丹磺酰肼衍生-高效液相色谱-荧光检测法测定包装纸中的甲醛和乙醛


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	龚淑果

	梁勇

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	戴云辉

龚淑果¹, 梁勇², 唐丽云¹, 黄平¹, 戴云辉¹

1. 湖南中烟工业有限责任公司技术研发中心, 湖南长沙 410007;
2. 湘潭大学化学学院, 环境友好化学与应用教育部重点实验室, 湖南湘潭 411105

收稿日期：2017-03-09

基金项目：湖南中烟工业有限责任公司基金项目（KY2017JC0002）

通讯联系人：龚淑果, E-mail:gsg299@163.com

摘要：建立了丹磺酰肼（DNSH）衍生-高效液相色谱-荧光检测测定包装纸中甲醛和乙醛的分析方法，并与2，4-二硝基苯肼（DNPH）衍生法进行了比较。纸张样品经衍生化试剂振荡萃取30 min，衍生化反应24 h，萃取液经PSA/C18净化管净化处理后，以Diamonsil^® C18（2）色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）为固定相，用醋酸水溶液（pH 2.55）-乙腈为流动相进行梯度洗脱。采用荧光检测器检测，激发波长为330 nm，发射波长为484 nm。结果表明，衍生剂、甲醛-DNSH和乙醛-DNSH在20 min内可完全分离，方法的加标回收率为81.64%~106.78%，相对标准偏差（RSD）为2.02%~5.53%（n=5），甲醛和乙醛的检出限分别为19.2 μg/kg和20.7 μg/kg，定量限分别为63.9 μg/kg和69.1 μg/kg。该法操作简单，灵敏度高，比常规方法具有更低的检出限，能很好地应用到实际样品检测中，为低含量醛类化合物的检测提供了一种新思路。

关键词：高效液相色谱-荧光检测衍生化丹磺酰肼甲醛乙醛包装纸

Determination of formaldehyde and acetaldehyde in packaging paper by dansylhydrazine derivatization-high performance liquid chromatography-fluorescence detection

GONG Shuguo¹, LIANG Yong², TANG Liyun¹, HUANG Ping¹, DAI Yunhui¹

1. Technology Research & Development Center, Hunan Branch of China Tobacco Industrial Corporation, Changsha 410007, China;
2. College of Chemistry, Xiangtan University, Key Laboratory of Environment Friendly Chemistry and Application of Ministry of Education, Xiangtan 411105, China

Foundation item: Project of Hunan Branch of China Tobacco Industrial Corporation (No. KY2017JC0002)

Abstract: A high performance liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD) method was developed for the simultaneous determination of formaldehyde and acetaldehyde in packaging paper by dansylhydrazine (DNSH) derivatization. The samples were extracted by derivatization reagent for 30 min, and derived for 24 h. After purifying treatment with a PSA/C18 cartridge, a Diamonsil^® C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) was used as stationary phase for separation, the mixtures of acetic acid aqueous solution (pH 2.55)-acetonitrile were used as mobile phases by gradient elution, and the excitation and emission wavelengths were 330 nm and 484 nm, respectively. The results showed that the recoveries of formaldehyde and acetaldehyde spiked in the samples were 81.64%-106.78%, and the relative standard deviations (RSDs) were 2.02%-5.53% (n=5). The limits of detection of formaldehyde and acetaldehyde were 19.2 μg/kg and 20.7 μg/kg, respectively. The limits of quantification of formaldehyde and acetaldehyde were 63.9 μg/kg and 69.1 μg/kg, respectively. The method is simple, sensitive and reproducible. It provides a basic approach for the determination of trace formaldehyde and acetaldehyde.

Key words: high performance liquid chromatography-fluorescence detection (HPLC-FLD) derivatization dansylhydrazine (DNSH) formaldehyde acetaldehyde packaging paper

醛类化合物是自然界中广泛存在的有机化合物, 因其能引起肝脏疾病, 对人体呼吸系统有较强的刺激作用, 存在一系列的致癌致畸风险而受到广泛关注。研究表明, 甲醛能与体内的蛋白质分子反应进而破坏其功能^[1], 长期暴露在甲醛环境中会引起不良的生殖和发育效应^[2], 甲醛还具有致敏性质、刺激作用和潜在的致癌风险^[3], 国际癌症研究机构(IARC)已经将甲醛归于可疑致癌物类, 并对其进行长期的流行病学和癌症风险评估^[4]。乙醛能引起人体DNA的损伤, 并促进肝脏疾病的形成^[5]。

包装纸受原料、助剂、添加剂或印刷油墨中溶剂残留的影响^[6]，其中的甲醛和乙醛会残留在包装纸产品中。包装纸在不同的使用条件下，甲醛和乙醛会通过身体接触、口腔唾液接触、肺部吸入等方式迁移到人体内，对人体的健康造成一定的影响^[6]。因此对包装纸中甲醛和乙醛的检测是十分必要的。

目前, 与甲醛和乙醛相关的检测方法有气相色谱法^[7]、气相色谱-质谱联用法^[8]、固相微萃取-气相色谱-质谱联用法^[9]、高效液相色谱法^[10-12]、离子色谱法^[13]等, 其中高效液相色谱法因其简便快速、操作简单、应用范围广的优点而被广泛应用。方法多采用2, 4-二硝基苯肼(DNPH)衍生, 利用高效液相色谱仪结合紫外检测器进行检测分析。

众所周知, 相比紫外检测法, 荧光检测法(FLD)具有更高的灵敏度和更低的检出限, 但被分析物必须具有荧光特性。由文献^[14]可知, 能与甲醛和乙醛发生衍生化反应的丹磺酰肼(DNSH)本身具有荧光特性, 衍生化反应后荧光基团仍然存在, 丹磺酰肼与甲醛和乙醛发生衍生化的反应方程式^[15]见图 1。本文利用此反应原理, 采用液相色谱-荧光检测建立了包装纸中低含量甲醛和乙醛的检测方法, 与DNPH衍生-液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)^[16]相比, 本方法的检出限和定量限更低, 适于低含量样品中甲醛和乙醛的检测分析。

图 1 DNSH与甲醛或乙醛衍生化的反应方程式 Fig. 1 Reaction equation of derivatization of dansylhydrazine (DNSH) with formaldehyde or acetaldehyde Formaldehyde: R₁, H; R₂, H. Acetaldehyde: R₁, H; R₂, CH₃.

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters e2695高效液相色谱仪, 配备自动进样器、四元泵、柱温箱和2475荧光检测器(美国Waters公司); BSA224S-CW分析天平(德国Sartorius公司); HY-6双层调速振荡仪(国华电器有限公司); TGL-16M台式离心机(湘仪离心机仪器有限公司); Milli-Q50超纯水仪(美国Millipore公司); Diamonsil^® C18(2) 色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)、PSA/C18净化管(2 mL, 150 mg硫酸镁, 50 mg PSA/50 mg C18)(美国Dikma公司); FE20实验室pH计(METTLER TOLEDO上海公司)。

实验样品为公司生产所需的烟用包装纸(以下简称包装纸); 丹磺酰肼(色谱纯, 纯度≥95%, 上海阿拉丁公司); 甲醛标准品(1 g/L, 美国AccuStandard公司); 乙醛标准品(1 g/L, 上海安谱实验科技股份有限公司); 乙腈(色谱纯, 美国Merck公司); 冰醋酸(分析纯, 纯度≥99.5%, 天津光复公司); 磷酸(分析纯, 纯度≥85%, 上海沪试公司); 高氯酸(分析纯, 纯度70.0%~72.0%, 天津政成公司)。实验用水符合GB/T 6682-2008一级水标准。

1.2 标准溶液的配制

衍生化试剂:准确称取0.5 g DNSH于1 000 mL棕色容量瓶中, 加入乙腈溶解, 用冰醋酸调节pH至2.20, 振荡混匀, 待DNSH完全溶解后用乙腈定容至刻度。衍生化试剂中DNSH的质量浓度为500 mg/L。

标准储备液：准确移取甲醛、乙醛标准品各20 μL, 置于10 mL棕色容量瓶中, 加入衍生化试剂5 mL, 振荡混匀后, 静置衍生24 h, 用衍生化试剂定容至刻度, 配制甲醛-DNSH和乙醛-DNSH的质量浓度均为2 mg/L的一级混合标准储备液；准确移取5.00 mL一级混合标准储备液于10 mL棕色容量瓶中, 用衍生化试剂定容至刻度, 作为二级混合标准储备液。

标准工作液：分别准确移取0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00 mL的二级混合标准储备液, 置于10 mL棕色容量瓶中, 用衍生化试剂定容至刻度, 配制质量浓度分别为10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、400.00 μg/L的混合标准工作液。

1.3 样品前处理

提取:称取0.8 g包装纸样品, 剪碎后置于50 mL具塞锥形瓶中, 加入15 mL衍生化试剂, 振荡萃取30 min。

衍生:移取约8 mL萃取液, 置于10 mL离心管中, 以5 000 r/min离心10 min, 移取5 mL上层溶液, 置于具塞三角瓶中, 静置24 h。

净化:移取1.5 mL衍生液, 置于2 mL PSA/C18净化管中, 在涡旋振荡器上以500 r/min振荡5 min, 再以5 000 r/min离心10 min, 取上清液进行HPLC分析。

1.4 液相色谱条件

色谱柱:Diamonsil^® C18(2) 色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm); 柱温:30 ℃; 流动相A:醋酸水溶液(pH 2.55);流动相B:乙腈。梯度洗脱程序:0~12.0 min, 45%B; 12.0~15.0 min, 45%B~60%B; 15.0~20.0 min, 60%B~90%B; 20.0~21.0 min, 90%B~45%B; 21.0~25.0 min, 45%B。流速:0.5 mL/min; 进样量:10 μL；检测器:2475荧光检测器; 激发波长(λ_ex): 330 nm; 发射波长(λ_em): 484 nm。方法采用保留时间定性, 外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 衍生物的定性

由于市面上暂无甲醛-DNSH和乙醛-DNSH标准品, 为了确保衍生物色谱峰定性的准确性, 实验利用液相色谱-串联质谱仪对混合标准储备液进行分析, 然后比较质谱扫描中衍生产物母离子的相对分子质量, 最后确认所得的衍生物为甲醛-DNSH和乙醛-DNSH。

2.2 衍生化反应用酸的选择

由DNSH与甲醛和乙醛的衍生化反应原理得知, 反应过程在酸性条件下进行, 不同种类的酸对衍生化反应的影响不尽相同。实验考察了不同酸(冰醋酸、磷酸、高氯酸)环境对衍生化反应的影响(见图 2)。可以看出, 采用高氯酸时目标物的色谱图基线不稳定且峰形较差; 采用磷酸和冰醋酸时目标物的色谱图基线平稳且衍生产物具有较好的峰形, 但同一样品中, 采用磷酸时衍生产物的响应值比采用冰醋酸时衍生产物的响应值低。因此本实验选择冰醋酸作为衍生化反应用酸。

图 2 目标物在不同衍生化反应用酸条件下的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the target compounds under different derivatization acids 1. formaldehyde-DNSH; 2. acetaldehyde-DNSH.

2.3 衍生化试剂pH值的选择

衍生化试剂的pH值会影响衍生化反应的速度及目标衍生物的含量, 是衍生化反应过程中的重要因素。本实验考察了不同pH值的衍生化试剂对同一样品衍生化反应的影响(见图 3)。可以看出, 随着衍生化试剂pH值的减小, 衍生产物的响应值增加, 峰面积也随之增加, 且考虑到色谱柱的pH耐受范围为1.50~9.00, 因此本实验将衍生化试剂的pH值设为2.20。

图 3 采用不同pH值的衍生化试剂时目标物的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of the target compounds with different pH values of derivatization reagents 1. formaldehyde-DNSH; 2. acetaldehyde-DNSH.

2.4 衍生化时间的选择

衍生化时间也是影响衍生化反应程度的重要因素。本实验考察了不同的衍生化时间对目标衍生物峰面积的影响(见图 4)。可以看出, 甲醛-DNSH和乙醛-DNSH的峰面积随着衍生时间的增加而增大, 在衍生5 h后, 二者的峰面积基本趋于平稳。同时实验还发现, 甲醛和乙醛标准品在衍生化反应5 h时所得标准曲线的线性关系较差, 而衍生化反应24 h时所得标准曲线的线性关系良好, 相关系数大于0.999。因此本实验将衍生化反应时间设为24 h。

图 4 衍生化时间对目标物峰面积的影响 Fig. 4 Influence of derivatization times on the peak areas of the target compounds

2.5 振荡萃取时间的选择

振荡时间直接影响甲醛和乙醛的萃取效率, 本实验对同一样品进行分析, 考察了不同振荡萃取时间对目标衍生物峰面积的影响(见图 5)。可以看出, 振荡萃取时间为30 min时, 甲醛-DNSH和乙醛-DNSH的峰面积达到最大值。因此本实验将振荡萃取时间设为30 min。

图 5 振荡萃取时间对目标物峰面积的影响 Fig. 5 Influence of oscillation extraction times on the peak areas of the target compounds

2.6 流动相pH值的选择

实验发现, 采用醋酸水溶液-乙腈流动相体系时目标衍生物的峰形、响应值以及分离情况均好于采用水-乙腈流动相体系。考察了不同pH值(3.08、2.77、2.55、2.46和2.39) 的流动相对衍生物色谱峰拖尾因子(T)的影响(见图 6)。T是用以衡量色谱峰对称性的指标, 《中国药典》规定，T应为0.95~1.05, T＜0.95为前延峰, T＞1.05为拖尾峰。由图 6可以看出, 随着pH值的减小, 甲醛-DNSH和乙醛-DNSH色谱峰的前延情况有所改善；当pH值小于2.55时, 甲醛-DNSH和乙醛-DNSH色谱峰的T值均在0.95~1.05范围内, 满足实验要求，但考虑到pH值过低会对色谱柱造成影响，综合考虑, 将流动相的pH值设为2.55。

图 6 流动相pH值对色谱峰拖尾因子的影响 Fig. 6 Influence of the pH values of mobile phases on the tailing factors (T) of chromatographic peaks

2.7 标准曲线、检出限和定量限

将一系列的标准溶液进行液相色谱分析后, 以甲醛和乙醛的峰面积为纵坐标(y)、对应的质量浓度为横坐标(x, μg/L)绘制标准曲线, 采用外标法定量。实验结果表明, 甲醛和乙醛在10.0~400.0 μg/L的范围内线性关系良好, 相关系数均大于0.999, 线性回归方程分别为y=9.14×10²x+6.75×10³和y=6.69×10²x+1.65×10³。按3倍和10倍空白样品11次测定值的标准偏差计算甲醛和乙醛的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 结果表明, 甲醛和乙醛的检出限分别为19.2 μg/kg和20.7 μg/kg, 定量限分别为63.9 μg/kg和69.1 μg/kg。

2.8 加标回收率和精密度

称取0.8 g某包装纸样品, 根据样品中甲醛和乙醛的实际含量, 添加低、中、高3个水平的甲醛(125.1、249.9、375.0 μg/kg)和乙醛(562.5、1 125.0、1 687.5 μg/kg)标准品, 按实验方法进行样品加标回收率试验, 结果见表 1。可以看出, 甲醛和乙醛的加标回收率为81.64%~106.78%, 相对标准偏差(RSD)小于5.53%(n=5)。说明方法具有良好的准确度和精密度, 能够满足定量分析的要求。

表 1 甲醛和乙醛的加标回收率和相对标准偏差(n=5) Table 1 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of formaldehyde and acetaldehyde in spiked samples (n=5)

2.9 实际样品检测

取5种不同的包装纸样品, 按实验方法对甲醛和乙醛的含量进行检测, 结果见表 2。可以看出, 各样品中均检测出甲醛和乙醛, 并且乙醛的含量均高于甲醛。其中某一实际样品的色谱图见图 7。

表 2 包装纸样品中甲醛和乙醛的含量 Table 2 Contents of formaldehyde and acetaldehyde in packaging paper samples

图 7 (a)标准样品和(b)实际样品中甲醛-DNSH和乙醛-DNSH的色谱图 Fig. 7 Chromatograms of formaldehyde-DNSH and acetaldehyde-DNSH in (a) a standard sample and (b) an actual sample 1. formaldehyde-DNSH; 2. acetaldehyde-DNSH.

2.10 与常规方法的比较

将本方法与溶剂萃取-DNPH衍生-HPLC-DAD法^[17]进行比较(见表 3)。从实验数据可以看出, 与常规方法相比, 本方法具有更低的检出限和定量限, 并能检测出样品中低含量的甲醛和乙醛。

表 3 本方法与常规方法的比较 Table 3 Comparison of this method with conventional methods

3 结论

本方法采用丹磺酰肼衍生-高效液相色谱-荧光检测法同时测定包装纸中的甲醛和乙醛, 并与常规检测方法进行了比较。本方法简单, 灵敏度高, 比常规方法具有更低的检出限, 为低含量醛类化合物的检测提供了一种新方法, 对于包装纸安全性指标的控制有重要意义。

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