蛋黄浆质中的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)具有乳化、凝胶、抗氧化等特性, 被广泛应用于食品工业、药物运输、细胞培养、精子保存等领域[1-4]。LDL天然的胶束纳米结构可与多糖组成复合纳米凝胶, 从而作为潜在的脂溶性营养素运输媒介。LDL的可生物降解特性在营养运输和药物传送方面有广泛的应用[5]。研究[1, 2, 6]发现, LDL粒径与营养物质吸收、药物递送、食物口感有着密切的关系。蛋黄浆质中LDL的分离和粒径表征对评价其应用性能具有重要的意义。目前, 脂蛋白的分离方法主要有超高速离心法[7]、凝胶过滤色谱法[8]、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法[9]等。这些方法存在操作相对复杂且无法测得脂蛋白的粒径分布等缺点。因此, 需要一种温和、快速、高效的蛋黄浆质脂蛋白分级分析方法。
非对称场流分离(asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4) 是一种基于样品的分子扩散和垂直于主体流动的流场相互作用机理的分离技术, 由于AF4具有载液兼容性好、无需样品前处理、分离速度快、分离范围宽(粒径1 nm~100 μm)、同时可提供粒子的粒径分布等优点[10], 已广泛应用于纳米技术、环境评估、食品科学及纳米医学等领域[11-15]。尽管AF4已广泛应用于生物样品的分离表征, 但是目前应用AF4分析蛋黄浆质的报道较少。本课题组[16]前期研究发现, 非对称场流分离技术对鸡蛋蛋黄中脂蛋白的分离具有潜在的应用能力, 但鸡蛋蛋黄浆质中的成分易与AF4超滤膜产生交联, 对蛋黄浆质中脂蛋白的粒径表征产生影响。本文考察了AF4分析中进样量、交叉流流速、膜的类型对蛋黄浆质中LDL粒径分布的影响, 同时对柴鸡蛋、鹌鹑蛋和鸭蛋蛋黄浆质中的LDL进行了粒径表征。
Eclipse 2 AF4长池道, 池道长度为26.5 cm, 上底和下底长度分别为0.6 cm和2.2 cm(德国Wyatt公司); 岛津LC-20AT液相泵、SPD-20A紫外可见光检测器、AUW120D天平(日本岛津公司); SPLab01微流量注射泵(保定申晨泵业有限公司); D3024小型高速离心机、MS-H550-Pro磁力搅拌器(北京大龙兴创实业有限公司); AVP-7130隔膜真空泵(天津美瑞泰克科技有限公司); Milli-Q Advantage A10超纯水系统(美国Millipore公司)。
马脾铁蛋白(质量浓度≤125 g/mL)、溴酚蓝(BPB, 纯度99%)和咪唑(纯度99%)购自美国Sigma-Aldrich公司; 其他试剂均为国产分析纯。
载液为10 mmol/L咪唑缓冲溶液(含40 mmol/L NaCl、53 mmol/L KCl和5 mmol/L CaCl2):称取3.400 g咪唑、11.700 g NaCl、19.743 g KCl和2.755 g CaCl2, 溶于5 L超纯水, 用1 mol/L的盐酸调节pH值至6.20, 经0.45 μm滤膜过滤后待AF4分析使用。
从保定当地超市购买的新鲜笼养鸡蛋、柴鸡蛋、鹌鹑蛋、鸭蛋经清洗后自然晾干。蛋黄浆质的制备方法参照文献[17]。小心打破蛋壳, 弃掉蛋清, 将蛋黄置于滤纸上, 小心地滚动, 直至除尽卵黄膜表面黏附的蛋清。用消毒后的小刀扎破卵黄膜, 使蛋黄缓缓流入50 mL离心管中。相同方法取4个蛋黄, 混合均匀后取4 mL蛋黄, 加入等体积的载液, 磁力搅拌器上混匀(4 ℃, 400 r/min, 1 h), 然后以10 000 g的转速离心30 min, 取上层清液再次离心(10 000 g, 30 min), 得到上层清液, 即蛋黄浆质。
AF4分离池道(纵切面如图 1所示)主要包括不渗透聚醚板外壳、350 μm厚的梯形垫片、多孔超滤膜(可再生纤维素(RC)膜, 10 kDa)以及不锈钢渗透熔块。多孔超滤膜和不锈钢渗透熔块组成了积累墙, 允许载液和盐自由通过(形成外力场)。样品经进样口B注入AF4池道中, 粒子在外力场作用下向积累墙运动, 同时粒子的布朗运动使其向池道中心扩散。当两种外力达到平衡时, 由于粒径小的颗粒扩散系数大, 形成的样品层的中心位置接近池道中心, 此位置的层流速度较快, 粒径小的粒子先被洗脱出来。当交叉流流速为1.0 mL/min时, 通过已知扩散系数的马脾铁蛋白标样, 测量出实测池道高度为243 μm(RC膜)。基于非对称场流分离理论, 在没有样品交联的情况下, 水力学粒径(dH)和保留时间(tr)具有如下关系[18]:
其中, k为波尔兹曼常数, T为绝对温度, V0为空隙体积, π为圆周率, η为载液黏度, Vc为交叉流流速, w为实测池道厚度, t0为空隙时间。
用载液将上述制备的蛋黄浆质稀释20倍后进样。进样体积为50 μL, 进样时间为53 s, 池道流速恒定为1.0 mL/min、进样流速恒定为0.2 mL/min; 交叉流流速为1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min时, 采用溴酚蓝测得的聚集时间分别为64、62、57、62 s。采样时间到达50 min时, 关闭交叉流。检测波长为280 nm。
根据AF4理论(公式(1)), 样品保留时间与进样量无直接关系。然而当样品进样量过高时会出现“样品过载”现象, 导致样品洗脱峰偏移, 影响样品粒径分布结果的准确性[19]。在AF4分析中, 可以通过改变样品浓度或进样体积来改变样品进样量。以市场上最常见的笼养鸡蛋为模型, 优化分离条件。图 2为笼养鸡蛋蛋黄浆质稀释50、40、20和15倍的AF4-ultraviolet/visible (UV/Vis)谱图, 分析条件为:交叉流流速为1.5 mL/min, 进入检测器流速为1.0 mL/min, 进样体积分别为20、50和100 μL时, 采用溴酚蓝测得的进样时间分别为45、55和61 s, 聚集时间分别为55、60和124 s。紧随空隙峰的洗脱峰(见图 2a)主要是游离的蛋白质, 在保留时间为10 min左右的洗脱峰为LDL[17]。由图 2a可见, 当进样体积由20 μL增加到50 μL时, LDL洗脱峰的UV/Vis信号强度相应增加, 而LDL洗脱峰相应的保留时间没有明显变化。进样体积为20 μL和50 μL时, 当50 min关闭交叉流后, 没有明显的样品峰。结果表明, 当样品稀释50倍, 进样量为20 μL和50 μL时, 没有明显的样品与超滤膜交联和样品过载现象。当进样体积为100 μL时, LDL的洗脱峰明显向右展宽, 同时在50 min关闭交叉流后, 有样品洗脱出来, 说明进样体积100 μL导致了样品过载和样品与超滤膜交联。随着稀释倍数减少(图 2b、2c和2d), 样品进样量增加, LDL洗脱峰的信号强度相应增强。当笼养鸡蛋蛋黄浆质稀释15倍, 进样体积为100 μL时, 发现一个明显的洗脱峰(25 min)。这是由于进样量过大, 在聚集过程中, LDL单体之间接触概率增加, 发生了LDL团聚。综合考虑信号强度和样品交联影响, 选择蛋黄浆质稀释20倍, 进样体积为50 μL的进样组合为最佳进样量。
根据AF4理论, 交叉流流速的增加可以提高样品的分辨率。图 3为不同交叉流流速下的笼养鸡蛋蛋黄浆质中的LDL的AF4-UV/Vis洗脱谱图。分析条件为:稀释倍数为20, 进样体积为50 μL, 池道流速为1.0 mL/min, 进样速度为0.2 mL/min, 进样时间为53 s。Vc为1.0、1.5、2.0和2.5 mL/min时, 聚集时间分别为64、62、57和52 s。结果显示, 当Vc=1.0 mL/min时, 空隙峰与部分蛋白质峰重叠, 并且LDL洗脱峰与蛋白质的洗脱峰也不能完全分开。当Vc=1.5 mL/min时, 蛋白质峰与空隙峰进一步分离。另外, 蛋白质与LDL接近基线分离。当Vc进一步增大到2.0和2.5 mL/min时, LDL洗脱峰出现了明显的展宽现象。这主要是因为随着Vc的增大, 样品更接近超滤表面, 导致LDL与超滤膜相互作用增加, 从而引起LDL洗脱延迟。Vc=2.5 mL/min时, 于50 min关闭交叉流, 洗脱出来的样品峰面积减小。说明在Vc=2.5 mL/min时, LDL与超滤膜发生了不可逆交联。综合考虑LDL与蛋白质的分辨率以及样品与超滤膜的交联, 选择1.5 mL/min为交叉流流速。
不同类型的超滤膜表面具有不同的亲水性质, 因而对于同一生物样品会表现出不同的分离效果。图 4为RC膜(10 kDa)和聚醚砜(PES)膜(10 kDa)对笼养鸡蛋蛋黄浆质中LDL分离的影响。当使用PES膜时, LDL的开始洗脱时间大于使用RC膜时的开始洗脱时间。这主要是由于两种膜的材质不同, 膜的膨胀率不同, 导致实际池道高度不同。PES膜在本试验使用的载液中膨胀率小, 实际池道高度更高, 故LDL开始洗脱出来的时间更长。结果表明使用PES膜时, LDL在100 min时仍然没有完全洗脱出来, 暗示LDL与PES膜发生了强烈的交联。RC膜对LDL的分离效果比PES膜好, 这可能是由于RC膜具有较好的亲水性质[20], 与LDL的相互作用较弱。故选择RC膜为蛋黄浆质AF4分析的超滤膜。
在优化的AF4-UV/Vis分析条件(稀释倍数20倍, 进样体积50 μL, 交叉流流速1.5 mL/min, RC膜)下, 研究了方法的精密度。LDL的洗脱峰高和峰面积的日内精密度分别为1.3%和1.9%(n=7);日间精密度分别为2.4%和2.3%(n=7)。结果表明, 自组装的AF4分离系统对于蛋黄浆质中LDL的分离具有较好的精密度。
在优化的AF4分析条件下, 分析了笼养鸡蛋、柴鸡蛋、鹌鹑蛋和鸭蛋蛋黄浆质中的LDL(见图 5)。可见笼养鸡蛋和柴鸡蛋蛋黄浆质中的LDL保留时间一致, 但柴鸡蛋蛋黄浆质中LDL的洗脱峰面积较笼养鸡蛋蛋黄浆质中LDL的洗脱峰面积大。结果表明, 柴鸡蛋蛋黄浆质中LDL的含量高于笼养鸡蛋蛋黄浆质中LDL的含量。鹌鹑蛋和鸭蛋蛋黄浆质中分离出的LDL的保留时间较鸡蛋蛋黄浆质中LDL的保留时间长。根据AF4理论(公式(1)), 将保留时间转化成水力学粒径并列于图 5顶端x轴。表 1为笼养鸡蛋、柴鸡蛋、鹌鹑蛋和鸭蛋蛋黄浆质中LDL的粒径分布及平均粒径。结果表明, 笼养鸡蛋和柴鸡蛋蛋黄浆质中LDL的粒径分布相似; 鹌鹑蛋和鸭蛋蛋黄浆质中LDL的粒径分布比鸡蛋蛋黄浆质中LDL的粒径分布广, 含有粒径较大的LDL。
在优化的AF4-UV/Vis分析条件下, LDL与超滤膜的交联减小或被抑制, AF4-UV/Vis方法具有较好的精密度。在近似蛋黄的生理条件下, 不仅分离了笼养鸡蛋、柴鸡蛋、鹌鹑蛋和鸭蛋蛋黄浆质中的LDL, 同时研究了LDL的粒径分布。实验结果可为笼养鸡蛋、柴鸡蛋、鹌鹑蛋和鸭蛋蛋黄浆质中LDL在食品、药品、生物制品等领域的应用提供参考。
2017,
Vol. 35 Issue (8): 855-859
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