中药作为一个复杂体系, 其分离纯化问题一直是个难点。尽管液相色谱的分离能力随着填料种类的丰富和填料粒径的减小得到了极大提高, 但仍不足以解决中药这种复杂样品的分离难题。二维液相色谱因为在选择性和峰容量方面具有优势, 在中药的分离中起到重要作用。液相色谱的二维分离模式, 如正相/反相二维色谱(2D NPLC/RPLC)[1]、亲水/反相二维色谱(2D HILIC/RPLC)[2]、混合模式/反相二维色谱(2D MEX/RPLC)[3]等, 不仅应用于中药的成分分析中, 还可应用于中药化学成分的制备中。在二维色谱中引入新的分离模式可为中药分离和制备提供进一步的解决方法。
超临界流体色谱(SFC)具有快速、高效、绿色环保的优点，通常采用超临界CO2作为流动相，近几年，其发展及其在天然产物中的应用得到了人们的广泛关注。超高效合相色谱(UPC2)的出现极大地改进了超临界流体色谱仪的各项硬件, 使其在仪器稳定性和灵敏度上有了极大提升, 在中药的分离中也得到了广泛应用[4, 5]。随着超临界流体色谱的不断推广, 其在二维色谱中也得到了广泛的发展和应用。Sarrut等[6]建立了在线全二维RPLC×SFC的分离模式, 用于复杂中性样品的分离, 并与RPLC×RPLC的二维分离模式进行比较, 结果表明, 2D RPLC×SFC具有更好的正交性和更高的峰容量。Li等[7]采用离线2D SFC×UPLC对荜茇中的酰胺类生物碱进行分离, 至少检测到340个色谱峰。综上可知, 反相色谱和超临界流体色谱构建的二维方法具有很好的正交性和较高的峰容量, 可以用于复杂样品的分离。
瓜蒌子为葫芦科植物瓜蒌或双边瓜蒌的干燥成熟种子[8]。现代药理研究表明, 瓜蒌子具有降血脂、抗血栓、增加冠脉流量、抗炎、抗肿瘤和泻下等作用[9, 10]。瓜蒌子的化学成分主要包括脂肪油、三萜及其苷类、甾醇、蛋白质、氨基酸等, 其中油脂含量较高, 约为26%[11]。通常瓜蒌子中挥发油的分析主要采用气相色谱法(GC)[12, 13], 甾醇和三萜的分析采用薄层色谱法(TLC)[14]和高效液相色谱法(HPLC)[15, 16]。实际上, 关于瓜蒌子化学成分的研究相对较少, 除了文献报道的四环三萜和五环三萜类成分, 如10α-葫芦二烯醇、瓜蒌仁二醇、3, 29-二苯甲酰基瓜蒌仁三醇等, 还有大量的化合物没有被认识。因此, 发展有效的分离纯化方法对于更深入地认识瓜蒌子的化学组成至关重要。
本文建立了离线2D RPLC/SFC分离中药瓜蒌子的研究方法。方法综合考虑了制备的影响因素, 优化了SFC的分离条件, 如改性剂对分离和样品溶解的影响。瓜蒌子样品经第一维RPLC制备得到的组分在第二维SFC上分离, 比较组分在RPLC和SFC的分离效果, 评价二维体系的分离选择性。
Waters Alliance高效液相色谱仪, 包括2695四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和2998光电二极管阵列检测器(PDA); Waters Acquity UPC2超临界流体色谱仪, 包括二元溶剂管理系统、自动进样器、柱温箱、自动反压调节器(ABPR)和PDA; Waters自动纯化系统, 包括2545二元梯度泵、2767样品管理器和2489紫外-可见光检测器。
实验用瓜蒌子购自河北安国药材市场; 色谱级甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇和正己烷购自北京百灵威科技有限公司; 分析纯甲醇、乙酸乙酯购自上海泰坦化学有限公司; 分析纯氢氧化钾购自上海天莲化工科技有限公司; 二氧化碳(食品级, 纯度≥99.9%)购自上海振兴盖斯公司。实验用水为娃哈哈纯净水, 使用前过0.22 μm滤膜。
取500 g已粉碎的瓜蒌子, 加入4 L 5.9%(质量分数)氢氧化钾-甲醇溶液, 回流提取3 h, 过滤, 将滤液浓缩至浸膏状, 用500 mL的水溶解后, 加入1 500 mL乙酸乙酯萃取, 将萃取液水洗至中性, 然后浓缩至干, 即得瓜蒌子样品。
色谱柱:Unitary C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 华谱新创科技有限公司); 柱温:25 ℃; 流动相:(A)水和(B)乙腈。梯度洗脱:0~30 min, 35%B~95%B; 30~45 min, 95%B。流速:1 mL/min; 进样量:10 μL; 检测波长:254 nm。用甲醇溶解并配制质量浓度约为25 g/L的瓜蒌子样品溶液。
色谱柱:C18 ME色谱柱(250 mm×10 mm, 10 μm, 华谱新创科技有限公司); 流动相和梯度洗脱程序同RPLC分析条件；流速:5 mL/min; 进样量:100 μL; 检测波长:254 nm。用甲醇溶解并配制质量浓度约为250 g/L的瓜蒌子样品溶液。
色谱柱:XAmide色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm, 华谱新创科技有限公司); 柱温:40 ℃; 流动相:(A)超临界CO2和(B)乙醇-正己烷溶液(3:7, v/v)。梯度洗脱:0~15 min, 5%B~50%B; 15~20 min, 50%B。流速:3 mL/min; 进样量:10 μL; 背压:13.8 MPa; 检测波长:254 nm。用乙醇-正己烷溶液(3:7, v/v)溶解并配制质量浓度约为25 g/L的瓜蒌子样品溶液。
瓜蒌子样品的反相色谱图见图 1, 由分析级色谱图可以看出, 瓜蒌子样品在RPLC上有很好的保留, 但是瓜蒌子样品的组成复杂, 含量差异较大, 某些色谱峰的分离度有限(见图 1a); 由半制备级色谱图可以看出(见图 1b), 放大到制备水平上对瓜蒌子样品进行分离, 总体放大效果较好, 但即使采用了高效分离的手段, 直接制备得到高纯度的化合物也较困难。例如, 保留时间约为6.5 min的两个色谱峰的分离度有限, 随着上样量的增加, 两个色谱峰重叠, 无法得到纯度较高的化合物(组分F1)。在RPLC制备分离时, 按照色谱峰收集, 避免组分之间过度交叉。由图 1b可以看出, 组分F1和F3有明显的肩峰; 组分F6的色谱峰底较宽; 组分F7~F9和F11都有相邻很近的色谱峰; 响应较低的组分F2、F4和F5是富集的微量成分; 组分F10和F12的分离效果较为理想。
采用SFC对瓜蒌子样品进行分析。SFC的主要影响因素包括柱温、背压和改性剂, 本文主要考察了不同改性剂对分离效果的影响，以及放大到制备水平时改性剂对样品的溶解能力对制备上样量的影响。
SFC中常用的醇类溶剂包括甲醇、乙醇和异丙醇。当采用甲醇作为改性剂时, 洗脱能力最强, 瓜蒌子样品在SFC上的色谱峰形最好(见图 2a); 当采用乙醇作为改性剂时, 洗脱能力减弱, 部分瓜蒌子样品色谱峰的分离度变差(见图 2b, 虚线框); 当异丙醇作为改性剂时, 洗脱能力最弱, 瓜蒌子样品色谱峰的分离度也较差(见图 2c, 虚线框)。综上比较, 甲醇作为改性剂时，瓜蒌子样品的分离效果较好, 但是甲醇的洗脱能力较强, 增加上样量时, 部分样品可能会在超临界状态中析出, 导致峰形扭曲、分离度变差。因此考虑在极性强的醇溶剂中加入正己烷, 既可提高改性剂的起始比例, 保证样品在超临界状态下的溶解性, 又使其具有适当的洗脱能力。但甲醇和正己烷不互溶, 因此本文选择乙醇-正己烷溶液(3:7, v/v)，此时瓜蒌子样品色谱峰的分离度较好, 基本达到基线分离(见图 2d)。
将制备得到的组分F1~F12冻干重溶后进行第二维SFC分析。从RPLC和SFC的分离情况来说明二者的分离选择性。组分F1在RPLC中检测到两个没有完全分离的色谱峰(见图 3a), 但在SFC中, 分离度有了明显的改善(见图 3b)。这种分离度的提高不但使化合物的制备成为可能, 而且许多含量较低的物质也被分离出来。例如，组分F10在RPLC的分析中显示为纯度很高的单峰(见图 4a), 但在SFC分离中, 明显地分离出一个峰面积百分比为12.83%的色谱峰, 主峰纯度下降到69.17%(见图 4b)。SFC和RPLC不同的分离选择性可以很好地改善瓜蒌子的分离。
在图 1b中, 组分F4与其他组分相比响应强度较小, 经过第一维反相分离富集后, RPLC分析谱图显示其只有主峰和肩峰(见图 5a)。但在第二维SFC分析时, 有11个色谱峰被分离出来, 其中有9个色谱峰的响应强度较低, 揭示了更多的微量样品信息(见图 5b)。
将组分F1~F12的SFC谱图绘制成三维谱图(见图 6), 可以看出, 色谱峰之间具有很好的离散性, 更加直观地说明了2D RPLC/SFC方法具有较好的正交性。通过对比相邻组分的保留时间, 删除重复数据, 最终可检测到至少150个色谱峰。
本文建立了离线二维反相液相色谱/超临界流体色谱分离制备瓜蒌子样品的方法。该二维方法对于解决结构相似物质的分离、微量成分的富集和分离表现出了明显的优势。此2D RPLC/SFC体系具有很好的正交性, 可为中药瓜蒌子的分离提供新的技术支撑, 也为二维方法的建立提供了新的思路。同时, 此方法可放大至制备级用于瓜蒌子中化合物的制备, 以便更好地开展瓜蒌子的物质基础研究。
2017,
Vol. 35 Issue (7): 683-687
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2017,
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