色谱  2017, Vol. 35 Issue (7): 696-702   PDF    
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孙旭东
张凌怡
张维冰
半胱氨酸基麦芽糖修饰亲水硅胶的制备及其对糖肽的富集
孙旭东, 张凌怡, 张维冰    
上海市功能性材料化学重点实验室, 华东理工大学化学与分子工程学院, 上海 200237
收稿日期：2017-03-03
基金项目：国家自然科学基金项目（21235005）；国家重大科学仪器设备开发专项（2012YQ120044）
通讯联系人：张维冰, Tel:(021)64252145, E-mail:weibingzhang@ecust.edu.cn
摘要：糖蛋白与糖肽在复杂生物体系中丰度一般较低，为了在糖蛋白质组学研究中深入和全面分析鉴定糖基化位点与糖链，通常需要进行富集前处理操作。该文设计并合成了一种半胱氨酸基麦芽糖修饰亲水硅胶分离介质（Cys-Mal@SiO2），将其装填入固相萃取柱中制备新型亲水固相萃取柱。在以人免疫球蛋白G酶解液为样品进行富集鉴定时，Cys-Mal@SiO2鉴定糖肽的质谱信号强度和信噪比比半胱氨酸修饰硅胶（Cys@SiO2）、麦芽糖修饰硅胶（Mal@SiO2）和商品化ZIC®-HILIC更高。在复杂的鼠肝蛋白质提取物的糖蛋白质组学分析中，Cys-Mal@SiO2共鉴定出1551条糖肽，属于466个糖蛋白的906个N-糖基化位点，比Cys@SiO2和Mal@SiO2鉴定糖肽数、蛋白质数和N-糖基化位点数分别多211、67、127个和289、76、193个。将Cys-Mal@SiO2成功应用于低丰度糖肽的选择性富集与鉴定，在糖蛋白质组学研究中体现出良好的应用潜力。
关键词：半胱氨酸    麦芽糖    硅胶    富集    糖肽    鼠肝    
Preparation of cysteine-click maltose modified silica as a hydrophilic interaction liquid chromatography material for the enrichment of glycopeptides
SUN Xudong, ZHANG Lingyi, ZHANG Weibing    
Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, School of Chemistry & Molecular Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21235005), National Key Scientific Instrument and Equipment Development Project (No. 2012YQ120044)
Abstract: Because of the low abundance of glycoprotein and glycopeptide in complex biological samples, it is urgent to develop an efficient method for glycopeptide enrichment in comprehensive and in-depth glycoproteomes research. Herein, a novel hydrophilic silica was developed through surface modification with cysteine-click maltose (Cys-Mal@SiO2). The developed hydrophilic silica was packed into a solid phase extraction (SPE) column, and applied to the highly selective enrichment and identification of N-linked glycopeptides. The Cys-Mal@SiO2 demonstrated better identification capability over Cys@SiO2, Mal@SiO2 and commercial hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) in glycopeptide enrichment due to the synergistic effect of the two kinds of hydrophilic molecules. In the selective enrichment of tryptic digest from human immunoglobulin G, glycopeptides with higher signal-to-noises were detected by Cys-Mal@SiO2. In addition, 1551 unique glycopeptides with 906 N-glycosylation sites from 466 different N-linked glycoproteins were identified from the proteins extracted from mouse liver after the enrichment with Cys-Mal@SiO2. In contrast, the numbers of identified glycopeptides, glycoproteins and N-glycosylation sites identified by Cys@SiO2 were 211, 67, 127 respectively less than by Cys-Mal@SiO2, and the corresponding numbers were 289, 76, 193 by Mal@SiO2. These results showed that the developed Cys-Mal@SiO2 is a promising affinity material for N-glycoproteomics research of real complex biological samples.
Key words: cysteine     maltose     silica     enrichment     glycopeptide     mouse liver    

蛋白质的糖基化修饰是一种最为广泛和重要的翻译后修饰方式之一, 调控着多种生理过程[1, 2]。蛋白质糖基化表达程度差异和糖链结构异常与多种人类重大疾病的发生与发展密切相关。高灵敏度分析和鉴定技术对糖蛋白疾病标志物的筛选和疾病诊断至关重要[3]。然而在复杂生物体系中, 大多数糖蛋白为低丰度蛋白质, 采用质谱仪器直接分析鉴定时易被高含量的非糖蛋白所抑制和干扰。因此需要采取分离富集方法对复杂样品进行样品前处理。

常用的糖蛋白/糖肽富集方法包括凝集素亲和色谱富集法、硼酸亲和色谱富集法、酰肼化学富集法、亲水相互作用色谱(HILIC)富集法[4-7]。HILIC富集法利用糖肽上糖链的多羟基与亲水固定相形成多价氢键作用力进行富集。与其他方法相比, 该方法具有操作简便、富集特异性较高、重复性好、不破坏糖链结构、对不同糖链的糖肽富集无差异等优势, 已发展成为一种重要的样品前处理方法。至今, 多种亲水固定相被用于糖蛋白/糖肽的富集, 包括琼脂糖[8]、壳聚糖[9]、聚乙二醇[10]、两性离子[11, 12]、点击麦芽糖[13-15]、金属有机框架材料[16]等。基于Cu(Ⅰ)催化叠氮-炔基加成反应的点击化学反应被用于制备亲水富集色谱固定相[13-15, 17-21]。其中, 点击两性固定相[17, 18]、点击葡萄糖固定相[19, 20]、点击麦芽糖固定相[13-15, 21]均为强亲水性固定相, 被用于糖蛋白质组学中低丰度糖肽的高选择性富集与鉴定。

为了进一步提高亲水硅胶分离介质对糖肽的富集性能, 本文以半胱氨酸基硅胶为基质, 将麦芽糖修饰在半胱氨酸链上, 制备的新型硅胶分离介质亲水性强, 由于半胱氨酸和麦芽糖都具有较强的亲水性能, 在人免疫球蛋白G酶解液富集和鼠肝提取蛋白的糖蛋白质组学研究中, 半胱氨酸基麦芽糖修饰亲水硅胶对低丰度糖肽富集性能优于半胱氨酸修饰亲水硅胶和麦芽糖修饰亲水硅胶, 在糖蛋白质组学研究中具有良好的应用潜力。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

扫描电子显微镜(SEM, 德国Carl Zeiss AG公司); OCA20水接触角测试仪(德国Dataphysics公司); Setsys 16/18 Setaram热重分析仪(法国Caluire公司); 傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司); 5800基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF MS/MS, 美国AB SCIEX公司); Surveyor液相色谱仪及LTQ-Orbitrap Velos质谱仪(美国Thermo公司)。

人免疫球蛋白G(质量分数95%)、二硫苏糖醇(DTT, 质量分数99%)、碘代乙酰胺(IAA, 质量分数99%)、三氟乙酸(TFA, 质量分数99%)、胰蛋白酶(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理, 10 000 U/mg)、2, 5-二羟基苯甲酸(DHB, 质量分数99%)、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GLYMO, 质量分数98%)购自美国Sigma-Aldrich公司; PNGase F酶(500 000 U/mg)购自美国New England Biolabs公司。甲酸(FA, 质量分数98%)、乙腈(ACN, 色谱纯)、N, N′-二甲基甲酰胺(DMF, 分析纯)购自德国Merk公司; 半胱氨酸购自百灵威科技有限公司; 其他试剂均为分析纯, 购自上海凌峰化学试剂有限公司。实验用水由Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)提供。

硅胶(直径为5 μm, 孔径为10 nm, 比表面积为300 m2/g)购自日本Fuji Silysia公司。C18AQ反相色谱填料(直径为5 μm, 孔径为12 nm)购自日本DAISO Chemical公司。

1.2 固相萃取柱的制备

Cys-Mal (cysteine maltose) @SiO2亲水硅胶的制备流程如图 1所示。称取1 g SiO2置于100 mL甲苯中, 超声分散均匀。加入5 mL GLYMO, 油浴加热至120 ℃, 反应24 h。反应结束后, 抽滤分离, 以乙醇、DMF各清洗3次, 在60 ℃下干燥过夜, 得到GLYMO@SiO2。根据参考文献[22], 将GLYMO@SiO2均匀分散于30 mL DMF中, 加入0.5 g半胱氨酸, 油浴加热至80 ℃, 反应48 h。反应结束后, 抽滤分离, 以DMF、乙醇和水各清洗3次, 在60 ℃下干燥过夜, 得到Cys@SiO2。

图 1 Cys-Mal@SiO2制备流程图 Fig. 1 Procedure of the preparation of Cys-Mal@SiO2 GLYMO: (3-glycidyloxyproply)trimethoxysilane; Cys-Mal: cysteine maltose.

根据文献[21]制备炔丙基麦芽糖。称取400 mg Cys@SiO2, 均匀分散于40 mL甲醇-水(1:1, v/v)中, 加入800 mg炔丙基麦芽糖, 油浴加热至60 ℃, 反应48 h。反应结束后, 抽滤分离, 以乙醇和水各清洗3次, 在60 ℃下干燥过夜, 得到Cys-Mal@SiO2。

作为对照组, 参照文献[14]制备Mal@SiO2。同时以商品化ZIC®-HILIC材料(SiO2基质, 粒径5 μm, 孔径10 nm)作为对照。

称取1 mg Cys-Mal@SiO2分散于水中, 填入底部预先垫有棉花的GELoader tip, 以1 000 r/min的速度离心3 min, 用含体积分数(下同)为92%的ACN和0.1% TFA的水溶液各清洗3次, 待用。

1.3 人免疫球蛋白G酶解和鼠肝样品的制备

鼠肝蛋白质提取过程参照文献[23]进行。分别称取1 mg鼠肝提取蛋白质或人免疫球蛋白G, 溶解于200 μL含8 mol/L尿素和50 mmol/L碳酸氢铵的水溶液(pH=8.3), 加入20 μL 1 mol/L DTT, 水浴37 ℃孵育2 h。加入7.2 mg IAA, 避光放置0.5 h。蛋白质变性后, 用50 mmol/L碳酸氢铵溶液稀释10倍, 按酶与蛋白质的质量比为1:25加入胰蛋白酶, 于37 ℃下酶解18 h。酶解液用Millipore Zip Tips除盐, 冻干, 于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4 Cys-Mal@SiO2固相萃取柱对糖肽的富集

将蛋白质酶解液用上样液(含92% ACN和0.1% TFA的水溶液)进行稀释。加入Cys-Mal@SiO2固相萃取柱中进行富集, 用400 μL上样液清洗3次, 除去非特异性吸附肽段, 加入100 μL洗脱液(含30% ACN和0.1% TFA的水溶液)进行洗脱, 所得洗脱液用PNGase F酶切去糖链或直接用MALDI-TOF MS分析。

1.5 PNGase F酶去糖基化

将糖肽洗脱液冻干, 复溶于200 μL含50 mmol/L碳酸氢铵的水溶液(pH=8.3) 中, 加入10 U PNGase F酶, 37 ℃孵育过夜。酶解结束后, 于水中煮沸10 min, 冻干, 用于LC-MS/MS分析。

1.6 质谱分析

MALDI-TOF MS:脉冲激光波长设定为355 nm; DHB(25 g/L)基质溶解在含70% ACN和1% H3PO4的水溶液中。取0.5 μL洗脱液点在MALDI靶上, 于室温下挥干, 接着滴入0.5 μL DHB基质, 干燥后用MALDI-TOF MS进行分析。

LC-MS/MS:切去糖链的肽段溶解在含0.1% FA的水溶液中, 上样至富集柱(直径75 μm, 长度5 cm, 填充有C18AQ色谱填料)。分离柱为一端尖头、填充有C18AQ色谱填料、长度为15 cm的毛细管柱。流动相经分流系统后流速约为200 nL/min。流动相A为含0.1% FA的水溶液; 流动相B为含0.1% FA的ACN溶液。洗脱梯度为:0~5 min, 2%B~5%B; 5~155 min, 5%B~35%B; 155~160 min, 35%B~90%B; 90%B保持10 min。

采用LTQ-Orbitrap Velos质谱仪的正离子模式进行肽段检测, ESI喷针电压为1.8 kV。碰撞能量为35.0%, 激活时间为10 ms。采用数据依赖模式进行采集, MS扫描范围为300~2 000 Da, 分辨率为6 000, 对其中丰度前20的峰进行二级MS/MS扫描分析。

将LTQ-Orbitrap Velos所得的数据采用Maxquant软件(版本1.3.0.5) 转化为“*.mgf”文件, 再通过Mascot(版本2.3.0) 在数据库(uniport. Mouse. fasta)中进行检索。数据检索参数设置为:选择胰蛋白酶酶切, 允许最多两个漏切位点; 固定修饰设定为半胱氨酸被碘代乙酰烷基化(+57.021 5 Da), 可变修饰为甲硫氨酸氧化(+15.994 9 Da)、天冬氨酸变化(+0.984 0 Da); 母离子的质量容忍偏差为10 ppm(10-6), 碎片离子为0.8 Da; 导出肽段时设置score＞25和P＜0.01控制假阳性率(FDR)＜1%。所得肽段氨基酸序列中含有N#XS/T(N#代表糖基化位点, X是除脯氨酸之外的任一氨基酸)即认为含有N-糖基化位点。

2 结果与讨论
2.1 Cys-Mal@SiO2的制备与表征

Cys-Mal@SiO2的制备过程如图 1所示:硅胶与GLYMO反应得到表面修饰环氧基团的硅胶, 环氧基团与半胱氨酸上的氨基发生开环反应, 得到半胱氨酸修饰的硅胶。接着, 利用半胱氨酸上的巯基与炔基麦芽糖发生巯基-炔点击反应, 得到半胱氨酸基麦芽糖修饰的亲水硅胶。由于半胱氨酸和麦芽糖均具强亲水性, 因此制备硅胶表现出强亲水性。

表面未修饰和表面修饰硅胶的扫描电镜结果分别如图 2a~2c和2d~2f所示。对比可知, 硅胶表面形貌未发生明显变化, 表明表面修饰Cys-Mal未改变硅胶的结构。将合成的亲水硅胶填充至微型固相萃取柱内得到亲水固相萃取柱(见图 2g)。

图 2 (a~c) SiO2、(d~f) Cys-Mal@SiO2的扫描电镜照片和(g)亲水固相萃取柱照片 Fig. 2 Scanning electron microscopy (SEM) images of (a-c) SiO2 and (d-f) Cys-Mal@SiO2, and photographs of the packed hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) solid phase extraction (SPE) tips

水接触角测试仪用于测试制备硅胶的亲水性, 将制备硅胶分别压制成片后, 以纯水为亲润剂进行接触角测试。结果显示, Cys-Mal@SiO2的水接触角仅为7.1°, 说明半胱氨酸基麦芽糖修饰硅胶具有强亲水性。同时, Cys-Mal@SiO2的水接触角数值比Cys@SiO2(13.9°)和Mal@SiO2(16.4°)都小, 表明表面修饰双亲水性分子能进一步提高硅胶的亲水性。

4种制备硅胶的红外光谱图结果见图 3。图 3a中特征峰468、804和1 101 cm-1分别对应Si-O-Si伸缩振动峰、[SiO4]环振动峰和Si-O弯曲振动峰; 特征峰3 452 cm-1属于Si-OH振动峰。图 3b中特征峰2 923和2 852 cm-1分别对应-CH3和-CH2上的C-H伸缩振动峰。特征峰910 cm-1属于环氧基团振动峰, 说明GLYMO成功修饰在硅胶表面。与半胱氨酸反应后, 该特征峰消失(见图 3c), 表明环氧基团完全反应。在图 3c和3d中没有发现明显的羰基特征峰, 可能的原因是半胱氨酸键合量较低。进一步将麦芽糖修饰在硅胶表面, 无其他新的特征峰出现。

图 3 (a)SiO2、(b)GLYMO@SiO2、(c) Cys@SiO2和(d)Cys-Mal@SiO2的傅里叶变换红外光谱图 Fig. 3 Fourier transform infrared (FT-IR) spectra of (a) SiO2, (b) GLYMO@SiO2, (c) Cys@SiO2, and (d) Cys-Mal@SiO2

4种制备硅胶的热失重分析曲线表明:GLYMO@SiO2总失重量为6.53%, Cys@SiO2总失重量为8.66%, 经计算得出半胱氨酸的键合量约占微球质量的2.13%。该键合量较低, 因此在Cys@SiO2红外谱图中没有发现明显的羰基特征峰。Cys-Mal@SiO2总失重量为13.8%, 约有5.14%质量属于键合在微球表面的麦芽糖。

2.2 Cys-Mal@SiO2用于富集鉴定人免疫球蛋白酶解液中的低丰度糖肽

制备的Cys-Mal@SiO2具有强亲水性, 由其填充制备固相萃取柱可用于亲水色谱分离。糖肽N端连接的糖链存在大量亲水性的羟基基团, 与非糖肽相比, 糖肽的亲水性更强。因此, 可利用亲水性硅胶固定相和糖肽间形成稳定的多价氢键作用力, 实现对糖蛋白酶解液中低丰度糖肽的选择性分离富集。以人免疫球蛋白G酶解液为样品, 考察富集材料对低丰度糖肽的富集鉴定能力, 结果见图 4。由于酶解液中存在大量非糖肽, 直接分析时糖肽的质谱信号被严重抑制和掩盖。图 4a中仅能检测出6个质谱信号强度弱和信噪比低的糖肽质谱峰。采用Cys-Mal@SiO2进行富集后, 洗脱液的结果如图 4b所示。图中质谱信号强和信噪比高的质谱峰均属于糖肽, 共鉴定出25条糖肽, 表明Cys-Mal@SiO2可高效和高选择性分离富集低丰度糖肽。同时以Cys@SiO2、Mal@SiO2和商品化ZIC®-HILIC硅胶为对照组, 结果见图 4c~4e, 图中质谱信号强和信噪比高的峰均属于糖肽, 说明Cys@SiO2、Mal@SiO2和商品化ZIC®-HILIC硅胶也可选择性分离富集糖肽。然而, 图 4c~4e中糖肽质谱峰的信号强度和信噪比均低于图 4b。表 1为Cys@SiO2、Mal@SiO2、Cys-Mal@SiO2及商品化ZIC®-HILIC从酶解液中富集鉴定出6个主要糖肽峰的富集倍数。Cys-Mal@SiO2对6个主要糖肽峰的富集倍数是Cys@SiO2、Mal@SiO2和商品化ZIC®-HILIC富集倍数的1.12~2.42倍,该结果表明Cys-Mal@SiO2对低丰度糖肽的富集分离性能高于Cys@SiO2、Mal@SiO2和商品化ZIC®-HILIC。这说明Cys-Mal@SiO2表面键合的半胱氨酸和麦芽糖双亲水分子与亲水性糖肽形成更加稳定的多价氢键作用力, 对糖肽的富集分离效率更高。

图 4 人免疫球蛋白G酶解液(0.5 pmol)的MALDI-TOF MS质谱图 Fig. 4 MALDI-TOF MS spectra of the tryptic digest of human Immunoglobulin G (IgG, 0.5 pmol) a. without enrichment; b. after the enrichment by Cys-Mal@SiO2; c. after the enrichment by Cys@SiO2; d. after the enrichment by Mal@SiO2; e. after the enrichment by commercial ZIC®-HILIC SPE. I1-I25 represent the indentified glycopeptides.

表 1 人免疫球蛋白G酶解液中6个主要糖肽分别经Cys@SiO2、Mal@SiO2、Cys-Mal@SiO2和商品化ZIC®-HILIC SPE富集后的富集倍数 Table 1 Enrichment factors (EFs) of the six maximal glycopeptides from human IgG tryptic digest after the enrichment by Cys@SiO2, Mal@SiO2, Cys-Mal@SiO2 and commercial ZIC®-HILIC SPE

在复杂的生物样品中, 糖肽的丰度非常低。因此, 需要考察富集材料对痕量糖肽的分离富集性能。图 5a~5c分别为30 fmol人免疫球蛋白G酶解液经Cys@SiO2、Mal@SiO2和Cys-Mal@SiO2富集后的结果。6个主要糖肽的信噪比值依次为:Cys-Mal@SiO2好于Cys@SiO2好于Mal@SiO2。说明Cys-Mal@SiO2对30 fmol酶解液的富集性能最佳。Cys@SiO2和Mal@SiO2对糖肽的检出限约为30 fmol。图 5d为Cys-Mal@SiO2对8 fmol酶解液富集后的结果, 图中6个主要糖肽峰的信噪比均大于10, Cys-Mal@SiO2对糖肽的检出限为8 fmol。说明Cys-Mal@SiO2对糖肽具有较高的富集灵敏度。

图 5 人免疫球蛋白G酶解液经富集后的MALDI-TOF MS谱图 Fig. 5 MALDI-TOF MS spectra of human IgG digest after the enrichment Human IgG digest (30 fmol) after the enrichment by (a) Cys@SiO2, (b) Mal@SiO2, (c) Cys-Mal@SiO2 packed SPE column, and (d) human IgG digest (8 fmol) after the enrichment by Cys-Mal@SiO2 packed SPE column.
2.3 Cys-Mal@SiO2用于鼠肝蛋白质提取物中糖蛋白质组学分析

制备的半胱氨酸基麦芽糖修饰硅胶具有强亲水性, 对糖蛋白酶解液中低丰度糖肽具有高富集选择性和高检测灵敏度。因此, 进一步将其用于鼠肝蛋白质提取物中糖蛋白质组学分析。取鼠肝蛋白质提取物进行富集、洗脱、冻干、糖苷酶去糖基化、质谱分析, 重复试验3次, 结果汇总于图 6。Cys-Mal@SiO2共鉴定出1 551条糖肽, 属于466个糖蛋白的906个N-糖基化位点, 富集特异性为56.9%。同时, Cys@SiO2和Mal@SiO2组鉴定到的糖肽数、糖蛋白数和糖基化位点数均低于Cys-Mal@SiO2。该结果再次说明, 在复杂的鼠肝蛋白质提取物糖蛋白质组学分析中, Cys-Mal@SiO2对糖肽的富集性能优于Cys@SiO2和Mal@SiO2。该结果表明Cys-Mal@SiO2可用于高选择性分离富集低丰度糖肽, 实现规模化糖蛋白质组学研究。

图 6 Cys@SiO2, Mal@SiO2和Cys-Mal@SiO2鉴定出的鼠肝蛋白质提取物中糖肽数、糖蛋白数和N-糖基化位点数 Fig. 6 Numbers of identified unique glycopeptides, glycoproteins, N-glycosylation sites by Cys@SiO2, Mal@SiO2 and Cys-Mal@SiO2, from the proteins extracted from mouse liver
3 结论

本文合成了一种半胱氨酸基麦芽糖修饰亲水硅胶固相萃取柱。硅胶表面同时修饰亲水性半胱氨酸和麦芽糖, 其亲水性得到进一步提高。在富集人免疫球蛋白G酶解液和鼠肝提取蛋白质酶解液中低丰度糖肽时, 半胱氨酸基麦芽糖修饰亲水硅胶比半胱氨酸修饰亲水硅胶、麦芽糖修饰亲水硅胶和商品化亲水色谱硅胶对糖肽富集倍数更高, 并且鉴定出的糖蛋白数、糖肽数和糖基化位点数更多。所发展的方法有效地提高了硅胶的亲水性、对糖肽的富集效率和检出限, 并实现了规模化糖蛋白质组学分析。

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