和添加量可能会影响方法的回收率[25, 26], 故考察了PSA和C18吸附剂的不同添加量对嘧草醚和双草醚的吸附效果。

将嘧草醚和双草醚用0.5%甲酸-乙腈分别配制成质量浓度为2和8 μg/L的标准溶液, 按照1.3.2节方法处理后, 以不同添加量的C18(0、50、100、150、200 mg)和PSA(0、50、100、150、200 mg)与无水硫酸镁组合, 测定目标化合物的回收率, 结果见图 2。PSA的添加量为0~200 mg时, 嘧草醚的回收率为102.5%~106.8%, 基本无吸附作用; 未加入PSA吸附剂时, 双草醚的回收率为96.5%, 随着PSA加入量的增加, 对双草醚产生较强的吸附, 回收率显著降低。当PSA的添加量增至200 mg时, 双草醚的回收率仅为17.1%, 这与Arias等[19]报道的结果一致, 原因可能是双草醚羧酸根与PSA的氨基反生化学反应, 造成双草醚被吸附[27]。C18的添加量为0~150 mg时, 嘧草醚和双草醚的回收率为82.7%~92.3%, 而当C18的添加量升至200 mg时, 嘧草醚和双草醚的回收率均降低。因此, 本试验最终选择C18为吸附剂, 添加量为150 mg。

图 2 (a)PSA和(b)C18的添加量对嘧草醚和双草醚回收率的影响(n=3) Fig. 2 Influence of (a) primary secondary amine (PSA) and (b) C18 amounts on the recoveries of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium (n=3)
2.3 线性关系、检出限及定量限

配制嘧草醚和双草醚系列质量浓度的标准工作液, 在最优的色谱和质谱条件下进行测定, 采用外标法定量, 以目标物的质量浓度x(μg/L)为横坐标、定量离子的峰面积y为纵坐标进行线性回归。嘧草醚和双草醚分别在0.5~50.0 μg/L和2.0~500.0 μg/L范围内呈现良好的线性关系, 相关系数r2≥0.996。以3倍信噪比(S/N=3) 和10倍信噪比(S/N=10) 分别确定嘧草醚和双草醚的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。线性方程、方法检出限及定量限等见表 2。目前所报道的嘧草醚检出限为6 μg/kg[21], 双草醚的检出限为48[16]和6 μg/kg[18], 而该方法嘧草醚和双草醚的检出限分别为0.8和3 μg/kg, 其检出限显著低于所报道的方法。

表 2 嘧草醚和双草醚的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LODs, LOQs of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium
2.4 加标回收试验

分别称取稻米粉末样品5.0 g于250.0 mL聚丙烯塑料离心管中, 各添加3个水平的嘧草醚(2.5、10.0和50.0 μg/kg)和双草醚(10.0、40.0和200.0 μg/kg)标准溶液, 每个添加水平重复测定6次, 进行加标回收试验。按1.3节步骤进行操作, 结果如表 3所示。嘧草醚和双草醚的平均回收率分别为76.6%~85.6%和73.0%~86.7%;相对标准偏差(RSD)分别为0.9%~3.4%和1.2%~5.5%。

表 3 稻米中嘧草醚和双草醚的加标回收率和相对标准偏差(n=6) Table 3 Spiked recoveries and RSDs of pyriminobac-methyl and bispyribac-sodium in rice (n=6)
2.5 方法的精密度

将中等水平的嘧草醚(10.0 μg/kg)、双草醚(40.0 μg/kg)标准溶液添加到稻米空白样品中, 按1.3节样品前处理步骤进行操作, 所得样品一天内每隔4 h测定一次, 连续测定7天。嘧草醚和双草醚的日内精密度(n=6) 分别为1.3%和3.6%, 日间精密度(n=7) 分别为4.7%和7.2%。

2.6 实际样品的测定

进行实际样品的测定是衡量分析检测方法准确性的保证。按照该方法抽取20份来自10个省份的全国普查稻米样品。其中10份以添加标准样品的方式(嘧草醚和双草醚的加标水平分别为2.5和10 μg/kg)用于过程控制。图 3为加标样品和实际样品的谱图。结果表明, 所测样品均未检出嘧草醚和双草醚残留, 且质量控制样品的测定结果稳定、可靠, 嘧草醚和双草醚的回收率分别为76.6%和73.0%, RSD(n=6) 分别为1.1%和2.0%, 符合农药残留分析的要求。

图 3 (a)加标样品(2.5 μg/kg嘧草醚和10 μg/kg双草醚)和(b)实际样品的LC-MS/MS色谱图 Fig. 3 LC-MS/MS chromatograms of (a) a sample spikedwith 2.5 μg/kg pyriminobac-methyl and 10 μg/kg bispyribac-sodium and (b) a real sample
3 结论

本文用改良的QuEChERS前处理方法结合LC-MS/MS技术, 建立了稻米中嘧草醚和双草醚残留量的检测方法。比较了不同配比的甲酸-乙腈体系对目标物提取回收率的影响, 考察了分散固相萃取吸附剂(PSA和C18)的种类和用量对吸附效果的影响, 优化了前处理的提取及净化过程。该方法操作简单、检出限低、选择性好, 可用于大批稻米样品中嘧草醚和双草醚残留的同时检测。

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